一种生物酶法合成5’-胞苷酸的方法与流程

一种生物酶法合成5
’‑
胞苷酸的方法
技术领域
1.本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种5
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胞苷酸的酶催化合成工艺。


背景技术：

[0002]5’‑
胞苷酸(简称胞苷酸)，分子式为c9h
12
n3o8p，分子量321.1817，英文名5
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cytidylate monophosphate，cas登记号63-37-6，是生物细胞内重要生化物质，参与多种生理生化反应。工业上，5
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胞苷酸用作于生产核苷酸类药物的原料、中间体以及食品添加剂等，如用于合成胞苷三磷酸、阿糖胞苷酸、聚肌胞苷酸、胞磷胆碱以及与其他核苷酸混合后作为保健品和食品添加剂，亦可加于婴儿奶粉中，能显著提高婴幼儿的免疫力。
[0003]5’‑
胞苷酸目前主要有两种生产方式：一种是生物合成法，另一种是化学合成法。
[0004]
生物合成法利用核酸水解酶水解核糖核酸，经过分离得到5
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胞苷酸，参考：华洵璐等，核酸水解酶及酶解法生产核苷酸研究进展，辽宁大学学报，2012，39(2)，110-117)。生物合成法得到四种5
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核苷酸，即5
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腺苷酸、5
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鸟苷酸、5
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胞苷酸和5
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尿苷酸混合物，除了5
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胞苷酸以外，其它三种均为副产物，在工业生产中分离操作复杂且收率低。
[0005]
化学合成法通过磷酸化胞苷从而得到胞苷酸，参考：cn 1086219a。化学合成法生产过程中的三废较多、企业环保压力较大，腐蚀设备且不利于人员身体健康及工业化生产，存在一定的安全隐患。


技术实现要素：

[0006]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种生物酶法合成5
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胞苷酸的方法。该方法以胞苷、乙酰磷酸钾盐为原料，在尿苷-胞苷激酶和多聚磷酸盐激酶共同催化下反应得到5
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胞苷酸。该工艺所需原料来源广泛，价格便宜，反应步骤简单，产量高且反应过程温和。
[0007]
本发明所述一种生物酶法合成5
’‑
胞苷酸的方法，包括如下步骤：以胞苷、乙酰磷酸钾盐和atp为原料，采用尿苷-胞苷激酶和多聚磷酸盐激酶共同作用下进行生物转化，得到5
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胞苷酸。
[0008]
采用反应方程式表示为：
[0009][0010]
进一步地，在上述技术方案中，所述反应温度为25-35℃，反应采用ph＝6.0-8.0条件下进行。
[0011]
进一步地，在上述技术方案中，所述反应在mg
2+
存在条件下进行。
[0012]
进一步地，在上述技术方案中，所述胞苷浓度为300-500mm，所述乙酰磷酸钾盐浓度为600-1000mm，所述atp的浓度为15-25mm。
[0013]
进一步地，在上述技术方案中，所述乙酰磷酸钾盐为液体型试剂。
[0014]
进一步地，在上述技术方案中，所述尿苷-胞苷激酶的序列为序列表中，seq id no.1所示的核苷酸序列。
[0015]
进一步地，在上述技术方案中，所述多聚磷酸激酶的序列为序列表中，seq id no.2所示的核苷酸序列。
[0016]
进一步地，在上述技术方案中，所述尿苷-胞苷激酶和多聚磷酸盐激酶形式包括但不局限于酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及各种固定化酶和固定化酶细胞。例如也可以是未经纯化的粗酶形式、经部分纯化或完全纯化的形式。
[0017]
本发明有益效果
[0018]
本发明采用生物酶法合成胞苷酸的方法，与目前现有的以多聚磷酸盐作为磷酸供体的技术不同，本发明以价格更为低廉的乙酰磷酸钾盐为磷酸供体，极大的降低了生产成本。
[0019]
a、本发明生物酶法合成胞苷酸的方法，反应步骤简单，对环境更为友好。
[0020]
b、本发明生物酶法合成胞苷酸的方法，所需酶的用量极少便可使反应的转化率达到88％。
[0021]
c、本发明生物酶法合成胞苷酸的方法，产品5
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胞苷酸的浓度可达到115g/l。
[0022]
说明书附图
[0023]
图1为实施例3中反应温度优化图；
[0024]
图2为实施例4中ph值优化图；
[0025]
图3为实施例5中反应液液相色谱检测图。
具体实施方式
[0026]
实施例1尿苷-胞苷激酶的发酵培养，具体如下：
[0027]
发酵培养基配方：葡萄糖30g/l，七水硫酸镁0.3g/l，磷酸二氢钾3g/l，磷酸氢二钠4.8g/l，氯化铵1g/l，酵母膏20g/l，蛋白胨15g/l。
[0028]
将尿苷-胞苷激酶菌株的单菌落接种到lb液体培养基，在35℃下震荡培养10-12h，以5％接种量转接至lb培养基中，在35℃下震荡培养至od
600
值达到0.6时，接种至发酵培养基。发酵培养至od
600
值达到16时加入iptg诱导培养8h，然后离心得尿苷-胞苷激酶菌体细胞235g。
[0029]
实施例2多聚磷酸激酶的发酵培养，具体如下：
[0030]
发酵培养基配方：葡萄糖30g/l，七水硫酸镁0.3g/l，磷酸二氢钾3g/l，磷酸氢二钠4.8g/l，氯化铵1g/l，酵母膏20g/l，蛋白胨15g/l。
[0031]
将多聚磷酸激酶菌株的单菌落接种到lb液体培养基，在35℃下震荡培养10-12h，以5％接种量转接至lb培养基中，在35℃下震荡培养至od
600
值达到0.6时，接种到发酵罐。发酵培养至od
600
值达到16时加入iptg(0.12g/l)诱导培养8h，然后离心得多聚磷酸激酶菌体细胞255g。
[0032]
实施例3温度优化反应，具体如下：
[0033]
反应体系及反应条件：反应体系包括410mm胞苷，450mm乙酰磷酸钾盐溶液，10mmatp，27mm mg
2+
，20g/l尿苷-胞苷激酶，20g/l多聚磷酸盐激酶，加适量纯化水，采用naoh调ph＝7.0-7.2，之后纯化水定容至30ml，分别在10℃，20℃，30℃，40℃，50℃水浴锅中反应7h，反应过程中取样进行高效液相色谱hplc检测，监控反应进程。根据高效液相色谱结果分析，30℃为最佳反应条件，显著高于其它温度水平，如图1结果所示。在30℃反应温度下，反应进行至7h时，产物胞苷酸生成量达到67.5g/l。
[0034]
实施例4ph优化反应，具体如下：
[0035]
反应体系及反应条件：反应体系包括410mm胞苷，450mm乙酰磷酸钾盐溶液，10mmatp，27mm mg
2+
，20g/l尿苷-胞苷激酶，20g/l多聚磷酸盐激酶，加适量纯化水，采用naoh调ph＝5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，之后纯化水定容至30ml，分别在30℃水浴锅中反应7h，反应过程中取样进行高效液相色谱hplc检测，监控反应进程。根据高效液相色谱结果分析，反应初始ph＝6.0-8.0范围内反应效果均可，如图2结果所示，反应进行至7h时，产物胞苷酸的生成量达到72.7g/l。
[0036]
实施例5酶法合成5
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胞苷酸的方法
[0037]
反应体系及反应条件：反应体系包括410mm胞苷，10mm atp，27mm mg
2+
，尿苷-胞苷激酶和多聚磷酸盐激酶分别以40g/l和30g/l，810mm乙酰磷酸钾盐溶液进行反应，加适量纯化水，用naoh调ph＝7.2，之后用纯化水定容至2l，分别在30℃水浴锅中反应9h，反应过程中取样进行高效液相色谱hplc检测，监控反应进程。根据高效液相色谱结果分析，如图3结果所示，反应进行至8h时，产物胞苷酸的转化率达到87.6％，产物浓度达到112.5g/l。
[0038]
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书的描述只是用来解释本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
[0039]
序列表
[0040]
seq id no.1
[0041]
atgactgatcagtctcatcagtgcgtcattatcggtatcgctggcgcatcggcttccggcaagagtcttattgccagtaccctttatcgtgaattgcgtgagcaagtcggtgatgaacacatcggcgtaattcccgaagactgctattacaaagatcaaagccatctgtcgatggaagaacgcgttaagaccaactacgaccatcccagcgcgatggatcacagtctgctgcttgagcatttacaagcgttgaaacgcggctcggcaattgacctgccggtttacagctatgttgaacatacgcgtatgaaagaaacggtgacggttgagccgaagaaggtcatcattctcgaaggcattttgttgctgacggatgcgcgtttgcgtgacgaacttaacttctccattttcgttgataccccgctggatatctgcctgatgcgccgcatcaagcgtgacgttaacgagcgtgggcgttcaatggattcagtgatggcgcaatatcaaaaaaccgtgcgcccgatgttcctgcaattcattgagccttctaaacaatatgcggacattatcgtgccgcgcggcgggaaaaaccgcatcgcgatcgatatattgaaagcgaaaataagtcagttctttgaataa
[0042]
seq id no.2
[0043]
atgggtcaggaaaagctatacatcgaaaaagagctcagttggttatcgttcaatgaacgcgtgcttcaggaagcggcggacaaatctaacccgctgattgaaaggatgcgtttcctggggatctattccaataaccttgatgagttctataaagtccgcttcgctgaactgaagcgacgcatcattattagcgaagaacaaggctccaactctcattcccgcc
atttactgggcaaaattcagtcccgggtgctgaaagccgatcaggaattcgacggcctctacaacgagctattgctggagatggcgcgcaaccagatcttcctgattaatgaacgccagctctccgtcaatcaacaaaactggctgcgtcattattttaagcagtatctgcgtcagcacattacgccgattttaatcaatcctgacactgacttagtgcagttcctgaaagatgattacacctatctggcggtggaaattatccgtggcgataccatccgttacgcgctgctggagatcccatcagataaagtgccgcgctttgtgaatttaccgccagaagcgccgcgtcgacgcaagccgatgattcttctggataacattctgcgttactgccttgatgatattttcaaaggcttctttgattatgacgcgctgaatgcctattcaatgaagatgacccgcgatgccgaatacgatttagtgcatgagatggaagccagcctgatggagttgatgtcttccagtctcaagcagcgtttaactgctgagccggtgcgttttgtttatcagcgcgatatgcccaatgcgctggttgaagtgttacgcgaaaaactgactatttcccgctacgactccatcgtccccggcggtcgttatcataattttaaagactttattaatttccccaatgtcggcaaagccaatctggtgaacaaaccactgccgcgtttacgccatatttggtttgataaagcccagttccgcaatggttttgatgccattcgcgaacgcgatgtgttgctctattatccttatcacacctttgagcatgtgctggaactgctgcgtcaggcttcgttcgacccgagcgtactggcgattaaaattaacatttaccgcgtggcgaaagattcacgcatcatcgactcgatgatccacgccgcacataacggtaagaaagtcaccgtggtggttgagttacaggcgcgtttcgacgaagaagccaacattcactgggcgaagcgcctgaccgaagcaggcgtgcacgttatcttctctgcgccggggctgaaaattcacgccaaactgttcctgatttcacgtaaagaaaacggtgaagtggtgcgttatgcacacatcgggaccgggaactttaacgaaaaaaccgcgcgtctttatactgactattcgttgctgaccgccgatgcgcgcatcaccaacgaagtacggcgggtatttaactttattgaaaacccataccgtccggtgacatttgattatttaatggtatcgccgcaaaactcccgccgcctattgtatgaaatggtggaccgcgagatcgccaacgcgcagcaagggctgcccagtggtatcaccctgaagctaaataaccttgtcgataaaggcctggttgatcgtctgtatgcggcctccagctccggcgtaccggttaatctgctggttcgcggaatgtgttcgctgatccccaatctggaaggcattagcgacaacattcgtgccatcagtattgttgaccgttaccttgaacatgaccgggtttatatttttgaaaatggcggcgataaaaaggtctacctttcttccgccgactggatgacgcgcaatattgattatcgtattgaagtggcgacgccgctgctcgatccgcgcctgaagcagcgggtactggacatcatcgacatattgttcagcgatacggtcaaagcacgttatatcgataaagaactcagtaatcgctacgttccccgcggcaatcgccgcaaagtacgggcgcagttggcgatttatga

技术特征：
1.一种生物酶法合成5
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胞苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：以胞苷、乙酰磷酸钾盐和atp为原料，在尿苷-胞苷激酶和多聚磷酸激酶共同催化下发生反应，制得胞苷酸。2.根据权利要求1所述生物酶法合成5
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胞苷酸的方法，其特征在于：多聚磷酸盐激酶制备为，菌种活化后制备种子液，以2-10％接种量接种至发酵罐，进行连续流高密度发酵培养。3.根据权利要求1所述生物酶法合成5
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胞苷酸的方法，其特征在于：尿苷-胞苷激酶的制备为，菌种活化制备种子液，以2-10％接种量接种至发酵罐，进行连续流高密度发酵培养。4.根据权利要求1所述生物酶法合成5
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胞苷酸的方法，其特征在于：反应温度为25-35℃，反应采用ph＝6.0-8.0条件下进行。5.根据权利要求1所述生物酶法合成5
’‑
胞苷酸的方法，其特征在于：所述反应在mg
2+
存在条件下进行。6.根据权利要求1所述生物酶法合成5
’‑
胞苷酸的方法，其特征在于：所述胞苷浓度为300-500mm，乙酰磷酸钾盐浓度为600-1000mm，atp浓度为15-25mm。

技术总结
本发明公开了一种生物酶法合成5


技术研发人员：杨邵华 邢善涛 吕英杰 张辉 邵春喜 何滨 谷艳昌
受保护的技术使用者：河南省核苷药物研究院有限公司 河南鼎新医药科技有限公司 新乡制药股份有限公司
技术研发日：2023.08.04
技术公布日：2023/9/26