表小檗碱的新用途

1.本发明涉及骨疾病治疗技术领域，具体涉及表小檗碱在制备乳腺癌细胞诱导破骨细胞分化抑制剂中的用途。


背景技术：

2.乳腺癌是引起全世界妇女癌症死亡的第二大常见原因。超过3/4乳腺癌在疾病进展后期发生骨转移，诱发骨破坏病症。
3.据报导，83％乳腺癌患者首发转移部位为骨，超过90％的乳腺癌死亡患者中均发生了骨转移。肿瘤细胞转移入骨髓后沉积在骨组织中，与骨微环境中的成骨细胞、骨基质细胞和破骨细胞等相互作用诱导破骨细胞过度激活，打破骨吸收和骨新生的平衡，导致骨组织被破坏、侵蚀，最终造成骨溶解病变、引发病人剧烈疼痛和病理性骨折，严重降低病人的活动能力和生活质量。
4.因此，寻找稳定性好、安全性高的新型药物分子，抑制乳腺癌诱导产生破骨细胞、以及抑制转移性乳腺癌诱导的骨溶解，这关系到乳腺癌相关骨破坏疾病治疗的进展。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明提供了表小檗碱的新用途以及抑制乳腺癌细胞诱导破骨细胞分化的实验方法。
6.根据本发明的一个方面，提供了表小檗碱在制备乳腺癌细胞诱导破骨细胞分化抑制剂中的用途。
7.根据本发明的又一个方面，提供了表小檗碱在制备预防、治疗或改善转移性乳腺癌细胞引起的骨溶解疾病药物中的用途。
8.根据本发明的再一个方面，提供了一种抑制乳腺癌细胞诱导破骨细胞分化的实验方法，预先使用表小檗碱处理乳腺癌细胞；使用α-mem培养基共同培养处理后的所述乳腺癌细胞和破骨细胞前体细胞。
9.优选地，预先使用表小檗碱处理乳腺癌细胞，包括，使用含10％胎牛血清的培养基培养所述乳腺癌细胞，直至融合度达到60％；使用3.12μm浓度的表小檗碱处理所述乳腺癌细胞24h；使用1
×
磷酸盐缓冲盐水洗涤残留的表小檗碱。
10.根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防、治疗或改善转移性乳腺癌细胞引起的骨溶解疾病的药物，其特征在于，所述药物的原料组分含有表小檗碱。
11.优选地，表小檗碱在所述药物中的质量百分含量为0.05％-99.5％。
12.优选地，所述药物还含有在药学上可接受的辅料。
13.优选地，所述药物为口服制剂或非口服制剂。
14.优选地，所述口服制剂是胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂或膏剂中的一种或者多种。
15.优选地，所述非口服制剂是注射剂、霜剂、贴剂、软膏剂或喷雾剂中的一种或者多
种。
16.本发明提供了表小檗碱的新用途以及抑制乳腺癌细胞诱导破骨细胞分化的实验方法。本发明首次证明表小檗碱在较高浓度时仍未抑制破骨细胞前体细胞的增殖，其具有较高的生物安全性。另外，表小檗碱对乳腺癌诱导破骨细胞形成、以及转移性乳腺癌诱导的骨溶解具有显著的抑制作用。
附图说明
17.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本技术的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
18.图1示出了不同浓度表小檗碱对破骨细胞前体细胞增殖的影响；
19.图2示出了不同浓度表小檗碱对破骨细胞分化的影响；
20.图3示出了经表小檗碱处理的乳腺癌细胞对破骨细胞分化的影响；以及
21.图4示出了表小檗碱对骨转移性乳腺癌引起的骨溶解的影响。
具体实施方式
22.以下列举的实施例是为了让本领域的技术人员更清楚去理解本发明。需要说明的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用，仅作为说明性的实施例。以下实施例中所提及的原料、试剂或装置，如无特殊说明，均可从商业途径得到，或通过已知现有的方式获得。
23.通过天然产物提取分离是获取新药的重要途径，在1981～2010年间，美国食品与药品管理监督局(food and drug administration,fda)批准上市的药物中，34％来源于天然产物或其衍生物。天然产物作为药物的一个重要来源，拥有结构新颖多样和生物活性独特的特点。
24.中药黄连(coptidis rhizoma)是非常著名的传统中草药，有几千年的使用历史。表小檗碱，别名去氢辛乃克丁，是从黄连中分离提取得到的天然分子。本专利首次发现表小檗碱具有抑制rankl诱导破骨细胞分化与形成的作用。与小檗碱相比，表小檗碱在较高浓度时仍未抑制破骨细胞前体细胞的增殖，其具有较高的生物安全性(表小檗碱在浓度25μm不会抑制破骨细胞前体细胞的增殖，小檗碱在浓度接近20μm时会显著抑制破骨细胞前体细胞的增殖)。另外，表小檗碱对乳腺癌诱导破骨细胞形成、以及转移性乳腺癌诱导的骨溶解具有显著的抑制作用。
25.根据本发明的一个实施例，提供了表小檗碱在制备乳腺癌细胞诱导破骨细胞分化抑制剂中的用途。
26.根据本发明的在再一个实施例，提供了表小檗碱在制备预防、治疗或改善转移性乳腺癌细胞引起的骨溶解疾病药物中的用途。
27.根据本发明的又一个实施例，提供了一种抑制乳腺癌细胞诱导破骨细胞分化的实验方法，包括，步骤一：预先使用表小檗碱处理乳腺癌细胞；使用α-mem培养基共同培养破骨细胞前体细胞和经步骤一处理的所述乳腺癌细胞。其中，预先使用表小檗碱处理乳腺癌细胞，包括，使用含10％胎牛血清的培养基培养所述乳腺癌细胞，直至融合度达到60％；使用3.12μm浓度的表小檗碱处理所述乳腺癌细胞24h；使用1
×
磷酸盐缓冲盐水洗涤残留的表小
檗碱。
28.根据本发明的另一个实施例，提供了一种用于预防、治疗或改善转移性乳腺癌细胞引起的骨溶解疾病的药物，所述药物的原料组分含有表小檗碱。表小檗碱在所述药物中的质量百分含量为0.05％-99.5％。，所述药物还含有在药学上可接受的辅料。所述药物为口服制剂或非口服制剂。
29.所述口服制剂是胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂或膏剂中的一种或者多种。所述非口服制剂是注射剂、霜剂、贴剂、软膏剂或喷雾剂中的一种或者多种。
30.药学上可接受的辅料例如使用作为制剂材料常用的各种有机或无机载体物质，在固体制剂中作为赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、增稠剂；在液态制剂中作为溶剂、分散剂、增溶剂、悬浮剂、张力剂、缓冲剂、止痛剂等适当适量调配。另外，可根据需要，按照常规方法使用防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂等添加物。
31.赋形剂的优选示例例如可举例乳糖、白糖、d-甘露醇、淀粉、结晶纤维素、轻质无水硅酸等。润滑剂的优选示例例如可举例硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、胶体二氧化硅等。粘合剂的优选示例例如可举例结晶纤维素、白糖、d-甘露醇、糊精、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂的优选示例例如可举例淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基淀粉钠等。增稠剂的优选示例例如可举例天然树胶类、纤维素衍生物、丙烯酸聚合物等。溶剂的优选示例例如可举例注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油等。分散剂的优选示例例如可举例吐温80、hco 60、聚乙二醇、羧甲基纤维素、海藻酸钠等。增溶剂的优选示例例如可举例聚乙二醇、丙二醇、d-甘露醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。悬浮剂的优选示例例如可举例硬脂基三乙醇胺、月桂基硫酸钠、月桂基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等。表面活性剂的优选示例例如可举例聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等亲水性高分子等。张力剂的优选示例例如可举例氯化钠、甘油、d-甘露醇等。缓冲剂的优选示例例如可举例磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等。止痛剂的优选示例例如可举例苯甲醇等。防腐剂的优选示例例如可举例对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢醋酸、山梨酸等。抗氧化剂的优选示例例如可举例亚硫酸盐、抗坏血酸等。
32.实施例1
33.化合物表小檗碱没有抑制破骨细胞前体细胞的正常增殖
34.为了分析表小檗碱在体外对破骨细胞前体细胞(骨髓来源的巨噬细胞，bmms)增殖的影响。取处于对数增长期的bmms接种于96孔板(5000个细胞/孔，100μl/孔)。贴壁生长过夜后，加入100μl/孔带药新鲜培养液(α-mem中添加10％牛血清、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素、30ng/ml m-csf)，每个剂量3个平行孔，37℃、5％ co2条件下培养48小时。每孔加入50ml冷的50％(w/v)三氯乙酸(tca)，4℃固定1小时。弃固定液，用低流速的蒸馏水冲洗5遍，空气中自然干燥。每孔加入100μl/0.4％(w/v)srb溶液，室温下染色10分钟。弃上清，用1％乙酸冲洗5遍以去除非特异性结合的染料，空气中自然干燥。每孔加入200μl 10mm tris溶液(ph 10.5)。震荡5分钟后在515nm波长下测od值，绘制药物浓度与对相对细胞数量的拟合曲线并计算50％抑制浓度(ic50)。结果如图1显示，表小檗碱没有抑制破骨细胞前体细胞的正常增殖，即其对bmms无细胞毒性。
35.实施例2
36.化合物表小檗碱抑制破骨细胞的分化与形成
37.为了分析表小檗碱在体外对破骨细胞分化的影响，本专利从c57bl/6小鼠中提取了bmms。取处于对数增长期的bmms接种于96孔板(5000个细胞/孔，100μl/孔)。贴壁生长过夜后，加入100μl/孔带药新鲜培养液(α-mem中添加10％牛血清、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素、30ng/ml m-csf和100ng/ml rankl)，每个剂量3个平行孔，37℃、5％ co2条件下培养。培养基每2天更新一次，直到多核破骨细胞分化形成。细胞用冷的1
×
磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤3次，4％多聚甲醛(pom)固定15分钟，用抗酒石酸(trap)染色。trap阳性细胞会出现三个以上的细胞核，即被鉴定为破骨细胞。在显微镜下计算破骨细胞的数量和面积。结果如图2显示，化合物表小檗碱抑制破骨细胞的分化与形成。
38.实施例3
39.化合物表小檗碱抑制乳腺癌细胞诱导破骨细胞的形成和功能如图3a，提取乳腺癌条件培养基(cm)后，将进行了一系列实验。首先，让乳腺癌mda-mb-231细胞在含有10％胎牛血清的培养基中生长到60％的融合度。然后，用3.12μm表小檗碱处理细胞24h。然后，再用无血清α-mem培养基，继续培养基24小时后。提取培养基并过滤后，添加到新的培养基中(20％v/v)。具体而言，步骤一：预先使用表小檗碱处理乳腺癌细胞，将处理后的所述乳腺癌细胞使用无血清α-mem培养基继续培养24小时；步骤二：提取步骤一中的产物并过滤，将获得的滤液按照20％v/v的比例添加至有血清α-mem培养基中(α-mem中添加10％牛血清、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素、30ng/ml m-csf、50ng/ml rankl)并添加破骨细胞前体细胞继续培养。
40.研究结果表明，未经表小檗碱处理的mda-mb-231细胞cm能明显促进破骨细胞的形成和骨吸收功能。然而，经表小檗碱处理后的mda-mb-231细胞cm，其诱导破骨细胞分化和骨吸收功能的作用，明显受到抑制。这些数据表明，表小檗碱抑制mda-mb-231细胞cm诱导的破骨细胞分化和功能。
41.实施例4
42.化合物表小檗碱抑制乳腺癌细胞诱导的骨溶解
43.为了确定表小檗碱是否能抑制骨转移性乳腺癌引起的骨溶解，本专利向6-8周龄的健康雌性balb/c小鼠胫骨骨髓腔内注射鼠源乳腺癌4t1细胞。具体如下，经腹膜注射3.5％水合氯醛麻醉后，将4t1细胞悬液(1
×
105个/50μl)50μl经胫骨平台注入右胫骨近侧腔。然后将这些小鼠随机分为不同的组：对照组(n＝10)和表小檗碱组(n＝10)。表小檗碱组每天腹腔给予小檗碱2.5mg/kg。然而，对照组只给予腹腔注射pbs。16天后，对小鼠实施安乐死。为了进一步检查转移性乳腺癌细胞诱导的骨溶解，本专利进行了micro-ct检查。如图4所示，对照组中观察到明显的骨溶解性破坏。相比之下，表小檗碱治疗组的骨溶解病变较少，且骨皮质较完整。这些数据表明，表小檗碱对转移性乳腺癌细胞引起的骨溶解具有保护作用。
44.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.表小檗碱在制备乳腺癌细胞诱导破骨细胞分化抑制剂中的用途。2.表小檗碱在制备预防、治疗或改善转移性乳腺癌细胞引起的骨溶解疾病药物中的用途。3.一种抑制乳腺癌细胞诱导破骨细胞分化的实验方法，其特征在于，步骤一：预先使用表小檗碱处理乳腺癌细胞，将处理后的所述乳腺癌细胞使用无血清α-mem培养基继续培养；步骤二：提取步骤一中的产物并过滤，将获得的滤液添加至有血清α-mem培养基中(α-mem中添加10％牛血清、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素、30ng/ml m-csf、50ng/ml rankl)并添加破骨细胞前体细胞继续培养。4.根据权利要求3所述的实验方法，其特征在于，步骤一：预先使用表小檗碱处理乳腺癌细胞，包括使用含10％胎牛血清的培养基培养所述乳腺癌细胞，直至融合度达到60％；使用3.12μm浓度的表小檗碱处理所述乳腺癌细胞24h；使用1
×
磷酸盐缓冲盐水洗涤残留的表小檗碱。5.一种用于预防、治疗或改善转移性乳腺癌细胞引起的骨溶解疾病的药物，其特征在于，所述药物的原料组分含有表小檗碱。6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，表小檗碱在所述药物中的质量百分含量为0.05％-99.5％。7.根据权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，所述药物还含有在药学上可接受的辅料。8.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物为口服制剂或非口服制剂。9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述口服制剂是胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂或膏剂中的一种或者多种。10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述非口服制剂是注射剂、霜剂、贴剂、软膏剂或喷雾剂中的一种或者多种。

技术总结
本发明公开了表小檗碱的新用途以及抑制乳腺癌细胞诱导破骨细胞分化的实验方法。本发明首次证明表小檗碱在较高浓度时(25μM)不会抑制破骨细胞前体细胞的增殖，其具有较高的生物安全性。另外，表小檗碱对乳腺癌诱导破骨细胞形成、以及转移性乳腺癌诱导的骨溶解具有显著的抑制作用。著的抑制作用。著的抑制作用。


技术研发人员：马文哲 韦诚明 林婉君 王姊 张富铭 石美娜 刘家琛 黄紫烽 张雪宁 杨彦超 刘贝佳
受保护的技术使用者：澳门科技大学
技术研发日：2023.08.14
技术公布日：2023/9/26