靶向沉默DMT1基因的shRNA干扰序列、重组腺相关病毒载体及构建方法与应用

靶向沉默dmt1基因的shrna干扰序列、重组腺相关病毒载体及构建方法与应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向沉默dmt1基因的shrna干扰序列、重组腺相关病毒载体及构建方法与应用。


背景技术：

2.血友病(hemophilia)是一类以先天性凝血因子(fviii或fix)缺乏为主要发病机制的x连锁隐性遗传出血性疾病。患者由于凝血功能障碍，多表现为出血后持续不止甚至无明显损伤下的自发出血，其中又以关节内出血为多见。超过一半的重度血友病患者会因为关节多次积血而出现持续性关节疾病—血友病性关节病(血友病性关节炎)，其中膝关节、肘关节和踝关节最常受累。
3.关节出血后红细胞破裂所释放出的大量铁被认为是血友病性关节病发生的重要因素。一方面，铁刺激滑膜细胞增生和滑膜炎症，释放il-1β和tnf-α等炎症因子，进而引起软骨损伤；另一方面铁可以直接损伤软骨细胞。软骨细胞内介导铁内流的主要离子通道是二价金属转运体1(dmt1)。我们课题组发现铁过载可以加速软骨细胞的骨关节炎进程，而敲低dmt1不仅能减缓il-1β干预后的软骨细胞铁离子内流，而且有助于软骨表型的恢复。
4.鉴于此，我们设计了腺相关病毒(aav)作为载体携带针对dmt1的小干扰rna序列，并通过关节腔注射的方式缓解关节出血后铁过载从而保护关节软骨和周围组织。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有背景技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种靶向沉默dmt1基因的shrna干扰序列、重组腺相关病毒载体及构建方法与应用。本发明通过实验证明了利用腺相关病毒(aav)作为载体携带dmt1-shrna序列，可以显著减轻小鼠膝关节退变程度，这为血友病性关节病提供了一种新的靶向dmt1的治疗策略，进一步为开发出新型的可有效治疗血友病性关节病的药物奠定基础。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种靶向沉默dmt1基因的shrna干扰序列，所述shrna干扰序列包括正链序列和反链序列，所述正链序列如seq id no.1所示，所述反链序列如seq id no.2所示。
7.本发明同时提供上述靶向沉默dmt1基因的shrna干扰序列在制备治疗血友病性关节病药物方面的应用。
8.本发明还提供一种包含所述的靶向沉默dmt1基因的shrna干扰序列的重组腺相关病毒载体。
9.以及所述重组腺相关病毒载体在制备治疗血友病性关节病药物方面的应用。
10.优选地，所述重组腺相关病毒载体包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9在内的病毒的各种血清型。
11.本发明还提供一种重组腺相关病毒载体的构建方法，包括：
12.s1、选择用于重组腺相关病毒载体构建的干扰载体；
13.s2、干扰靶点设计：根据目的基因dmt1序列设计特异性的载体shrna序列和对照病毒载体shrna序列；
14.s3、引物退火形成带粘性末端的双链片段：引物是由生物公司合成page纯化的oligo序列，按照一定程序进行退火生成粘性末端；
15.s4、载体酶切：选用合适的限制性内切酶进行酶切载体，琼脂糖凝胶回收得到纯化的线性化载体；
16.s5、干扰片段与载体连接：将线性化载体和目的片段按照t4连接的方法进行连接；
17.s6、转化：转化感受态dh5a，菌液涂板，培养12-16h；
18.s7、筛选及验证：挑选单克隆行进菌落验证，对菌落验证正确的阳性克隆进行测序；
19.s8、质粒抽提:测序正确的克隆样品进行质粒抽提；
20.s9、共转染：将三质粒共转染293t细胞；
21.s10、病毒收集、纯化：转染后72h收集细胞沉淀，用柱纯化方式得到高滴度的腺相关病毒保存液；
22.s11、病毒滴度的测定：采用实时荧光定量pcr法来检测aav基因组含量优选地，
23.其中，步骤s1中所用干扰载体为phbaav-u6-mcs-cmv-egfp载体。
24.其中，步骤s2中病毒载体shrna序列如下
25.对照病毒载体gfp-shrna
26.正链序列：
27.gatccgttctccgaacgtgtcacgtaattcaagagatacgtgacacgttcggagaattttttc(seq id no.3)
28.反链序列
29.aattgaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgaattacgtgacacgttcggagaacg(seq id no.4)
30.病毒载体dmt1-shrna
31.正链序列：
32.aattcgcacctactttgatgagaaattcaagagatttctcatcaaagtaggtgttttttg(seq id no.1)
33.反链序列
34.gatccaaaaaacacctactttgatgagaaatctcttgaatttctcatcaaagtaggtgcg(seq id no.2)
35.其中，步骤s7中测序结果如下：
36.gggaatttcggatttcttggctttatatatcttgtggaaggacgaaacaccggtccgcagaattcgcacctactttgatgagaaattcaa
37.gagatttctcatcaaagtaggtgttttttggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatca
38.attacggggtcattagttcatagcc，与目的序列完全一致。
39.其中，步骤s9中所使用的三质粒腺相关病毒系统包括以下质粒：携带目的基因或
shrna的载体质粒、paav-rc载体质粒、phelper载体质粒。
40.其中，步骤s11中测得的aav2-shrna-dmt1的滴度为1.3*10^12vg/ml。
41.本发明还提供一种药物组合物，其包含所述的重组腺相关病毒载体。
42.优选地，所述药物组合物的给药方式为注射。
43.本发明取得的有益效果如下：
44.本发明利用腺相关病毒(aav)作为载体，携带dmt1-shrna序列。与已经用于临床的其他腺病毒载体相比，aav在注射后引起的免疫反应较微弱且持续时间较短。即使是高剂量的全身性使用，尤其是静脉注射也很少有感染细胞后被免疫系统清除的情况发生。
45.本发明腺相关病毒载体搭载的是dmt1的干扰序列，研究发现dmt1通过介导软骨细胞铁离子内流，在软骨细胞铁死亡及骨关节炎进展中发挥关键调控作用。本发明通过靶向敲低该基因，缓解血友病关节出血后铁过载，从而挽救关节出血导致的软骨损伤。
46.本发明通过膝关节腔注射操作，靶向局部组织特异性强，且方便易行，操作简单。
附图说明
47.图1是所选用的干扰载体phbaav-u6-mcs-cmv-egfp载体图谱；
48.图2是选择菌落验证正确的阳性克隆进行测序的结果比对分析图；
49.图3是病毒滴度测定标准曲线图；
50.图4是aav-shrna-gfp组和aav-shrna-dmt1组膝关节micro-ct三维重建结果图；
51.图5是aav-shrna-gfp组和aav-shrna-dmt1组膝关节组织切片番红固绿染色和骨关节炎评分结果图；
52.图6是重组腺相关病毒注射4周后膝关节软骨dmt1、col2a1、mmp13免疫组织化学检测结果图；
53.图7是aav-shrna-gfp组和aav-shrna-dmt1组膝关节组织切片he染色结果图；
54.图8是aav-shrna-gfp组和aav-shrna-dmt1组膝关节组织切片dab加强法普鲁士蓝染色结果图。
具体实施方式
55.以下结合附图、实施例和实验例对本发明作进一步的详细描述。当然，本发明的保护范围并不限于下述实施例。本领域专业技术人员能够理解，在不背离本发明精神的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但本发明仍然在此作尽可能详细的描述。以下实施例是进一步说明本发明，而不是限制本发明。任何依据本发明构思所作出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本发明技术方案的范畴。
56.下述实施例中所述试验方法或测试方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均从常规商业途径获得，或以常规方法制备。
57.除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员常理解的相同含义。
58.目前，血友病性关节病的治疗主要依赖于外源性viii因子补充和疾病晚期的关节
置换术，对于出血后造成的关节损伤缺乏有效的药物缓解疗法。因此，有必要深入探究血友病性关节病的发病机制，发现新的治疗靶点，进而开发出有效的治疗药物。
59.术语的定义和使用
60.重组腺相关病毒载体：在本发明中，重组腺相关病毒载体是指包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9在内的病毒的各种血清型
61.个体：在本发明中，术语“个体”指哺乳动物，包括但不限于大鼠、小鼠、非人灵长类、人、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊。优选为人或小鼠。
62.治疗：
63.本发明所述“治疗”是指降低血友病性关节病软骨退变的程度，或者治愈使之正常化，或者减缓血友病性关节病的进程。
64.本发明通过以下实施例证实了通过重组腺相关病毒载体抑制关节软骨中dmt1表达，可以明显缓解血友病性关节病。
65.为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个环节，接下来结合附图介绍本发明的具体实施方式。
66.实施例1构建靶向沉默dmt1基因的重组腺相关病毒
67.1、干扰载体及干扰序列设计
68.干扰载体信息：phbaav-u6-mcs-cmv-egfp，载体图谱见图1。
69.干扰序列：
70.对照病毒载体gfp-shrna
71.正链序列：
72.gatccgttctccgaacgtgtcacgtaattcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttc(seq id no.3)
73.反链序列：
74.aattgaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgaattacgtgacacgttcggagaacg(seq id no.4)
75.病毒载体dmt1-shrna
76.正链序列：
77.aattcgcacctactttgatgagaaattcaagagatttctcatcaaagtaggtgttttttg(seq id no.1)
78.反链序列：
79.gatccaaaaaacacctactttgatgagaaatctcttgaatttctcatcaaagtaggtgcg(seq id no.2)
80.2、载体酶切：配置40ul酶切体系，包括：ddh2032ul,10xbuffer4ul,病毒载体dna(lug/ul)1ul,限制性内切酶11.5ul,限制性内切酶21.5ul。根据一定顺序依次加入每种试剂，轻轻吸打混匀，置于37℃水浴锅中反应1-2h；酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。
81.3、干扰片段与载体连接：配置20ul连接体系，包括：退火产物4ul,酶切好的载体v(≥50ng),t4ligasebuffer2ul，t4ligase1ul，ddh2o13-v,以上连接液在22℃连接1-2h，或者16℃连接过夜。
82.转化：1)dh5α感受态细胞从-80℃冰箱拿出来之后，立刻放到冰上融化，感受态分装过程操作轻柔，减轻对其机械破坏；2)待感受态融化后，以每管50ul的体积分装，分装之后以不超过感受态体积1/10的量加入连接产物(目前加5ul连接产物)，冰上放置20-30min；3)将水浴温度设为42℃，持续加热1.5分钟。然后立即将其插入冰上进行冰育，持续2-3分钟。在超净台上，向其中加入500微升lb培养基，并轻轻地上下颠倒3-5次；4)37℃、230rpm震荡培养45-60min；5)将菌液涂到相应抗性的固体平板上，涂布均匀，然后将板子倒放37℃恒温箱培养12-16h。
83.菌落验证及测序：配置菌液pcr鉴定体系，对菌落验证正确的阳性克隆进行测序，图2是测序验证结果，比对结果表示测序准确。
84.实施例2重组腺相关病毒的包装与病毒滴度检测
85.2.1细胞株：包装细胞株为293t，腺相关病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，使用的生长培养基为含10％fbsdmem。
86.2.2腺相关病毒包装系统：三质粒系统，paav-rc、phelper和穿梭质粒(携带目的基因或者shrna)。
87.2.3腺相关病毒包装：为了进行转染，将aav-293细胞传代到一个直径为100毫米的培养皿中。完成传代后，将培养皿放置在37℃、5％co2和95％相对湿度的培养箱中，直到细胞密度达到约80～90％的汇合率，即可进行转染。脂质体转染流程如下：optimem需在37℃水浴中预热，lipofitertm转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染100mm平皿所需的转染复合物成分如下：
[0088][0089]
转染后的6小时，使用含有10％胎牛血清(fbs)的新鲜完全培养基进行一次培养基更换。转染后的72小时，使用细胞刮轻轻将含有aav颗粒的细胞刮下，并收集到一个15毫升离心管中。将离心管以150g的离心力离心3分钟，收集细胞，去除培养上清，然后用pbs洗涤一次，最后使用300微升pbs将细胞重悬。准备一个37℃的恒温水浴锅和液氮。将装有细胞的离心管在液氮和37℃水浴之间反复冻融三次。然后在4℃下，以2000g的离心力离心5分钟，去除细胞碎片，收集含有aav颗粒的裂解上清液。
[0090]
2.4腺相关病毒纯化：
[0091]
每1ml病毒粗提物中加入0.1μlbenonase酶，37℃水浴1h，除去病毒液中的细胞基因组及残留的质粒dna。600
×
g，4℃，离心10min，取上清。根据biomiga腺相关病毒纯化试剂盒v1469-01进行柱纯化。将柱纯化得到的4mlaav病毒样品液体，加入到超滤管中，1400
×
g离心3016min，得到约1mlaav。收集最终得到的纯化后的病毒，于﹣80℃保存。
[0092]
2.5腺相关病滴度检测：
[0093]
本实施例中采用sybrgreen法来检测aav基因组含量，从而测定aav滴度。计算病毒
滴度采用的标准曲线如图3所示。根据标准曲线计算所得的病毒滴度分别为：
[0094]
aav2-dmt1-shrna 1.3*10^12vg/ml
[0095]
aav2-shrna-gfp对照1.7*10^12vg/ml
[0096]
实施例3dmt1-shrna重组腺相关病毒制剂在缓解血友病性关节病软骨退变中的应用
[0097]
1.血友病小鼠膝关节注射重组腺相关病毒制剂：
[0098]
采用12只8周龄雄性血友病(fviii敲除)小鼠，随机分组为：aav2-dmt1组(n＝6)，接受膝关节腔注射2.4e+10vg的aav2-dmt1-shrna制剂(实施例2制备)；aav2-nc组(n＝6)，接受膝关节腔注射2.4e+10vg的aav2-shrna-gfp空载质粒对照。
[0099]
2.血友病小鼠膝关节标本固定、脱钙、切片、染色：
[0100]
病毒制剂膝关节腔注4周后，处死小鼠，并取膝关节标本进行micro-ct扫描。扫描完成后对标本进行脱钙和切片。对组织切片进行番红固绿染色以及免疫组化实验，检测dmt1的组织表达。膝关节micro-ct三维重建结果(图4)显示dmt1敲低组膝关节周围骨赘减少，关节破坏状况较轻；番红固绿染色结果(图5)显示dmt1敲低组软骨裂隙、磨损明显减少；免疫组织化学染色结果(图6)证实aav2-dmt1组关节软骨dmt1、mmp13表达显著降低，而col2a1表达有所恢复。he染色显示aav2-dmt1组滑膜炎症相较于对照组有明显改善(图7)，同时dab增强法普鲁士蓝染色显示其滑膜组织铁沉积显著减少(图8)。
[0101]
以上实验结果表明aav-dmt1-shrna可以降低膝关节软骨组织dmt1表达，减少关节软骨铁沉积，并且有利于缓解血友病性关节病造成的软骨破坏。
[0102]
以上内容描述了本发明的基本技术手段和基本原理。本发明的保护范围不受上面所举的3个实施例的限制。本专业的技术人员在没有做其他创新性工作前提下所获得的其他实施例均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种靶向沉默dmt1基因的shrna干扰序列，其特征在于：所述shrna干扰序列包括正链序列和反链序列，所述正链序列如seq id no.1所示，所述反链序列如seq id no.2所示。2.一种权利要求1所述的靶向沉默dmt1基因的shrna干扰序列在制备治疗血友病性关节病药物方面的应用。3.一种包含权利要求1所述的靶向沉默dmt1基因的shrna干扰序列的重组腺相关病毒载体。4.一种权利要求3所述的重组腺相关病毒载体在制备治疗血友病性关节病药物方面的应用。5.根据权利要求3所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：所述重组腺相关病毒载体包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9在内的病毒的各种血清型。6.一种如权利要求3所述的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，包括：s1、选择用于重组腺相关病毒载体构建的干扰载体；s2、干扰靶点设计；s3、引物退火形成带粘性末端的双链片段；s4、载体酶切；s5、干扰片段与载体连接；s6、转化；s7、筛选及验证；s8、质粒抽提；s9、共转染；s10、病毒收集、纯化；s11、病毒滴度的测定。7.根据权利要求6所述的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于：步骤s1中所用干扰载体为phbaav-u6-mcs-cmv-egfp载体。8.根据权利要求6所述的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于：步骤s11中测得的aav2-shrna-dmt1的滴度为1.3*10^12vg/ml。9.一种药物组合物，其特征在于：包含权利要求3所述的重组腺相关病毒载体。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的给药方式为注射。

技术总结
本发明公开一种靶向沉默DMT1基因的shRNA干扰序列、重组腺相关病毒载体及构建方法与应用，属于分子生物学技术领域。所述shRNA干扰序列包括正链序列和反链序列，所述正链序列如SEQ ID NO.1所示，所述反链序列如SEQ ID NO.2所示。本发明腺相关病毒载体搭载的是DMT1的干扰序列，研究发现DMT1通过介导软骨细胞铁离子内流，在软骨细胞铁死亡及骨关节炎进展中发挥关键调控作用。本发明通过靶向敲低该基因，缓解血友病关节出血后铁过载，从而挽救关节出血导致的软骨损伤。导致的软骨损伤。导致的软骨损伤。


技术研发人员：郭风劲 孙凯 刘海港 朱波 秦亮
受保护的技术使用者：华中科技大学同济医学院附属同济医院
技术研发日：2023.08.15
技术公布日：2023/9/26