一种龟甲胶多肽的制备方法与应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说是涉及一种龟甲胶多肽的制备方法与应用。


背景技术：

2.肝癌是全球重要的健康问题，是导致癌症相关死亡的第三大原因。预计到2025年，全球将有超过100万例与肝癌相关的病例，其中肝细胞癌是最常见的类型，占所有病例的90％。这对全球来说是一个重大的经济和公共卫生负担。科学家们也在努力开发基于生物活性物质的新治疗方法，以改善肝癌患者的生活质量和生存率。
3.科学证据表明，蛋白质不仅可以作为营养物质，还可以调节身体的生理功能，其中主要由天然蛋白质序列中的一些肽段调节。生物活性肽具有各种结构，毒性低，来源广泛，目前在预防或治疗肝癌方面表现出独特的优势和巨大的潜力，包括多靶点预防无副作用，制备过程简单，环境友好。这些优势和潜力使得生物活性肽在肝癌治疗领域越来越重要，提升了生物活性肽在肝癌治疗领域的重要性。
4.生物活性肽可以通过不同的方法从食物蛋白质中获得，包括酶解和发酵。酶解是一种快速、安全、易于控制的生产生物活性肽的技术之一，它可以改善蛋白质的功能和生物性能，并增加低价值副产品的价值。蛋白酶是一种能够靶向并作用于特定肽链、酯键和酰胺键的酶，促进蛋白质的水解，这种酶解过程具有显著的特异性，通常依赖于与裂解位点附近的氨基酸序列。蛋白酶的特异性以及水解过程中的条件(ph值、温度、时间)导致不同大小的肽链和不同水平的游离氨基酸，这些变化直接影响水解产物的生物活性。umayaparvathi进行了一项研究，他们使用酶解法从牡蛎中制备了蛋白质水解物，并确定了这些纯化肽的氨基酸序列，显著的是，这些肽对ht-29结肠癌细胞株表现出显著的抗癌活性。yaghoubzadeh利用碱性蛋白酶和风味蛋白酶水解虹鳟鱼皮，他们使用膜超滤法分离生物活性肽，并利用mtt试验评估其对hct-116细胞的抗癌潜力，研究结果显示细胞生长受到显著抑制，表明所获得的肽具有抗癌活性。
5.作为传统中药，龟甲胶是通过对龟板进行预处理、煮沸、过滤、浓缩和干燥而得到的胶状块。龟甲胶性凉、味咸甘，具有滋阴补阳、益肾强骨、滋血补心、活血通络的功效。研究发现，龟甲胶的主要成分是胶原蛋白。胶原蛋白主要存在于骨骼、肌腱和结缔组织中，是食用动物中最丰富的细胞外基质蛋白质。低分子量的胶原蛋白水解物比高分子量的胶原蛋白具有更高的生物利用度和生物活性。此外，龟甲胶还含有丰富的氨基酸，其中甘氨酸含量最高。
6.总之，鉴于肝癌的发病率不断增加，探索和利用龟甲胶等传统药物资源以及其他生物活性化合物在肝癌治疗中具有重要意义。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种龟甲胶多肽的制备方法与应用，以解决现
有技术中的不足。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种龟甲胶多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
10.(1)将龟板粉碎，加水，加热回流提取，过滤，得到滤液；
11.(2)将滤液加热并持续搅拌浓缩，得到凝胶状溶液；
12.(3)将凝胶状溶液进行干燥，再次干燥，得到龟甲胶；
13.(4)将龟甲胶加入水中溶解，再加入蛋白酶，调整温度和ph值进行酶解，得到酶解液；
14.(5)将酶解液加热煮沸灭酶，冷却，离心，收集上清液，即得龟甲胶多肽。
15.进一步，上述步骤(1)中，龟板和水的质量体积比为1g:5ml。
16.进一步，上述步骤(1)中，加热回流提取的温度为100℃，时间为3h，次数为两次；过滤的方法为真空过滤法。
17.进一步，上述步骤(2)中，加热至55℃。
18.进一步，上述步骤(3)中，干燥的装置为烘箱，温度为60℃，时间为24h；再次干燥的装置为干燥器，时间为48h。
19.进一步，上述步骤(4)中，蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶，优选为胃蛋白酶。
20.进一步，上述步骤(4)中，龟甲胶、水和蛋白酶的质量体积比为1g:20ml:400单位。
21.进一步，上述步骤(4)中，温度为37-55℃；ph值为2.0-8.0；酶解的时间为6h。更进一步，碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的最佳酶解条件分别为50℃、ph 8.0，55℃、ph 8.0，55℃、ph 7.0，37℃、ph 2.0和37℃、ph 8.0，对应的酶活力分别为708.50
±
3.04u/mg、823.31
±
16.31u/mg、379.98
±
1.47u/mg、126.65
±
2.25u/mg和417.57
±
2.18u/mg。
22.进一步，上述步骤(5)中，加热煮沸的温度为100℃，时间为10min；冷却至室温；离心的速度为8000r/min，时间为15min。
23.本发明还请求保护一种上述制备方法制得的龟甲胶多肽在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。
24.进一步，上述龟甲胶多肽为fdf。
25.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
26.本发明利用不同的酶制备了龟甲胶多肽(tsgh)，并结合网络药理学、分子对接技术和计算筛选方法预测和探索tsgh中潜在的抗癌肽。此外，本发明建立了肝癌细胞模型，研究所选和合成的肽在肝癌治疗和预防中的机制。本发明发现了fdf、fsg、lllpkp和ngy抑制肝癌细胞增殖的潜在作用，并明确了fdf对肝癌细胞增殖的抑制作用。本发明为中国传统医学提供了新的见解，扩展了其在食品和制药行业中的潜在应用。
附图说明
27.图1为实施例1-5tsghs的总氨基酸含量；
28.图2为实施例1-5tsghs的游离氨基酸含量；
29.图3为实施例1-5tsghs对肝癌细胞hepg2增殖的影响(不同的字母表示p《0.05时的
显著性差异)；
30.图4为实施例1-5tsghs的upset venn图；
31.图5为fdf的ms/ms鉴定图谱；
32.图6为fsg的ms/ms鉴定图谱；
33.图7为lllpkp的ms/ms鉴定图谱；
34.图8为ngy的ms/ms鉴定图谱；
35.图9为fdf的分子结构图谱；
36.图10为fsg的分子结构图谱；
37.图11为lllpkp的分子结构图谱；
38.图12为ngy的分子结构图谱；
39.图13为tsg肽段-肝癌靶点的venn图；
40.图14为tsg肽段-肝癌靶点的ppi网络图；
41.图15为tsg肽段-肝癌靶点的通路网络图；
42.图16为tsg肽段在肝癌治疗中的kegg通路富集分析；
43.图17为tsg肽段在肝癌治疗中的go-bp富集分析；
44.图18为tsg肽段在肝癌治疗中的go-mf富集分析；
45.图19为tsg肽段在肝癌治疗中的go-cc富集分析；
46.图20为分子对接结合能；
47.图21为fdf-casp3的三维可视化对接示意图；
48.图22为fdf-il-1b的三维可视化对接示意图；
49.图23为fdf-stat3的三维可视化对接示意图；
50.图24为fdf-mmp9的三维可视化对接示意图；
51.图25为fdf-src的三维可视化对接示意图；
52.图26为fdf-ccnd1的三维可视化对接示意图；
53.图27为fdf引起肝癌细胞释放ldh的图示；
54.图28为细胞内mda含量；
55.图29为细胞内sod活性；
56.图30为fdf对hepg2细胞中casp3表达的影响；
57.图31为fdf对hepg2细胞中il-1b表达的影响；
58.图32为fdf对hepg2细胞中tnf-α表达的影响。
具体实施方式
59.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
60.以下实施例中：
61.龟板购自广东省云浮市万碧金龟宝养殖有限公司；
62.碱性蛋白酶和中性蛋白酶购自元源生物科技有限公司；
63.木瓜蛋白酶购自上海三昊生物科技有限公司；
64.胃蛋白酶和胰蛋白酶购自美国sigma公司；
65.dmem培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗生素、胰蛋白酶、pbs缓冲液、dmso等物品购自美国sigma公司；
66.hepg2肝癌细胞购自上海安薇生物科技有限公司；
67.cck-8细胞增殖试剂盒、trizol、depc水购自碧云天生物试剂有限公司；
68.乳酸脱氢酶(ldh)检测试剂盒、总超氧化物歧化酶(sod)测定试剂盒和丙二醛(mda)测定试剂盒购自南京建城生物工程研究所；
69.cdna反转录试剂盒和sybr预混合qpcr试剂盒购自爱科瑞生物技术有限公司；
70.96孔荧光定量pcr板和高透明度压敏qpcr密封膜购自莫纳生物技术有限公司；
71.用于液相色谱-质谱的溶剂均为质谱级，其他使用的化学品均为分析级。
72.实施例1
73.龟甲胶多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
74.(1)将100g龟板粉碎，加500ml水，加热至100℃回流提取3h，循环两次，停止加热后倒出提取液，采用真空过滤法过滤，得到滤液；
75.(2)将滤液加热至55℃并持续搅拌浓缩以防止炭化，直到变为类似凝胶状的流动状态，不能通过滤纸，得到凝胶状溶液；
76.(3)将凝胶状溶液倒入预称重的凝胶盘中，放入60℃烘箱中干燥24h，再放入干燥器中干燥48h，得到龟甲胶(tsg)；
77.(4)将1g龟甲胶加入20ml去离子水中溶解，再加入400单位碱性蛋白酶，调整温度为50℃、ph值为8.0酶解6h，得到酶解液；
78.(5)将酶解液加热至100℃煮沸10min灭酶，冷却至室温，然后以8000r/min的速度离心15min，收集上清液，即得龟甲胶多肽(tsghs)，命名为ah。
79.实施例2
80.龟甲胶多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
81.(1)将100g龟板粉碎，加500ml水，加热至100℃回流提取3h，循环两次，停止加热后倒出提取液，采用真空过滤法过滤，得到滤液；
82.(2)将滤液加热至55℃并持续搅拌浓缩以防止炭化，直到变为类似凝胶状的流动状态，不能通过滤纸，得到凝胶状溶液；
83.(3)将凝胶状溶液倒入预称重的凝胶盘中，放入60℃烘箱中干燥24h，再放入干燥器中干燥48h，得到龟甲胶(tsg)；
84.(4)将1g龟甲胶加入20ml去离子水中溶解，再加入400单位木瓜蛋白酶，调整温度为55℃、ph值为8.0酶解6h，得到酶解液；
85.(5)将酶解液加热至100℃煮沸10min灭酶，冷却至室温，然后以8000r/min的速度离心15min，收集上清液，即得龟甲胶多肽(tsghs)，命名为pah。
86.实施例3
87.龟甲胶多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
88.(1)将100g龟板粉碎，加500ml水，加热至100℃回流提取3h，循环两次，停止加热后倒出提取液，采用真空过滤法过滤，得到滤液；
89.(2)将滤液加热至55℃并持续搅拌浓缩以防止炭化，直到变为类似凝胶状的流动状态，不能通过滤纸，得到凝胶状溶液；
90.(3)将凝胶状溶液倒入预称重的凝胶盘中，放入60℃烘箱中干燥24h，再放入干燥器中干燥48h，得到龟甲胶(tsg)；
91.(4)将1g龟甲胶加入20ml去离子水中溶解，再加入400单位中性蛋白酶，调整温度为55℃、ph值为7.0酶解6h，得到酶解液；
92.(5)将酶解液加热至100℃煮沸10min灭酶，冷却至室温，然后以8000r/min的速度离心15min，收集上清液，即得龟甲胶多肽(tsghs)，命名为nh。
93.实施例4
94.龟甲胶多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
95.(1)将100g龟板粉碎，加500ml水，加热至100℃回流提取3h，循环两次，停止加热后倒出提取液，采用真空过滤法过滤，得到滤液；
96.(2)将滤液加热至55℃并持续搅拌浓缩以防止炭化，直到变为类似凝胶状的流动状态，不能通过滤纸，得到凝胶状溶液；
97.(3)将凝胶状溶液倒入预称重的凝胶盘中，放入60℃烘箱中干燥24h，再放入干燥器中干燥48h，得到龟甲胶(tsg)；
98.(4)将1g龟甲胶加入20ml去离子水中溶解，再加入400单位胃蛋白酶，调整温度为37℃、ph值为2.0酶解6h，得到酶解液；
99.(5)将酶解液加热至100℃煮沸10min灭酶，冷却至室温，然后以8000r/min的速度离心15min，收集上清液，即得龟甲胶多肽(tsghs)，命名为peh。
100.实施例5
101.龟甲胶多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
102.(1)将100g龟板粉碎，加500ml水，加热至100℃回流提取3h，循环两次，停止加热后倒出提取液，采用真空过滤法过滤，得到滤液；
103.(2)将滤液加热至55℃并持续搅拌浓缩以防止炭化，直到变为类似凝胶状的流动状态，不能通过滤纸，得到凝胶状溶液；
104.(3)将凝胶状溶液倒入预称重的凝胶盘中，放入60℃烘箱中干燥24h，再放入干燥器中干燥48h，得到龟甲胶(tsg)；
105.(4)将1g龟甲胶加入20ml去离子水中溶解，再加入400单位胰蛋白酶，调整温度为37℃、ph值为8.0酶解6h，得到酶解液；
106.(5)将酶解液加热至100℃煮沸10min灭酶，冷却至室温，然后以8000r/min的速度离心15min，收集上清液，即得龟甲胶多肽(tsghs)，命名为th。
107.性能测试
108.各取实施例1-5制得的龟甲胶多肽(tsghs)样品ah、pah、nh、peh和th，分别进行以下性能测试。
109.结果表示为“均值
±
标准差”。使用spss24进行数据处理，采用duncan的多重检验方法进行显著性分析，使用origin 2021进行绘图。统计显著性定义为p《0.05时具有显著差异。
110.1、tsghs氨基酸含量测定
111.(1)总氨基酸含量测定
112.参考gb5009.124-2016，分别称取5mg实施例1-5制得的tsghs样品于水解管中，加入6mol/l的盐酸溶液10ml，充氮后封管。在110℃油浴中水解22h，拿出冷却到室温，过滤，取1ml滤液60℃油浴脱酸，再加入1ml超纯水油浴蒸干两次，加入pbs缓冲液，混合均匀后用针管吸取少量，经0.22μm有机滤膜过滤，全自动氨基酸分析仪检测。结果如图1所示。
113.由图1可知，实施例1-5tsghs的总氨基酸组成基本相同。通常，甘氨酸在不同的水解物中含量最高，其次是谷氨酸、脯氨酸和丙氨酸。这可能是由于tsg中胶原蛋白含量较高所致。
114.(2)游离氨基酸含量测定
115.参考廖小微的方法，分别称取10mg实施例1-5制得的tsghs样品于离心试管中，加入5ml超纯水，常温提取30min，再加入10％磺基水杨酸，混合均匀，2-4℃冷藏60min以上沉淀蛋白，离心机10000r/min离心15min，取上层清液再次10000r/min离心15min，用针管吸取少量，经0.22μm有机滤膜过滤，全自动氨基酸分析仪检测。结果如图2所示。
116.由图2可知，ah和th具有较高的游离氨基酸含量，这是由于它们具有较高的溶解度和特定的酶裂解位点。胰蛋白酶的酶裂解位点位于精氨酸和赖氨酸，因此th中游离精氨酸和赖氨酸的含量高于其他水解物。不同的蛋白酶具有不同的裂解位点，导致产生不同大小、序列和生物特性的肽。碱性蛋白酶是一种内切酶，偏好裂解位于p1位置的不带电的非支链残基(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)。木瓜蛋白酶是另一种内切酶，具有广泛的特异性，偏好p2位置具有大的疏水侧链的氨基酸，如酪氨酸和苯丙氨酸，但不偏好p1位置的缬氨酸。胃蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶，主要作用于n-端芳香氨基酸。已经有报道称，由2-20个氨基酸残基组成的小分子肽是最具潜力的生物活性肽。蛋白水解物的氨基酸和肽组成是影响其生物活性的关键因素。
117.2、tsghs对肝癌细胞hepg2增殖的影响
118.取对数生长期的hepg2细胞以1
×
105/ml接种到96孔板中，在37℃、5％co2的培养箱中贴壁24h，分别加入5mg/ml实施例1-5制得的tsghs样品继续培养48h，同时设置空白组和对照组。每孔加入100μl配好的10％的cck-8溶液，置于培养箱中反应0.5-1h，使用酶标仪在450nm处测定吸光度值。结果如图3所示。
119.其中，细胞抑制率的计算公式为：细胞抑制率＝(a1-a2)/(a1-a0)
×
100％。其中，a0：空白组(不含细胞，只加dmem培养基)；a1：对照组(含有细胞，加dmem培养基)；a2：样品组(含有细胞，加含有tsghs样品的培养基)。
120.由图3可知，在浓度为5mg/ml的情况下，所有的tsghs都抑制了肝癌细胞hepg2的增殖，ah、pah、nh、peh和nh的抑制率分别为9.69％、26.33％、8.87％、32.92％和20.38％。其中，peh显示出最高的抑制率。chalamaiah曾报道，胃蛋白酶已被证明是从蛋白质中产生抗癌肽的最有效酶之一。胃蛋白酶只水解肽键，并偏好疏水性氨基酸，特别是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸残基。有报道称，这些氨基酸具有多种生物活性，包括抗氧化、免疫调节、抗癌等。因此，一个可能的机制是，在水解过程中，肽键被裂解，释放出最初隐藏在母体蛋白质核心中的具有生物活性的疏水性肽。这些肽有潜力抑制癌细胞系的生长，诱导凋亡，并破坏细胞周期。需要进一步对它们进行鉴定。
121.3、lc-ms/ms鉴定肽序列
122.分别使用超纯水溶解实施例1-5制得的tsghs样品，浓度为0.5mg/ml，充分混匀后过0.22μm有机滤膜后上机分析。
123.使用x500 lc-esi-q-tof高分辨液质联用(美国ab sciex公司)对样品进行分离和检测。流动相由0.1％(v/v)的甲酸水溶液(a)和乙腈(b)组成，洗脱方法如表1所示；流速0.05ml/min，进样量1μl，柱温40℃；质谱检测方法：扫描周期0.642s，esi离子源温度500℃，正离子模式，喷雾电压5500v，tof一级扫描范围100-1200da，二级扫描范围50-1200da，工作模式ida，最大候选离子数4，开启动态排除，其余参数使用蛋白质组学方法默认值。
124.表1梯度洗脱程序
125.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)09554955690103060403410904010904295552955
126.通过肽组学分析确定的所有目标肽段序列呈现在图4中，以说明肽段在样品中的分布情况。
127.由图4可知，实施例1-5tsghs中的肽段分布各不相同：ah含有139个肽段，pah含有19个肽段，nh含有52个肽段，peh含有17个肽段，th含有98个肽段。值得注意的是，ah有93个独特的肽段，pah有11个独特的肽段，nh有22个独特的肽段，peh有9个独特的肽段，th有22个独特的肽段。
128.4、差异肽分析与潜在生物肽的筛选
129.用upset venn图分析实施例1-5tsghs中肽的分布，利用生物活性肽的数据库及计算机虚拟筛选工具，分析、虚拟筛选及预测肽序列中的抗肿瘤肽和潜在的生物活性肽。使用peptideranker(http://distilldeep.ucd.ie/peptideranker/)对多肽的潜在生物活性进行排序，使用cpppred(http://distilldeep.ucd.ie/cpppred/)预测细胞通透性。
130.为了筛选潜在的生物活性肽段，计算了peptideranker得分、cpppred得分和相对峰面积，得分范围为0-1。其中，peptideranker是一个在线平台，用于预测和排名肽段的生物活性；cpppred是一种工具，用于预测细胞渗透性并根据肽段的细胞渗透性潜力进行排序。一般来说，较高的肽段含量对应较强的活性，肽段的峰面积在一定程度上可以反映其含量。观察到，具有较高的peptideranker得分的肽段通常具有较低的细胞渗透性，而具有较高的cpppred得分的肽段倾向于具有较低的肽段得分。biopep-uwm数据库是评估肽段潜在生物功能的有用资源，可以用于搜索具有相关生物功能的已报道肽段。肽段的生物活性主要依赖于其特定的结构特征，包括氨基酸组成、序列、链长、疏水性和净电荷。
131.在“tsghs对肝癌细胞hepg2增殖的影响”实验中，我们发现蛋白酶水解物peh具有最佳的抑制效果。因此，对peh中检测到的肽段进行了鉴定和筛选，筛选条件为peptideranker得分》0.4，cpppred得分》0.03，相对峰面积》1％，并且在biopep中没有找到
相同的抗肿瘤肽段作为过滤条件，结果得到4个肽段(fdf、fsg、lllpkp和ngy)，相关细节如表2所示。
132.表2酶解产物(peh)中的生物活性肽
[0133][0134]
注：上标字母表示显著差异，p《0.05。
[0135]
这些肽段将被用于后续的研究(如图5-12所示)。预测fdf和fsg在peh中具有较高的生物活性得分和较高的相对含量，这与由胃蛋白酶释放的生物活性肽段一致。
[0136]
5、多肽与肝癌靶点的预测及筛选
[0137]
采用chemdraw 20.0画出多肽的结构，在swiss target prediction数据库预测tsghs的靶点。以“liver cancer”为关键词，搜索genecards数据库、omim数据库中肝癌的潜在靶点，将数据库获取的靶点进行整合、去除重复值。并通过uniprort数据库将成分靶点与疾病靶点统一标准化。
[0138]
将四个肽段结构输入swiss target prediction数据库进行靶点预测。在去除重复靶点并合并后，共鉴定出184个潜在靶点。为了聚焦于与肝癌相关的靶点，从omim和genecards数据库中提取相关靶点，经过合并和去重后，共得到1852个与肝癌相关的靶点。通过将184个肽段靶点与1852个肝癌相关靶点进行比较，确定了57个共同的靶点。使用venny2.1生成venn图，表示这些共享的靶点。结果如图13所示。
[0139]
6、多肽-肝癌靶点的ppi网络构建
[0140]
将多肽与肝癌的交集靶点上传string数据库，选择物种为“homo sapiens”，设置靶点关联的置信度为0.40，分析得到ppi网络关系，并使用cytoscape 3.7.2软件，构建ppi网络图。利用软件中的centiscape插件分析，进行蛋白网络视觉化处理，包括连接度(degree)、介度(closeness)和紧密度(betweenness)，根据分析结果来判断主要靶点。
[0141]
将57个交集靶点导入string数据库进行ppi网络分析，然后使用cytoscape 3.7.2重新绘制ppi网络图，结果如图14所示。在cytoscape中使用centiscape插件进行蛋白网络可视化处理，并筛选出度、接近度和中介度高于平均值的靶点作为关键靶点。共鉴定出17个关键靶点，包括caspase-3(casp3)、il-1b、stat3、mmp9、src、ccnd1等，被认为是核心靶点。
[0142]
casp3是细胞凋亡通路的下游效应半胱氨酸蛋白酶，在包括肝脏在内的正常人组织中广泛表达。已经报道在各种人类恶性肿瘤中casp3的过表达和缺陷33。il-1b是一种多功能细胞因子，参与许多免疫和促炎反应。mmp9是mmp家族中的一个成员，共有23个家族成
员，对调节细胞内稳态起着重要作用34，异常的mmp9表达和其异常的活性参与了慢性炎症、肿瘤发生和转移等病理过程35-37，由于其与溃疡性结肠炎、结直肠癌等疾病的关联，mmp9已被作为多种疾病(包括癌症)的生物标志物进行检测，被视为治疗干预的潜在靶点。
[0143]
7、多肽-肝癌靶点的通路网络构建
[0144]
将多肽与肝癌的交集靶点与kegg富集的生物通路信息采用cytoscape 3.7.2构建多肽-肝癌靶点的通路网络图，利用软件中的centiscape插件分析，进行蛋白网络视觉化处理，包括连接度(degree)、介度(closeness)和紧密度(betweenness)，根据分析结果来判断核心成分与靶点。
[0145]
使用cytoscape 3.7.2软件构建“肽段-肝癌靶点的通路网络图”。利用cytoscape内置工具分析网络的拓扑参数和核心组分。在图15中，连接线表示三个组分之间的相互作用，节点的大小对应其对肝癌的影响程度。cytoscape网络分析显示，肽段ngy具有最高的连接性(37)、渗透性(0.2355)和中心性(0.5586)，表明它是tsg在肝癌治疗中的主要成分。紧随其后的是肽段fdf，具有连接性为33、渗透性为0.1484和中心性为0.5294。肽段fsg的连接性为30、渗透性为0.1599和中心性为0.5094。肽段lllpkp的连接性为16、介数中心性为0.0701和中心性为0.4197。
[0146]
8、多肽-肝癌go与kegg通路富集分析
[0147]
通过metascape数据库对多肽-肝癌的交集靶点进行生物功能分析，在metascape导入获取的多肽与肝癌的交集靶点，选定“homo sapiens”作为物种进行分析，分别选择kegg、go生物过程(biological processes，bp)、go分子功能(molecularfunction，mf)、go细胞成分(celluar components，cc)三个部分进行富集分析。将分析结果进行排序，以p≤0.01为筛选条件，将结果按照从小到大排序。
[0148]
metascape进行的go富集分析结果显示，tsg肝癌肽段主要富集于839个生物过程、86个分子功能和53种细胞分组，其中显示了前20个生物过程、分子功能和细胞分组(如图16-19所示)。
[0149]
图16显示了kegg通路富集分析的结果，显示了肝癌肽治疗的前20个信号通路，其中关键通路包括癌症通路、微小rna在癌症中的作用、tnf信号通路等。其中，癌症通路与靶点的相互连接最多，有27个，每个通路的富集靶点信息如表3所示。
[0150]
表3龟甲胶多肽治疗肝癌靶点通路富集结果
[0151]
godescriptionlog10(p)counthsa05200癌症途径-31.7227hsa05417脂质和动脉粥样硬化-17.4814hsa05203病毒性癌症-16.1013hsa04668肿瘤坏死因子信号通路-15.7411hsa04210凋亡-14.7911hsa05222小细胞肺癌-14.7910hsa05163人类巨细胞病毒感染-13.9312hsa05165人类乳头状瘤病毒感染-13.3713hsa05169epstein-barr病毒感染-12.8811hsa04657il-17信号通路-12.829
hsa04933糖尿病并发症中的age-rage信号通路-12.579hsa05145弓形虫病-12.129hsa01524铂类药物耐药性-11.928hsa05130致病性大肠杆菌感染-11.4310hsa05205癌症中的蛋白聚糖-11.2510hsa05215前列腺癌-10.908hsa05206癌症中的微小rna-10.8611hsa05171冠状病毒-covid-19-10.7210hsa05161乙型肝炎-10.669hsa04215多种物种的凋亡-10.516
[0152]
由表3可知，这些信号通路涉及凋亡、氧化应激和炎症。研究结果表明，当肝脏长时间暴露于氧化应激和炎症时，可能会造成肝脏损伤，甚至逐渐发展成为肝硬化和肝癌。氧化应激导致巨噬细胞的活化和促炎因子(如tnf-α、il-1b和il-6)的释放，导致炎症介导的肝损伤。此外，ros的积累还会改变线粒体膜通透性，导致细胞凋亡。线粒体介导的凋亡通路在半胱氨酸蛋白酶依赖的通路诱导的细胞凋亡中起着核心作用，细胞色素c的释放是线粒体介导的凋亡通路中的重要步骤之一，与线粒体膜电位(mmp)的降低相关。凋亡刺激导致线粒体膜通透性增加、mmp降低以及细胞色素c进入细胞质。细胞质中的细胞色素c激活caspase-3，这是众所周知的凋亡介导者，决定了凋亡级联反应中一些关键核靶标的裂解，如多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶，其裂解最终导致细胞凋亡。
[0153]
li等人应用网络药理学分析预测抗高血压活性的肽段靶点，发现kyphvf具有44个潜在靶点，证明其能够影响多个靶点和通路来降低血压。tao通过实验证明槲皮素通过上调mir-146a表达，在诱导caspase-3活化和线粒体依赖途径引发细胞凋亡的同时，对抑制人乳腺癌细胞增殖具有更好的效果，并通过下调egfr表达来抑制侵袭。yang通过实验证明山楂提取物具有抗氧化和抑制炎症的作用，通过调节氧化应激和抑制炎症，可以下调tnf-α和il-1b等炎症标志物的表达，因此对肝纤维化具有保护作用，有效减轻炎症和氧化应激。长期的肝纤维化发展可能导致肝硬化，甚至肝癌，因此及时进行抗纤维化治疗可以防止其进一步发展为肝癌。
[0154]
9、分子对接验证
[0155]
选择中度值排名前6的靶点，在蛋白质数据库pdb中下载靶点结构；多肽的结构使用chemdraw 22.0画出2d结构，再通过chem 3d 22.0转换为3d结构，使用autodock软件进行分子对接，运用pymol显示对接结果。
[0156]
使用autodock软件进行分子对接，评估肽段与靶点之间的结合亲和力。结合能表示活性成分与靶点之间的结合强度。结合能小于-5.0表示良好的结合活性，而小于-7.5表示优秀的结合活性。结果显示，90％的靶点的结合能小于-5.0，36.7％的靶点的结合能小于-7.5，表明大多数靶点与肽段之间具有良好的结合活性。分子对接的结合能结果通过热图进行表示，如图20所示。
[0157]
如表1所示，测定了这些肽段对hepg2细胞增殖的相对抑制率，观察到以下顺序：fdf》lllpkp》fsg》ngy。这个结果表明，fdf可能具有很好的抗癌效果。结合结合能结果，对fdf与六个靶点的对接结果进行了可视化处理，使用pymol软件，如图21-16所示。肽段fdf与
六个靶点的相互作用模式在结合位点的关键残基和氢键相互作用方面具有相似的特征。在fdf-casp3中，残基asp-228和leu-81与肽段形成氢键，而asp-228、tyr-276、phe-275、leu-81、asn-80、lys-224与肽段之间存在疏水作用，lys-82与肽段之间存在盐桥。在fdf-il1b中，fdf通过与受体中的lys-92、gln-48和glu-96残基的氢键相互作用以及与lys-94、lys-97和glu-96之间的疏水作用，以及与lys-94之间的盐桥位于结合位点。在fdf-stat3中，fdf通过与受体中的gln-247、gln-246、asp-334和pro-333残基的氢键相互作用以及与受体中的ile-258、ala-250、pro-256和pro-336的疏水作用位于结合位点。在fdf-mmp9中，fdf通过与受体中lys-214残基的氢键相互作用、与受体中tyr-248和phe-250的疏水作用以及与lys-214之间的盐桥位于结合位点。与其他靶点不同的是，tyr-218残基和肽段之间形成了π-π堆积。在fdf-src中，fdf通过与受体中的val-199、gln-528、arg-155和glu-159残基的氢键相互作用以及与受体中的lys-195、asn-198、leu-163和gln-526的疏水作用位于结合位点。在fdf-ccnd1中，fdf通过与受体中lys-123、gln-71、ile-117和thr-120残基的氢键相互作用以及与受体中lys-72和ile-117的疏水作用位于结合位点。可以看出，氢键、疏水作用和盐桥等分子间力可能在蛋白质-配体识别和稳定性中起关键作用，这有助于确定准确的结合模式。
[0158]
10、考察多肽对肝癌细胞ldh、sod活性以及mda浓度
[0159]
将处于对数生长期的hepg2细胞以2.5
×
105/ml接种到6孔板中，在37℃、5％co2的培养箱中贴壁24h，加入不同浓度的样品继续培养48h，同时设置空白组和对照组。吸取细胞的上清液，检验细胞的ldh含量。收集细胞破碎后，检测细胞内sod活性与mda含量。
[0160]
tsg多肽fdf诱导肝癌细胞释放ldh。作为一种重要的细胞内酶，ldh能够指示细胞损伤和凋亡状况。如图27所示，fdf处理能够显著促进ldh的释放，呈剂量依赖性，表明hepg2细胞系的凋亡。这与ma等人的研究结果一致，他们发现ndgnqpl导致ldh释放增加。
[0161]
fdf导致hepg2细胞的氧化损伤。作为典型的脂质过氧化物，mda水平能够指示脂质过氧化的程度，而细胞通过sod活性的大小来清除氧自由基，这两者均能够反映细胞内的氧化损伤。当细胞受损并发生氧化时，细胞内ros增加并积累，这是细胞凋亡的主要原因。与空白组相比，随着fdf浓度逐渐增加，细胞内mda含量持续增加(如图28所示)，而sod活性持续下降，表明随着fdf浓度的增加，细胞内的过氧化反应导致凋亡的发生(如图29所示)。
[0162]
fdf对hepg2细胞基因表达的影响。如图30-32所示，与空白组相比，多肽fdf显著增加了caspase-3mrna以及il-1β和tnf-αmrna的表达。
[0163]
caspase-3是一个众所周知的凋亡介导因子，它决定了凋亡级联反应中几个关键核心靶标的剪切。fdf通过上调hepg2细胞中的caspase-3mrna表达促进凋亡。tnf-α和il-1β是重要的促炎细胞因子。il-1β是il-1家族的重要成员，由于其在与炎症相关的疾病中的重要作用和强烈的促炎活性而备受关注。tnf-α是主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，参与正常的炎症和免疫反应，可以杀死肿瘤细胞而对正常细胞没有显著的伤害。zhang等人的研究发现，经过alpinoblastin(aif)处理的肝细胞癌细胞，il-1β和il-18的mrna表达显著上调，诱导细胞焦亡。类似地，龟胶多肽fdf也可以通过上调hepg2细胞中tnf-α和il-1β的mrna表达来发挥抗肝细胞癌的效应。
[0164]
综上所述，多肽fdf通过影响凋亡信号通路、氧化应激和炎症途径加速了hepg2细胞的凋亡，并实现了其抑制作用。
[0165]
11、实时荧光定量pcr实验
[0166]
细胞培养与前述相同。收集细胞后，使用trizol提取总rna，并检测rna的纯度和浓度。然后使用反转录试剂盒进行逆转录，获得cdna，再使用sybr预混合试剂盒进行实时pcr。反应体系为20μl。根据两步pcr反应程序，先在95℃下预变性30s，然后在95℃下变性5s，60℃下退火30s，共进行40个循环。引物序列见表表4，由启凯生物科技有限公司合成。
[0167]
表4pcr引物序列
[0168][0169]
12、结论
[0170]
本发明使用不同的蛋白酶制备了tsghs，导致不同的成分和生物活性。其中，胃蛋白酶水解的肽在体外展现出良好的抗癌效果。随后，在peh中鉴定并筛选出了四个肽段fdf、fsg、lllpkp和ngy，并通过体外生物活性预测验证了其潜在作用。根据网络药理学分析的结果，fdf可能具有潜在的抗肝癌能力，并通过hepg2肝癌细胞模型试验证实了这一点。fdf处理导致ldh释放增加、mda含量上调以及sod活性下降。此外，它还上调了hepg2细胞中caspase-3mrna、il-1β和tnf-αmrna的表达。
[0171]
由此可以得出结论，本发明发现了fdf、fsg、lllpkp和ngy抑制肝癌细胞增殖的潜在作用，并明确了fdf对肝癌细胞增殖的抑制作用。fdf通过影响细胞凋亡信号通路、氧化应激和炎症通路加速了肝癌细胞的凋亡，从而实现了抑制增殖的效果。这表明tsg肽在肝癌治疗方面具有潜在的抑制作用，为肝癌的治疗和tsg肽的新应用提供了新的研究思路。
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对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种龟甲胶多肽的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)将龟板粉碎，加水，加热回流提取，过滤，得到滤液；(2)将滤液加热并持续搅拌浓缩，得到凝胶状溶液；(3)将凝胶状溶液进行干燥，再次干燥，得到龟甲胶；(4)将龟甲胶加入水中溶解，再加入蛋白酶，调整温度和ph值进行酶解，得到酶解液；(5)将酶解液加热煮沸灭酶，冷却，离心，收集上清液，即得所述龟甲胶多肽。2.根据权利要求1所述的一种龟甲胶多肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述龟板和水的质量体积比为1g:5ml。3.根据权利要求1所述的一种龟甲胶多肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述加热回流提取的温度为100℃，时间为3h，次数为两次；所述过滤的方法为真空过滤法。4.根据权利要求1所述的一种龟甲胶多肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述加热至55℃。5.根据权利要求1所述的一种龟甲胶多肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述干燥的装置为烘箱，温度为60℃，时间为24h；所述再次干燥的装置为干燥器，时间为48h。6.根据权利要求1所述的一种龟甲胶多肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶；所述龟甲胶、水和蛋白酶的质量体积比为1g:20ml:400单位。7.根据权利要求1所述的一种龟甲胶多肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述温度为37-55℃；所述ph值为2.0-8.0；所述酶解的时间为6h。8.根据权利要求1所述的一种龟甲胶多肽的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述加热煮沸的温度为100℃，时间为10min；所述冷却至室温；所述离心的速度为8000r/min，时间为15min。9.一种如权利要求1-8任一项所述制备方法制得的龟甲胶多肽在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述龟甲胶多肽为fdf。

技术总结
本发明公开了一种龟甲胶多肽的制备方法，具体包括以下步骤：(1)将龟板粉碎，加水，加热回流提取，过滤；(2)加热并持续搅拌浓缩；(3)干燥，再次干燥；(4)加入水中溶解，再加入蛋白酶，调整温度和pH值进行酶解；(5)加热煮沸灭酶，冷却，离心，收集上清液，即得。本发明利用不同的酶制备了龟甲胶多肽(TSGH)，并结合网络药理学、分子对接技术和计算筛选方法预测和探索TSGH中潜在的抗癌肽。此外，本发明建立了肝癌细胞模型，研究所选和合成的肽在肝癌治疗和预防中的机制。本发明发现了FDF、FSG、LLLPKP和NGY抑制肝癌细胞增殖的潜在作用，并明确了FDF对肝癌细胞增殖的抑制作用。对肝癌细胞增殖的抑制作用。对肝癌细胞增殖的抑制作用。


技术研发人员：赵甜甜 张业辉 赵谋明 罗东辉 张友胜 焦文娟 刘伟峰 赖辰戎 许剑华
受保护的技术使用者：广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所
技术研发日：2023.08.14
技术公布日：2023/9/26