一种FcRn结合纳米颗粒及其用途的制作方法

一种fcrn结合纳米颗粒及其用途
技术领域
1.本公开属于重组融合蛋白治疗药物领域。具体地，本公开涉及一种fcrn结合纳米颗粒及其用途，涉及适合用于治疗fcrn靶点相关疾病的重组融合铁蛋白药物。


背景技术：

2.新生儿fc受体(neonatal fc receptor,fcrn)在妊娠期和哺乳期表达起到跨越胎盘屏障和肠道运输igg的作用，严格依赖ph值与igg的fc结构域结合，保护igg不被溶酶体降解。在igg中，位于fc上ch2和ch3域之间的位点介导与fcrn的相互作用，其中结合可以让来自内体的内吞抗体再循环到血流中(raghavan et al.，1996，annu rev cell dev biol.12：181-220；ghetie et al，2000，annu rev immunol.18：739-766)，从而赋予igg 1-3周的半衰期。
3.除了在抗体转运中起关键作用，fc与fcrn的结合位点也是细菌蛋白a和g结合的位点。与这些蛋白的紧密结合通常可以用作蛋白纯化，使用蛋白a或蛋白g亲和色谱法纯化抗体fc。因此，研究者将目的蛋白与fc与fcrn的结合片段构建成融合蛋白，可更好的分离目的蛋白。
4.此外，fcrn也是一个潜在的药物靶点，其负责将与其结合的fc融合蛋白转移到新生儿的肠道和成年人的肠上皮腔中(ghetie and ward，annu.rev.immunol.，2000，18：739-766；yoshida et al.，immunity，2004，20(6)：769-783)。fcrn的高亲和力尤其对igg介导的如重症肌无力、类风湿性关节炎或寻常天疱疮等自身免疫性疾病造成有害影响。靶向fcrn，抑制fcrn循环可使igg分解代谢增强，导致整体igg和致病自身抗体水平降低，有望降低所有igg引起的自身免疫异常。有研究证实，与重症肌无力的治疗性血浆置换疗法相比，以fcrn靶点的治疗方法可以提供更快速和更具选择性的igg降低效果。另外，与临床使用的许多常规疗法相比，这种治疗方法优势突出也体现在iga、igd、ige和igm不依赖于fcrn介导的循环，因此它不会导致广泛的免疫抑制，为fcrn靶向的安全性和精准特异性提供了基础。
5.目前在临床试验中评估的靶向fcrn抗体药物多为抗体，包括orilanolimab(synt001)、efgartigimo和nipocalimab(m281)等。nipocalimab(m281)是momenta公司开发的一款潜在“best-in-class”抗fcrn抗体，具有治疗多种自身免疫性疾病的潜力，由强生引进。和铂医药2018年从hanall biopharma引进的batoclimab，也是一款靶向新生儿fc受体(fcrn)的全人源抗体。抗体制备筛选过程复杂，临床前开发周期长，成本高昂，因此仍需开发快速、经济、稳定的fcrn靶向药物。
6.天然铁蛋白由两种不同的铁蛋白亚基(h亚基和l亚基)构成，h亚基和l亚基的分子质量分别为21kd和19kd。典型的铁蛋白结构是由24个轻链/重链亚基自组装形成的球壳状结构，外径12nm，内部形成直径8nm的内腔结构。通过重组方式制备重链铁蛋白(hfn)目前可通过融合蛋白表达的方式，将功能性蛋白(如抗体、能够与受体结合的配体肽、小分子肽药物、细胞凋亡前肽、荧光蛋白等)表达于hfn的n端或者c端，以赋予hfn靶向性、示踪性或治疗性(融合方式构建的文献参见：wo2017039382a1，wo2016122259a1，kr-2018008349，
wo2013055058a2，wo2018012952a1，cn104017088a，“ferritin nanocages with biologically orthogonal conjugation for vascular targeting and imaging”等)。目前，通过原核表达的方式能够稳定、快速、经济的获得hfn融合蛋白，因此其被认为具有良好的药物载体开发潜力和成药性。


技术实现要素：

7.本公开利用铁蛋白作为药物载体的独特优势，将具有结合fcrn活性的肽段的编码序列连接于铁蛋白突变体单体亚基的n端或c末端(或截断了c端一个α-螺旋的截短序列，或插入deloop之间)，从而构建多个铁蛋白与具有结合fcrn活性的肽段的融合蛋白，所述的融合蛋白能够自组装成为24聚体，从而形成在铁蛋白表面能展示多个具有结合fcrn活性的肽段的多价纳米治疗药物，在延长了肽治疗药物的半衰期的同时，达到高亲和力，多价结合的效果。
8.本公开提供了2条具有结合fcrn活性的肽段，其均来自于人igg的fc区域的肽段，具有结合fcrn的活性。
9.本公开用于构建融合蛋白的铁蛋白单体亚基序列经过了点突变改造，能够减少聚集体生成、提高蛋白可溶性表达和组装成功率。
10.本公开提供了铁蛋白的单体亚基的片段，使得阻遏肽段连接于铁蛋白c端时能够展示在铁蛋白外表面。
11.具体来说，本公开提出了如下技术方案：
12.在一方面，本公开提供了一种融合蛋白。
13.在一方面，本公开提供了一种包含融合蛋白的纳米颗粒。
14.在一方面，本公开提供了一种用于生产前述融合蛋白或纳米颗粒的方法。
15.在一方面，本公开提供了一种融合蛋白药物组合物。
16.在一方面，本公开提供了一种生成针对与fcrn靶点相关的疾病的药物的方法。
17.在一方面，本公开提供了一种核酸分子。
18.在一方面，本公开提供了一种表达构建体。
19.在一方面，本公开提供了一种重组细胞。
20.在一方面，本公开提供了前述融合蛋白、纳米颗粒、药物组合物或核酸分子、表达构建体、重组细胞在制备与fcrn靶点相关的疾病的药物中的用途。
21.与现有技术相比，本公开具有如下有益效果：
22.(1)本公开构建的铁蛋白-fc融合蛋白能够自组装形成笼状蛋白，多个具有结合fcrn活性的肽段负载于铁蛋白纳米颗粒外表面，能够与人fcrn结合从而竞争性的阻遏igg与fcrn的结合，达到治疗因igg结合fcrn而导致的自发免疫性疾病的效果。与目前临床上开发的靶向fcrn的igg药物相比，本公开的产品一方面通过融合铁蛋白亚基从而延长了阻遏肽的治疗半衰期；一方面，一个铁蛋白分子上能够具有结合fcrn活性的肽段，提供了多价的治疗方案，能大大提高结合fcrn的能力；再一方面，铁蛋白的epr效应可使得该纳米药物相对富集在fcrn高表达的组织，从而有针对性的保护一些fcrn信号活跃的器官；再一方面，本公开构建的铁蛋白-fc融合蛋白的两个组成成分均来自于人体自身的蛋白，因此药物自身免疫原性低。
23.(2)本公开用大肠杆菌表达系统获得的融合蛋白，能够简单、高产量的自组装形成具有结合活性的笼状蛋白，制备方法比抗体制备简单，成本大幅降低，易操作，具有高成药价值和产业化价值。
24.(3)本公开使用的经点突变改造的铁蛋白单体亚基自组装形成纳米颗粒，并为结合fcrn活性的肽段选择了合适的插入位点，不仅使得所述纳米颗粒得以顺利组装、表达、纯化，且显示出不弱于抗体的结合亲和力。
附图说明
25.图1.示出用于融合蛋白表达的pet-30a的质粒图。
26.图2.示出载带融合蛋白编码基因质粒的酶切图谱。
27.图3.示出融合蛋白表达的sds-page结果。
28.图4.示出elisa方法测定的mut-hfn-258与fcrn结合的亲和力曲线图。
具体实施方式
29.术语
30.在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
31.术语“具有结合fcrn活性的肽段”指具备新生儿fc受体(fcrn)结合亲和力的肽段，本文中使用的术语“fcrn”指新生fc受体。示例性的fcrn分子包括由refseq nm_004107中所示的fcgrt基因编码的人fcrn。其通过与人fcrn结合，竞争性阻止igg与fcrn的结合，从而调节igg-fcrn信号通路，治疗由于与fcrn结合介导诱发的自身免疫性疾病。
32.术语“铁蛋白单体亚基”是指铁蛋白单体完整亚基蛋白，本公开所述铁蛋白单体亚基包括重链铁蛋白单体亚基(h亚基)，还包括轻链铁蛋白单体亚基(l亚基)，包括但不限于哺乳动物铁蛋白h亚基，例如人铁蛋白h亚基或马铁蛋白h亚基，优选人铁蛋白h亚基。示例性的野生型人铁蛋白h亚基包含seq id no:1所示氨基酸序列。
33.术语“变体”应理解指包含实质上具有与本公开的铁蛋白单体亚基或其片段相同的功效者，即使在氨基端、羧基端或其内部氨基酸序列被切割或取代。根据本发明的铁蛋白单体亚基或其片段的变体亦指包含在特定氨基酸残基位置的氨基酸残基经保守取代(conservatively substituted)的变体。
34.本公开上述使用的术语“保守取代”是指铁蛋白单体亚基的变体的加工，所述铁蛋白单体亚基的变体的加工涉及以具有相似生化性质的氨基酸取代一个或多个氨基酸，所述具有相似生化性质的氨基酸不会导致铁蛋白单体亚基的变体的生物或生化功能的丧失。
[0035]“保守取代”是某氨基酸残基替换成具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族已被定义，并且在本发明所属领域中为众所周知。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸及组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸及谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨
酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸及色氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸及异亮氨酸)，以及具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及组氨酸)。
[0036]
可想见尽管本发明的铁蛋白单体亚基的变体具有保守性(conservative)氨基酸取代，但仍可保留活性。
[0037]
术语“自身免疫病”在本文中指因个体自身组织引起或针对个体自身组织的疾病或病症。
[0038]
术语“肽段”、“肽”、和“蛋白质”在本公开中可互换使用，指氨基酸的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸是相应的天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸的聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。
[0039]
如本文所用，“核酸分子”是指多个核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的大分子，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本公开的多核苷酸的序列可以针对不同的宿主细胞(如大肠杆菌)进行密码子优化，从而改善多肽的表达。进行密码子优化的方法是本领域已知的。
[0040]“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本公开所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽n端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本技术说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含n端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列。相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子。
[0041]
术语“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mrna或功能rna)和/或rna翻译成前体或成熟蛋白质。本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，可以是能够翻译的rna(如mrna)。通常，在表达构建体中，感兴趣的核苷酸序列与调控序列可操作地连接。
[0042]
术语“纳米颗粒”指从自组装的，单体亚基蛋白形成的颗粒。例如，铁蛋白亚基或其片段自组装成铁蛋白纳米颗粒。本发明的纳米颗粒的形状通常为球状或笼状，尽管其他形状，例如杆状，立方体，片状，长圆形，卵形等也可用于实施本发明。
[0043]
术语“自组装”蛋白质是指能够不借助特定诱导剂，在表达的同时通过规则排列形成多聚体而形成纳米颗粒的蛋白质。
[0044]
术语“连接肽”是指连接两个活性分子间的肽段，其可作为融合蛋白的一部分，为两个待融合蛋白提供一定的空间间隔，以达到趋向于正确折叠而不相互干扰连接两个蛋白活性分子，不会影响活性分子的功能及稳定性。
[0045]
术语“人重链铁蛋白”(下文缩写为“人hfn”)是指仅由人铁蛋白的重链单体亚基或其片段组装成的铁蛋白。“人轻链铁蛋白”(下文缩写为“人lfn”)是指仅由人铁蛋白的轻链单体亚基或其片段组装成的铁蛋白。
[0046]
术语“融合蛋白”是指由上述一种或多种分子组成的天然或合成分子，其中具有不
同特异性的两种或多种基于肽或蛋白质(包括糖蛋白)的分子任选的通过化学的或基于氨基酸的接头分子融合在一起。该连接可通过c-n融合或n-c融合(以5
′→3′
方向)而实现。
[0047]
融合蛋白
[0048]
在第一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：
[0049]
(1)具有结合fcrn活性的肽段；
[0050]
(2)重链铁蛋白单体亚基或其变体。
[0051]
在其中一个实施方案中，所述具有结合fcrn活性的肽段(1)与重链铁蛋白单体亚基或其变体(2)顺序连接，即(1)可连接于(2)的c末端，也可连接于(2)的n末端。
[0052]
在其中一个实施方案中，所述具有结合fcrn活性的肽段(1)插入到重链铁蛋白单体亚基或其变体的序列中；
[0053]
具体的，所述的具有结合fcrn活性的肽段插入到seq id no.2或12的第161位脯氨酸(p)和第162位谷氨酸(e)之间。该位点所在的loop区域为一柔性区域，且在铁蛋白单体亚基自组装成为24聚体组成的纳米颗粒后，位于纳米颗粒的表面，因此将具有结合fcrn活性的肽段插入重链铁蛋白该位点能够将肽段展示在铁蛋白纳米颗粒表面，同时不影响重链铁蛋白单体亚基的组装，以及最大程度提供柔性空间，保证插入肽段的生物学活性和功能。
[0054]
在其中一个实施方案中，所述重链铁蛋白单体亚基是来源于哺乳动物来源的铁蛋白，包括人源性铁蛋白、鼠源性铁蛋白或马脾脏铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
[0055]
在一个优选实施方案中，所述重链铁蛋白单体亚基来源于人源性铁蛋白。
[0056]
在具体实施方案中，所述铁蛋白的来源包括天然提取产物、人工合成产物或基因工程技术产物中的任一种或至少两种的组合。
[0057]
在具体实施方案中，所述重链铁蛋白单体亚基变体是经氨基酸突变后的变体序列；优选地，所述突变氨基酸为半胱氨酸(cys)；更优选地，所述半胱氨酸突变为谷氨酸(glu)、丝氨酸(ser)或丙氨酸(ala)。
[0058]
在具体实施方案中，所述重链铁蛋白单体亚基变体还可以是经保守取代获得的变体。
[0059]
在具体实施方案中，所述重链铁蛋白单体亚基变体是截短突变体；优选地，所述截短突变体是重链铁蛋白单体亚基(h)c端的α-螺旋截短突变体。
[0060]
在其中一个实施方案中，所述的重链铁蛋白单体亚基或其变体包含与seq id no.2、12、3或13所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列如seq id no.2、12、3或13所示。
[0061]
在其中一个实施方案中，所述具有结合fcrn活性的肽段和重链铁蛋白单体亚基或其变体通过连接肽连接；优选地，所述的连接肽为(ggggs)n，n＝2-5、gstsgsgkssegkg、gsgggsg、gggsggsg；更优选的，所述连接肽为gsgggsg。所述连接肽可选地用于(1)和(2)单元顺序连接构建的融合蛋白中；在(1)插入到(2)序列中的情形时，优先考虑不使用连接肽。
[0062]
在其中一个实施方案中，所述具有结合fcrn活性的肽段的长度为10-40个氨基酸；更优选地长度为15-25个氨基酸；更优选为16-19个氨基酸。
[0063]
在其中一个实施方案中，所述的具有结合fcrn活性的肽段来源于免疫球蛋白的fc
no.14、15、16或17所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述的轻链铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列如seq id no.14、15、16或17所示。
[0078]
在其中一个实施方式中，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体，和/或轻链铁蛋白单体亚基或其变体与所述的融合蛋白形成纳米颗粒。
[0079]
在其中一个实施方案中，所述纳米颗粒为所述的融合蛋白和/或铁蛋白单体亚基或其变体自组装形成的24聚体。所述纳米颗粒在其表面上展示融合蛋白包含的具有结合fcrn活性的肽段，该肽段能够与体内fcrn结合从而调节该受体信号通路。在所述纳米颗粒中，融合蛋白的数量可以为1-24，即融合蛋白与铁蛋白单体亚基或其变体的比例可以为24:0-1:23。纳米颗粒中融合蛋白的数量决定了所述纳米颗粒中活性分子的数量，根据融合蛋白的数量可以形成1-24价的fcrn结合活性的纳米颗粒。
[0080]
在其中一个实施方案中，所述纳米颗粒为24个融合蛋白自组装形成的24聚体，不包含铁蛋白单体亚基或其变体。
[0081]
在其中一个实施方案中，所述纳米颗粒与fcrn的结合活性为1-3nm；更优选1.5-2nm；更优选1.8nm。
[0082]
在第三方面，本公开提供一种用于生产第一方面所述的融合蛋白、或第二方面所述的纳米颗粒的方法，所述方法包括将编码所述融合蛋白的一个或多个核酸分子导入细胞中，并在适合于表达编码的融合蛋白或形成纳米颗粒的条件下培养所述细胞。
[0083]
在第四方面，本公开提供一种药物组合物，其包含第一方面所述的融合蛋白、第二方面所述的纳米颗粒或第三方面所述的方法生产的纳米颗粒；
[0084]
在其中一个实施方案中，所述药物组合物是针对与fcrn靶点相关的疾病的药物。所述药物组合物的作用机理是基于当igg的血清浓度达到超过可利用fcrn分子的水平时，未结合的igg无法受到保护而免受降解机制并且因此血清半衰期将降低。因此，抑制igg与fcrn结合通过阻止igg的igg内体再循环而降低igg的血清半衰期。因此，本公开作为拮抗igg与fcrn结合的药物组合物可用于调节、治疗或预防抗体介导的病症(antibody-mediated disorder)，例如自身免疫病、炎性疾病、或高球蛋白血症等。
[0085]
在第五方面，本公开内容提供了在对象中抑制fcrn功能的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的第四方面的药物组合物。
[0086]
在第六方面，本公开内容提供了在已施用含fc剂(fc-containing agent)的对象中降低所述含fc剂的血清水平的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的本文中公开的药物组合物。在某些实施方案中，所述含fc剂是抗体或免疫粘附素。在某些实施方案中，所述含fc剂是治疗剂或诊断剂。在某些实施方案中，所述含fc剂是成像剂。在某些实施方案中，所述含fc剂是抗体药物缀合物。
[0087]
在第七方面，本公开内容提供了在对象中治疗抗体介导的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的本文中公开的药物组合物。在某些实施方案中，所述抗体介导的病症是高球蛋白血症。在某些实施方案中，所述抗体介导的病症是使用静脉内免疫球蛋白(ivig)可治疗的疾病或病症。在某些实施方案中，所述抗体介导的病症是使用血浆去除术和/或免疫吸附可治疗的疾病或病症。
[0088]
在某些实施方案中，抗体介导的病症是自身免疫病。在某些实施方案中，自身免疫病选自同种异体胰岛移植物排斥、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病(autoimmune addison
′
s disease)、阿尔茨海默病(alzheimer’s disease)、抗嗜中性粒细胞胞质自身抗体(antineutrophil cytoplasmic autoantibody，anca)、自身免疫性肾上腺疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、自身免疫性嗜中性粒细胞减少、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少、自身免疫性荨麻疹、贝赫切特病(behcet
′
s disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯尔曼综合征(castleman
′
ssyndrome)、腹型斯泼卢腹泻-皮炎(celiac spruce-dermatitis)、慢性疲劳免疫功能障碍综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy，cidp)、丘-斯综合征(churg-strauss syndrome)、疤痕性类天疱疮、crest综合征、冷凝集素病、克罗恩病(crohn
′
s disease)、皮肌炎、扩张型心肌病、盘状狼疮(discoid lupus)、获得性大疱性表皮松解、特发性混合型冷球蛋白血症(essential mixedcryoglobulinemia)、因子viii缺乏、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病(grave
′
s disease)、格林-巴利(guillain-barre)、古德帕斯丘综合征(goodpasture
′
ssyndrome)、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，gvhd)、桥本甲状腺炎(hashimoto
′
s thyroiditis)、血友病a、特发性膜性神经病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenia purpura，itp)、iga神经病、igm多神经病、免疫介导的血小板减少、幼年型关节炎、川畸病(kawasaki
′
s disease)、扁平苔藓、硬化性苔癣、红斑狼疮(lupus erthematosis)、梅尼埃病(meniere
′
s disease)、混合性结缔组织病、粘膜类天疱疮、多发性硬化、1型糖尿病、多灶性运动神经病(multifocal motorneuropathy，mmn)、重症肌无力、副肿瘤性大疱性类天疱疮、妊娠性类天疱疮、寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、复发性多软骨炎、雷诺现象(reynauld
′
s phenomenon)、赖特尔综合征(reiter
′
s syndrome)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征(sjorgen
′
s syndrome)、实体器官移植排斥、僵人综合征、系统性红斑狼疮、高安动脉炎、中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermalnecrolysis，ten)、史-约综合征(stevens johnson synd rome，sjs)、颞动脉炎(temporalarteristis)/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、疱疹样皮炎血管炎、抗嗜中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎、白斑和韦格纳肉芽肿病(wegner
′
sgranulomatosis)。
[0089]
在某些实施方案中，所述自身免疫病是自身免疫性离子通道病(autoimmunechannelopathy)。在某些实施方案中，所述离子通道病选自自身免疫性边缘系脑炎、癫痫、视神经脊髓炎、兰-伊肌无力综合征(lambert-eaton myasthenic syndrome)、重症肌无力、抗-n-甲基-d-天冬氨酸(anti-n-methyl-d-aspartate，nmda)受体脑炎、抗-α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(anti-α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacid，ampa)受体脑炎、莫尔旺综合征(morvan syndrome)、神经性肌强直、与链球菌感染相关的小儿自身免疫性神经精神障碍(pediatric autoimmune neuropychiatric disordersassociated with streptococcal infection，pandas)，和甘氨酸受体抗体相关性病症。
no:1；参见pdb:3ajo_a)设计h亚基突变体的氨基酸序列，具体设计见表1。所得亚基突变体分别命名为mut-hfn-212(seq id no:2)和mut-hfn-243(seq id no:3)。
[0106]
表1、hfn突变体的设计
[0107][0108]
(1)mut-hfn-212的氨基酸序列如下(seq id no:2)：
[0109]
ttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqsheerehaeklmk
[0110]
lqnqrggriflqdikkpdcddwesglnamesalhleknvnqsllelhklatdkndphlsdfiethylneqvk
[0111]
aikelgdhvtnlrkmgapesglaeylfdkhtlgdsdnes
[0112]
(2)mut-hfn-212 c端截短的氨基酸序列如下(seq id no:12)：
[0113]
ttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqsheerehaeklmkl
[0114]
qnqrggriflqdikkpdcddwesglnamesalhleknvnqsllelhklatdkndphlsdfiethylneqvka
[0115]
ikelgdhvtnlrkm
[0116]
(3)mut-hfn-243的氨基酸序列如下(seq id no:3)：
[0117]
ttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqshekregaeklmk
[0118]
lqnqrggriflqdikkpdcddwesgldameaalhleenvnqsllelhklatdkndphladfiethylneqvk
[0119]
aikelgdhvtnlhkmgapesglaeylfdkhtlgdsdnes
[0120]
(4)mut-hfn-243 c端截短的氨基酸序列如下(seq id no:13)
[0121]
ttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqshekregaeklmkl
[0122]
qnqrggriflqdikkpdcddwesgldameaalhleenvnqsllelhklatdkndphladfiethylneqvka
[0123]
ikelgdhvtnlhkm
[0124]
2、候选的fcrn结合肽段
[0125]
本公开使用的fcrn结合肽段来源于人igg的fc的一个片段，其氨基酸序列如下：
[0126]
(1)fc(f423-l441)：
[0127]
fsssvmhealhnhytqksl(seq id no.4)
[0128]
(2)fc(f421-l443，c425s)：
[0129]
nvfsssvmhealhnhytqkslsl(seq id no.5)
[0130]
3、突变hfn单体蛋白亚基与fcrn结合肽段的融合蛋白
[0131]
(1)mut-hfn-fc-254融合蛋白
[0132]
以mut-hfn-243为模板，截去c端(第159g-182s位氨基酸)，然后将fc(f423-l441)肽段通过linker：gsgggsg连接至c端截短后的mut-hfn-243的c端，形成mut-hfn-fc-254融合蛋白，其氨基酸序列为(seq id no.6)：
[0133]
ttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqshekregaeklmkl
[0134]
qnqrggriflqdikkpdcddwesgldameaalhleenvnqsllelhklatdkndphladfiethylneqvk
[0135]
aikelgdhvtnlhkmgsgggsgfsssvmhealhnhytqksl
[0136]
(2)mut-hfn-fc-257融合蛋白
[0137]
以mut-hfn-212为模板，截去c端(第159g-182s位氨基酸)，然后将fc(f423-l441)肽段通过linker：gsgggsg连接至c端截短后的mut-hfn-212的n端，形成mut-hfn-fc-257融合蛋白，其氨基酸序列为(seq id no.7)：
[0138]
ttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqsheerehaeklmkl
[0139]
qnqrggriflqdikkpdcddwesglnamesalhleknvnqsllelhklatdkndphlsdfiethylneqvka
[0140]
ikelgdhvtnlrkmgsgggsgfsssvmhealhnhytqksl
[0141]
(3)mut-hfn-fc-258融合蛋白
[0142]
以mut-hfn-212为模板，将fc(f421-l443，c425s)肽段插入mut-hfn-212的de loop(p161/e162)之间，形成mut-hfn-fc-258融合蛋白，其氨基酸序列为(seq id no.8)：
[0143]
ttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqsheerehaeklmkl
[0144]
qnqrggriflqdikkpdcddwesglnamesalhleknvnqsllelhklatdkndphlsdfiethylneqvka
[0145]
ikelgdhvtnlrkmgapnvfsssvmhealhnhytqkslslesglaeylfdkhtlgdsdnes
[0146]
4、编码基因的设计
[0147]
根据宿主菌的密码子偏爱性合成上述多肽、蛋白或融合蛋白的编码基因。
[0148]
mut-hfn-fc-254优化后的核苷酸序列为(seq id no.9)
[0149]
ccatgacgacggcctctacgtcacaggtgcgccagaattatcatcaggatagcgaagcagctattaatcgtc
[0150]
agatcaatttagaactgtatgcgagctatgtgtatctgagtatgtcttattattttgatcgcgatgatgttgc
[0151]
cctgaaaaattttgccaaatattttctgcatcagtctcatgaaaaacgcgaaggcgccgaaaaactgatga
[0152]
aactacagaatcagcgtggcggtcgtatctttttacaagatattaaaaaaccggattgtgatgattgggaa
[0153]
agtggcttagatgctatggaagcagccttacatctggaagaaaatgttaatcagtcactgctggaactg
ca
[0154]
taaactggcaaccgataaaaatgatccgcatttagccgattttatcgaaacacattatctgaatgaacaggt
[0155]
taaagccatcaaagaattaggtgatcatgtgaccaatttacataaaatgggtagcggcggtggtagtggct
[0156]
tttctagtagtgttatgcatgaagcgttacataatcattatacccagaaatctctgtaactcgagmut-hfn-fc-257优化后的核苷酸序列为(seq id no.10)：
[0157]
catatgaccaccgcaagtacctcacaggtgcgccagaattatcatcaggatagcgaagcagccattaatcgt
[0158]
cagattaatttagaactgtatgcaagctatgtgtatctgtctatgtcatattattttgatcgcgatgatgttgc
[0159]
cctgaaaaattttgccaaatattttctgcatcagtctcatgaagaacgcgaacatgccgaaaaactgatga
[0160]
aattacaaaatcagcgtggcggtcgtatttttttgcaggatattaaaaaaccggattgtgatgattgggaa
[0161]
agtggcctgaatgcaatggaaagtgccttacatctggaaaaaaatgttaatcagagtctgctggaactgc
[0162]
ataaactggcaaccgataaaaatgatccgcatctgagcgattttattgaaacccattatctgaatgaacagg
[0163]
ttaaagcaattaaagaattaggcgatcatgtgaccaatttacgtaaaatgggtagtggtggcggtagcggc
[0164]
tttagctctagtgttatgcatgaagccttacataatcattatacccagaaatctttataaaagcttmut-hfn-fc-258优化后的核苷酸序列为(seq id no.11)：
[0165]
catatgaccaccgcaagtacctcacaggtgcgtcagaattatcatcaggatagcgaagcagccattaatcgc
[0166]
cagattaatctggaactgtatgccagctatgtgtatctgagtatgtcttattattttgatcgcgatgatgttg
[0167]
cactgaaaaattttgccaaatattttctgcatcagtctcatgaagaacgtgaacatgccgaaaaactgatg
[0168]
aaattgcaaaatcagcgcggtggtcgtatttttttacaggatattaaaaaaccggattgtgatgattggga
[0169]
aagtggcttaaatgcaatggaaagtgccctgcatttagaaaaaaatgttaatcagtcactgctggaattac
[0170]
ataaactggcaaccgataaaaatgatccgcatctgtcagattttattgaaacccattatctgaatgaacagg
[0171]
ttaaagcaattaaagaactgggcgatcatgtgaccaatttacgcaaaatgggcgccccgaatgtgtttagc
[0172]
tctagtgttatgcatgaagccttacataatcattatacccagaaatctctgagcttagaaagcggcctggcc
[0173]
gaatatctgtttgataaacataccttaggcgatagcgataatgaatcttaaaagctt
[0174]
实施例1融合蛋白的制备和纯化
[0175]
1.基因合成
[0176]
基因合成和载体构建工作委托上海捷瑞生物工程有限公司进行，构建的重组质粒经确认序列正确。
[0177]
2.表达菌株构建
[0178]
选择大肠杆菌表达外源蛋白的常用载体pet-30a(+)，抗性为卡那霉素抗性(kan+)，选择nde i和hind iii酶切位点嵌入目的基因(mut-hfn-fc-254、mut-hfn-fc-257和mut-hfn-fc-258)，获得重组pet-30a(+)。经酶切图谱和基因测序确证表达载体构建成功。其中，pet-30a(+)的质粒图谱如图1所示，酶切结果如图2所示。经双酶切后，电泳图中有两条基因条带，第二条带分别是各基因的目的条带，大小在理论值附近，表明目的基因已构建至表达质粒中。
[0179]
选择e.coli bl21(de3)作为宿主菌，将含有目的基因的重组质粒转化至宿主菌感受态细胞中，通过含50μg/ml卡那霉素的抗性平板筛选阳性克隆，确定重组菌株，具体过程如下。
[0180]
3.重组菌株构建
[0181]
i.重组质粒重悬
[0182]
取两个重组质粒冻干粉10μg，分别用200μl te缓冲液重悬均匀，10μl/管分装，分别留1管备用，其余冻存于-80℃冰箱备用。
[0183]
ii.转化
[0184]
(1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞，放置在冰上融化后(约5min左右)，在冰浴中，取一定量质粒重悬液(不同载体和宿主菌用量不同)加入到20μl感受态细胞中充分混匀，在冰上静置孵育30min。
[0185]
(2)将上述样品于42℃水浴热激90s后，立即放置到冰上，静置2min。
[0186]
(3)取280μl无菌lb液体培养基，加入到热激后的样品中，在37℃，220rpm活化1h。
[0187]
(4)分别取上述转化后的菌液涂布于lb抗性平板上，37℃培养箱培养过夜，观察菌落生长情况。
[0188]
4.蛋白表达
[0189]
i.摇瓶培养
[0190]
分别取抗性平板上大且饱满的克隆3个，分别接种于40ml lb培养基中，于37℃培养至od600 1.0～2.0，加入0.5mm iptg，25℃诱导表达4
ꢀ‑
6h，分别经sds-page检测目的蛋白的表达情况(图3)，由结果来看，mut-hfn-fc-254未能表达出目的蛋白，而mut-hfn-fc-257、mut-hfn-fc-258均表达于细胞上清液中，且表达量较大。后发现，mut-hfn-fc-254未能组装成为铁蛋白笼状蛋白复合物，这说明融合蛋白的构建和表达受一级结构序列影响较大。
[0191]
ii.检测样品制备
[0192]
菌体裂解：取30ml菌液，5000r/min离心15min，弃上清，加入25ml 20mm tris-hcl缓冲液重悬均匀，于高压均质机1000bar破碎3次。
[0193]
sds-page样品制备：取上述菌体裂解液1000μl，10000rpm离心10min，取20μl上清
液至另一离心管中，加入5μl 5
×
loading buffer混匀，95℃孵育5min，此为裂解液上清样品；将剩余的沉淀，加入1000μl 20mm tris-hcl,ph8.0缓冲液重悬沉淀，取20μl重悬液加入5μl 5
×
loading buffer混匀，95℃孵育5min，此为裂解液沉淀样品。
[0194]
实施例2融合蛋白纯化及纯度检测
[0195]
由于mut-hfn-fc-254不表达，因此本实验仅纯化mut-hfn-fc-257和mut-hfn-fc-258融合蛋白，具体纯化步骤如下：
[0196]
(1)称取实施例1制备的表达mut-hfn-fc-257或mut-hfn-fc-258的一定量菌泥，用50mm tris-hcl，ph8.0缓冲液，以固液比1:20(m/v)左右重悬菌体，充分混匀；
[0197]
(2)用高压均质机于2℃～10℃、800～1000bar高压破碎3次，得菌体裂解液；
[0198]
(3)菌体裂解液于75℃水浴锅加热处理(磁力搅拌)，待样品溶液升温至70℃时开始计时，计时5min，取出样品于冰水浴冷却至25℃以下；
[0199]
(4)于2℃～8℃、12000rpm、离心20min，收集上清液，上清液经0.45μm过滤澄清；
[0200]
(5)经疏水层析(层析柱：phenyl hp)、离子交换层析(层析柱：emd tmae)、脱盐(g25)处理获得纯化的融合蛋白mut-hfn-fc-257或mut-hfn-fc-258。
[0201]
纯化好的融合蛋白用尺寸排阻色谱(sec)法测定其纯度和单体/聚体情况，具体步骤如下：
[0202]
(1)分别取1ml蛋白浓度为1mg/ml的蛋白样品，置于干净的1.5ml ep管中；
[0203]
(2)取10微升样品在高效液相层析系统(agilent technologies 1260infinityⅱ)通过凝胶过滤层析柱(agilent advance bio sec 300a 2.7um 7.8*300nm，色谱柱编号：ard-007流速：0.5ml/min)sec分析铁蛋白单体和聚体峰，流动相：50mm tris buffer，ph7.2。检测波长：280nm柱温：25℃。
[0204]
经sec检测粒径为17.4nm的24聚体复合物，sec检测结果显示，融合蛋白均以24聚体的形式形成铁蛋白笼状蛋白单体，其粒径在17.4nm左右，未见明显的聚集体。mut-hfn-fc-258的图谱见图4。
[0205]
同时，对mut-hfn-fc-257、mut-hfn-fc-258纯化所得蛋白进行内毒检测，结果显示内毒素在10-100eu/ml，内毒达标。
[0206]
实施例3融合蛋白活性检测
[0207]
使用间接elisa法检测纯化后的蛋白与fcrn的结合活性，由此证明是否存在具有结合活性的目的蛋白。
[0208]
实验操作流程如下：
[0209]
(1)包被样品：将制备的各组突变体融合蛋白样品稀释至6μg/ml，3倍梯度稀释，混匀后加入到酶标板中，100μl/孔，放入湿盒中，放至4℃冰箱，过夜。
[0210]
(2)拿出酶标板洗板：用1*pbst(取300μl tween-20加入pbs 100ml中混匀使用)洗3次。
[0211]
(3)封闭：取5％脱脂奶粉，分别加入300μl/孔，覆上封板膜，37℃培养箱中孵育2h。
[0212]
(4)洗板：用1*pbst洗3次。
[0213]
(5)用1％ bsa将fcrn蛋白(北京义翘神州生物有限公司)稀释成0.4μg/ml，每孔100μl，室温混匀孵育2h。
[0214]
(6)洗板：用1*pbst洗3次。
[0215]
(7)孵育抗体：用1％ bsa将一抗(anti-his tag antibody，boster)稀释成1:1000，按照孔板设计100μl/孔加至酶标板，覆上封板膜，室温圆周混匀孵育2h。
[0216]
(8)洗板：1*pbst洗3次。
[0217]
(9)孵育二抗：将二抗(anti-mouse hrp，boster)用1％ bsa稀释成1:5000，混匀，100μl/孔加至酶标板，覆上封板膜，37℃孵育1.5h。
[0218]
(10)洗板：1*pbst洗3次。
[0219]
(11)显色：每孔加入tmb 100μl/孔，盖上覆膜放入37℃恒温箱温育15min。
[0220]
(12)终止：显色完成后，每孔依次加入50μl终止液，终止后读数(波长450nm)。
[0221]
重复若干次结果发现，mut-hfn-fc-257的包被浓度高达0.8mg/ml时，仍未检测到其与fcrn的结合活性，而mut-hfn-fc-258则表现出截然不同的结果(图4)，其表现出优异的fcrn结合活性，与fcrn结合的ec50值为1.028μg/ml,即1.8nm，其亲和力与单抗相当。

技术特征：
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(1)具有结合fcrn活性的肽段；(2)重链铁蛋白单体亚基或其变体；所述(1)与(2)顺序连接，或所述(1)插入到(2)的序列中；任选地，所述(1)和(2)通过连接肽连接；优选地，所述具有结合fcrn活性的肽段的长度为10-40个氨基酸；更优选地长度为15-25个氨基酸；优选地，所述的具有结合fcrn活性的肽段来源于免疫球蛋白的fc段，更优选地，来源于人igg的fc段。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述具有结合fcrn活性的肽段包含与seq id no.4或5所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；优选地，所述具有结合fcrn活性的肽段的氨基酸序列如seq id no.4或5所示；所述的重链铁蛋白单体亚基或其变体包含与seq id no.2、12、3或13所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列如seq id no.2、12、3或13所示；优选地，所述的具有结合fcrn活性的肽段插入到seq id no.2或12的第161位脯氨酸(p)和第162位谷氨酸(e)之间；优选地，所述的连接肽为(ggggs)
n
，n＝2-5、gstsgsgkssegkg、gsgggsg、gggsggsg；优选地，所述融合蛋白包含与seq id no.6、7或8所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.6、7或8所示。3.一种纳米颗粒，其由至少一个权利要求1所述的融合蛋白和/或铁蛋白单体亚基或其变体自组装而形成，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示所述具有结合fcrn活性的肽段，所述具有结合fcrn活性的肽段能够结合fcrn；优选地，所述的铁蛋白单体亚基或其变体选自重链铁蛋白单体亚基或其变体、以及轻链铁蛋白单体亚基或其变体；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体，和/或轻链铁蛋白单体亚基或其变体与所述的融合蛋白形成纳米颗粒；更优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体是人重链铁蛋白单体亚基或其变体；优选地，所述轻链铁蛋白单体亚基或其变体是人轻链铁蛋白单体亚基或其变体；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体包含与seq id no.1、2、12、3或13所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列如seq idno.1、2、12、3或13所示；优选地，所述轻链铁蛋白单体亚基或其变体包含与seq id no.14、15、16或17所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述的轻链铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列如seq id no.14、15、16或17所示；优选地，所述纳米颗粒为所述的融合蛋白和/或铁蛋白单体亚基或其变体自组装形成的24聚体；更优选地，所述纳米颗粒为24个融合蛋白自组装形成的24聚体；优选地，所述纳米颗粒与fcrn的结合活性为1-3nm；更优选1.5-2nm；更优选1.8nm。4.用于生产权利要求1或2所述的融合蛋白、或权利要求3所述的纳米颗粒的方法，所述方法包括将编码所述融合蛋白的一个或多个核酸分子导入细胞中，并在适合于表达编码的融合蛋白或形成纳米颗粒的条件下培养所述细胞。5.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3所述的纳米颗粒或根据权利要求4所述的方法生产的纳米颗粒；优选地，所述药物组合物是针对与fcrn靶点相关的疾病的药物；优选地，所述的疾病为抗体介导的病症、包括自身免疫性疾病、炎性疾病或高球蛋白血症；更优选地，所述抗体介导的病症为自身免疫性疾病，例如斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、阿尔茨海默病、抗嗜中性粒细胞胞质自身抗体(anca)、自身免疫性肾上腺疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、自身免疫性嗜中性粒细胞减少、自身免疫性卵巢炎、自体免疫性睾丸炎、自身免疫性荨麻疹、贝赫切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯尔曼综合征、腹型斯泼卢腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、丘-斯综合征、疤痕性类天疱疮、crest综合征、冷凝集素病、克罗恩病、皮肌炎、盘状狼疮、获得性大疱性表皮松解、特发性混合型冷球蛋白血症、因子viii缺乏、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利、古德帕斯丘综合征、移植物抗宿主病(gvhd)、桥本甲状腺炎、特发性膜性神经病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga神经病、igm多神经病、免疫介导的血小板减少、幼年型关节炎、川畸病、扁平苔藓、硬化性苔癣、红斑狼疮、梅尼埃病、混合性结缔组织病、粘膜类天疱疮、多发性硬化、1型糖尿病、多灶性运动神经病(mmn)、妊娠性类天疱疮、寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、赖特尔综合征、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、实体器官移植排斥、僵人综合征、高安动脉炎、中毒性表皮坏死松解症(ten)、史-约综合征(sjs)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、疱疹样皮炎血管炎、抗嗜中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎、白斑和韦格纳肉芽肿病、重症肌无力、类风湿性关节炎或寻常天疱疮；优选地，所述药物组合物还包含另一种治疗剂；所述另一种治疗剂选自免疫治疗剂或其他调节免疫系统的药物。6.一种核酸分子，其包含编码权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3所述的纳米颗粒或根据权利要求4所述的方法生产的纳米颗粒的核酸序列；优选地，所述核酸序列包含与seq id no.9、10或11所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述核酸序列如seq id no.9、10或11所示；优选地，所述核酸分子是密码子优化的核酸分子。
7.一种生成针对与fcrn靶点相关的疾病的药物的方法，该方法包括：a)表达权利要求1或2所述的融合蛋白、或形成权利要求3所述的纳米颗粒或生产根据权利要求4所述的方法生产的纳米颗粒；和b)回收所述的融合蛋白或纳米颗粒。8.表达构建体，其包含权利要求6所述的核酸分子。9.一种重组细胞，其包含权利要求6所述的核酸分子或权利要求8所述的表达构建体。10.权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3所述的纳米颗粒或根据权利要求4所述的方法生产的纳米颗粒、权利要求5所述的药物组合物、或根据权利要求7所述的方法生产的药物、权利要求6所述的核酸分子、权利要求8所述的表达构建体、权利要求9所述的重组细胞在制备与fcrn靶点相关的疾病的药物中的用途；优选地，制备抗体介导的病症的药物的用途，更优选地，所述抗体介导的病症选自自身免疫性疾病，例如斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、阿尔茨海默病、抗嗜中性粒细胞胞质自身抗体(anca)、自身免疫性肾上腺疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、自身免疫性嗜中性粒细胞减少、自身免疫性卵巢炎、自体免疫性睾丸炎、自身免疫性荨麻疹、贝赫切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯尔曼综合征、腹型斯泼卢腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、丘-斯综合征、疤痕性类天疱疮、crest综合征、冷凝集素病、克罗恩病、皮肌炎、盘状狼疮、获得性大疱性表皮松解、特发性混合型冷球蛋白血症、因子viii缺乏、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利、古德帕斯丘综合征、移植物抗宿主病(gvhd)、桥本甲状腺炎、特发性膜性神经病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga神经病、igm多神经病、免疫介导的血小板减少、幼年型关节炎、川畸病、扁平苔藓、硬化性苔癣、红斑狼疮、梅尼埃病、混合性结缔组织病、粘膜类天疱疮、多发性硬化、1型糖尿病、多灶性运动神经病(mmn)、妊娠性类天疱疮、寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、赖特尔综合征、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、实体器官移植排斥、僵人综合征、高安动脉炎、中毒性表皮坏死松解症(ten)、史-约综合征(sjs)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、疱疹样皮炎血管炎、抗嗜中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎、白斑和韦格纳肉芽肿病、重症肌无力、类风湿性关节炎或寻常天疱疮。

技术总结
本公开涉及一种铁蛋白-Fc融合蛋白、由融合蛋白形成的纳米颗粒，及其在制备与FcRn相关疾病药物中的应用，具体地，本公开涉及的铁蛋白-Fc融合蛋白、纳米颗粒能够竞争性结合FcRn靶点，以治疗由抗体介导的疾病、包括自身免疫性疾病、炎性疾病或高球蛋白血症。炎性疾病或高球蛋白血症。


技术研发人员：柯天一 姚德惠 劳芳 刘岩 丁凤姣 张泽译 闫西冲
受保护的技术使用者：昆山新蕴达生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/9/26