大鲵胶原蛋白肽的用途的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质及其用途。


背景技术：

2.大鲵(andrias davidianus)是隐腮鲵科、大鲵属的有尾两栖动物，又称娃娃鱼，是一种高营养价值的两栖类动物，被誉为“水中人参”。大鲵的皮和肉中均含有丰富的胶原蛋白。胶原蛋白是一种纤维性蛋白质，经水解后生成胶原蛋白肽以及副产品氨基酸。近年来，胶原蛋白肽因其显著的生物功能活性，被越来越多地应用于各种护肤品、保健品、药物及食品。
3.大鲵胶原蛋白肽的制备方法主要包括酸水解、碱水解和酶解法。参见cn111772195a，其中公开了经碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶的三段式酶解制备大鲵胶原蛋白肽的方法。
4.除一般的胶原蛋白肽具有的多种生理活性功能外，大鲵胶原蛋白肽还具有修复上皮细胞，促进伤口愈合，保护肝脏损伤，促进皮肤细胞增殖活性以及增强免疫力的特殊功效。然而，大鲵胶原蛋白肽的抗肿瘤活性还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明发现大鲵胶原蛋白肽显示出体外和体内对于癌细胞增殖的显著抑制作用。因此，本发明提供了大鲵胶原蛋白肽在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。
6.第一方面，本发明提供了大鲵胶原蛋白肽在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。
7.在一些实施方案中，所述大鲵胶原蛋白肽来自于大鲵(andrias davidianus)，具体地，来自于大鲵皮和/或大鲵肉和/或大鲵骨。
8.在一些实施方案中，所述大鲵胶原蛋白肽来自去除脂肪和非胶原蛋白的大鲵皮和/或大鲵肉和/或大鲵骨。
9.在一些实施方案中，所述大鲵胶原蛋白肽经由酸水解、碱水解和/或酶解法制备。
10.在一些实施方案中，所述酶是碱性蛋白酶，并且，在ph 9～11的条件下进行蛋白酶解。
11.优选地，在蛋白酶解后，对蛋白酶解后的上清或其干燥物进行醇沉。
12.在一些实施方案中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，链蛋白酶，胶原蛋白酶和/或胰蛋白酶。
13.在一些实施方案中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和/或胰蛋白酶。
14.在一些实施方案中，所述大鲵胶原蛋白肽由去除脂肪和非胶原蛋白的大鲵皮和/或大鲵肉和/或大鲵骨经碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶的三段式酶解制得。
15.在一些实施方案中，所述三段式酶解中，各段酶解的反应温度均不高于60℃，优选地在40～60℃的范围内。
16.在一些实施方案中，所述三段式酶解中，各段酶解的ph值控制为6～9。
17.优选地，经酸水解、碱水解和/或酶解法制备或经三段式酶解法制备的大鲵胶原蛋白肽还可以进一步精制，优选，经初滤、活性炭吸附、精滤和/或干燥处理。
18.优选地，经酸水解、碱水解和/或酶解法制备或经三段式酶解法制备的大鲵胶原蛋白肽经透析膜过滤进行进一步的纯化。
19.从大鲵皮和/或大鲵肉去除脂肪和非胶原蛋白可经常规方法进行，例如经碱液浸泡法去除脂肪和非胶原蛋白。优选地，所述碱液为氢氧化钠或碳酸氢钠。
20.在一些实施方案中，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为100～4000道尔顿。优选地，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为500～3000道尔顿。更优选地，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为800～2500道尔顿。更优选地，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为800～1500道尔顿。较小分子量的大鲵胶原蛋白肽更有利于人体的吸收。
21.优选地，所述大鲵胶原蛋白肽为疏水性小分子肽，从而具有更强的生物活性。
22.本发明发现，所述的大鲵胶原蛋白肽可以通过抑制经典pi3k/akt信号通路发挥作用。
23.所述大鲵胶原蛋白肽能够抑制与经典pi3k/akt信号通路相关的肿瘤。
24.在一些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于良性或恶性肿瘤、实体肿瘤、结肠直肠癌、脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、胃肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、阴道癌、宫颈癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、食道癌、喉癌、皮肤癌、骨癌或甲状腺癌、肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、颈部和头部的肿瘤、表皮过度增生、角化棘皮瘤、表皮样癌、大细胞癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏(hodgkins)和非霍奇金氏淋巴瘤、滤泡癌、未分化性瘤、乳头状癌、精原细胞瘤、黑色素瘤、髓性多发性骨髓瘤或血液恶性肿瘤(包括白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、abc dlbcl、慢性淋巴球性白血病(cll)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)/白血病、急性淋巴细胞性白血病、b细胞前淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(wm)、脾边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、血管内大b细胞淋巴瘤。
25.第二方面，本发明提供了包含大鲵胶原蛋白肽的组合物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。
26.在一些实施方案中，所述大鲵胶原蛋白肽来自于大鲵(andrias davidianus)，具体地，来自于大鲵皮和/或大鲵肉和/或大鲵骨。
27.在一些实施方案中，所述大鲵胶原蛋白肽来自去除脂肪和非胶原蛋白的大鲵皮和/或大鲵肉和/或大鲵骨。
28.在一些实施方案中，所述大鲵胶原蛋白肽经由酸水解、碱水解和/或酶解法制备。
29.在一些实施方案中，所述酶是碱性蛋白酶，并且，在ph9～11的条件下进行蛋白酶解。
30.优选地，在蛋白酶解后，对蛋白酶解后的上清或其干燥物进行醇沉。
31.在一些实施方案中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，链蛋白酶，胶原蛋白酶和/或胰蛋白酶。
32.在一些实施方案中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和/或胰蛋白酶。
33.在一些实施方案中，所述大鲵胶原蛋白肽由去除脂肪和非胶原蛋白的大鲵皮和/
或大鲵肉和/或大鲵骨经碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶的三段式酶解制得。
34.在一些实施方案中，所述三段式酶解中，各段酶解的反应温度均不高于60℃，优选地在40～60℃的范围内。
35.在一些实施方案中，所述三段式酶解中，各段酶解的ph控制为6～9。
36.优选地，经酸水解、碱水解和/或酶解法制备或经三段式酶解法制备的大鲵胶原蛋白肽还可以进一步精制，优选，经初滤、活性炭吸附、精滤和/或干燥处理。
37.优选地，经酸水解、碱水解和/或酶解法制备或经三段式酶解法制备的大鲵胶原蛋白肽经透析膜过滤进行进一步的纯化。
38.从大鲵皮和/或大鲵肉去除脂肪和非胶原蛋白可经常规方法进行，例如经碱液浸泡法去除脂肪和非胶原蛋白。优选地，所述碱液为氢氧化钠或碳酸氢钠。
39.在一些实施方案中，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为100～4000道尔顿。优选地，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为500～3000道尔顿。更优选地，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为800～2500道尔顿。更优选地，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为800～1500道尔顿。较小分子量的大鲵胶原蛋白肽更有利于人体的吸收。
40.优选地，所述大鲵胶原蛋白肽为疏水性小分子肽，从而具有更强的生物活性。
41.在一些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于良性或恶性肿瘤、实体肿瘤、结肠直肠癌、脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、胃肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、阴道癌、宫颈癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、食道癌、喉癌、皮肤癌、骨癌或甲状腺癌、肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、颈部和头部的肿瘤、表皮过度增生、角化棘皮瘤、表皮样癌、大细胞癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏(hodgkins)和非霍奇金氏淋巴瘤、滤泡癌、未分化性瘤、乳头状癌、精原细胞瘤、黑色素瘤、髓性多发性骨髓瘤或血液恶性肿瘤(包括白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、abc dlbcl、慢性淋巴球性白血病(cll)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)/白血病、急性淋巴细胞性白血病、b细胞前淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(wm)、脾边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、血管内大b细胞淋巴瘤。
42.在一些实施方案中，所述组合物还包括可药用载剂或佐剂。
43.在一些实施方案中，所述组合物还包括其他抗癌剂。
44.在一些实施方案中，所述抗癌剂是指选自以下中的任何一种或多种的药物：烷基化剂(包括芥子、氮芥子气、甲磺酸酯、白消安、磺酸烷基酯、亚硝基脲、乙烯亚胺衍生物和三氮烯或其组合)；抗血管生成剂(包括基质金属蛋白酶抑制剂)；抗代谢物(包括腺苷脱氨酶抑制剂、叶酸拮抗剂、嘌呤类似物和嘧啶类似物)；抗生素或抗体(包括单克隆抗体、ctla-4抗体、蒽环霉素)；芳香酶抑制剂；细胞周期反应调节剂；酶类；法呢基-蛋白质转移酶抑制剂；激素和抗激素药剂以及类固醇(包括合成类似物、糖皮质激素、雌激素/抗雌激素[例如serm]、雄激素/抗雄激素、孕激素、孕酮受体激动剂和释放促黄体激素[lhrh]的激动剂和拮抗剂)；胰岛素样生长因子(igf)/胰岛素样生长因子受体(igfr)系统调节剂(包括igfr1抑制剂)；整合素信号传导抑制剂；激酶抑制剂(包括多激酶抑制剂和/或src激酶或src/ab1抑制剂)、细胞周期素依赖性激酶[cdk]抑制剂、泛her、her-1和her-2抗体、vegf抑制剂(包括抗vegf抗体)、egfr抑制剂、parp(聚adp-核糖聚合酶)抑制剂、丝裂原活化蛋白[map]抑制
剂、met抑制剂、mek抑制剂、极光激酶抑制剂、pdgf抑制剂和其它酪氨酸激酶抑制剂或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂；微管干扰剂，例如海鞘素(ecteinascidin)或其类似物和衍生物；微管稳定剂例如紫杉烷、基于铂的抗肿瘤药物(铂)例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂(nedaplatin)、特瑞铂四硝酸酯(triplatin tetranitrate)、菲铂(phenanthriplatin)、吡铂(picoplatin)和赛特铂(satraplatin)以及天然存在的埃博霉素(epothilone)以及其合成类似物和半合成类似物；微管结合的去稳定化剂(包括长春花生物碱)；拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基-蛋白(prenyl-protein)转移酶抑制剂；铂配位复合物；信号转导抑制剂；和其它用作抗癌剂和细胞毒性剂的药剂例如生物反应调节剂、生长因子和免疫调节剂。在另一个实施例中，“抗癌剂”包含紫杉烷、铂或其组合。
[0045]
所述组合物可以为液体制剂，例如口服溶液、注射液，或固体制剂，例如粉剂、胶囊剂、片剂，散剂，颗粒剂，膜剂等。
附图说明
[0046]
图1显示了大鲵胶原蛋白肽对结直肠癌细胞系sw48抑制增殖及对结肠粘膜正常上皮细胞系ncm356细胞的促进增殖作用结果。
[0047]
图2显示了大鲵胶原蛋白肽在体内实验中对结直肠癌细胞sw48诱导的裸鼠移植瘤的抑制作用结果，每周观察各组肿瘤生长情况并绘制生长曲线(图2a)，待移植瘤长至一定大小后处死裸鼠并通过外科手术完整取出每组移植瘤(图2b)，分析肿瘤中相关信号通路的表达(图2c)。
[0048]
图3显示大鲵胶原蛋白肽通过pi3k/akt信号通路抑制癌细胞的增殖。
[0049]
图4显示了大鲵胶原蛋白肽对其他癌细胞的抑制作用。
实施例
[0050]
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，碱性蛋白酶(alcalase)为枯草芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，cas号为9014-01-1，酶活为2.4au/g；中性蛋白酶为枯草芽孢杆菌来源的中性蛋白酶，cas号为9014-01-1，酶活为10万u/g；风味蛋白酶(flavourzyme)为利用米曲霉发酵再添加风味物质筛选复配而成，cas号为9014-01-1，酶活为500lapu/g。
[0051]
实施例1：大鲵胶原蛋白肽的制备
[0052]
本实施例提供了一种大鲵胶原蛋白肽的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0053]
1、大鲵原料预处理：大鲵整鱼经切块和皮、肉、脂肪分离处理后，将皮和肉用0.1mol/l的氢氧化钠溶液浸泡4h，以去除非胶原蛋白，浸泡的料液比(g：ml)为1:8，浸泡期间更换一次naoh溶液；浸泡后用去离子水洗涤至中性，沥水待用；
[0054]
2、酶解：在酶解罐中投入步骤1经预处理的大鲵鱼原料，按照料液比为1:1.5(g：ml)加入去离子水，开启搅拌，升温至100℃，微沸保温60min，然后进行以下处理：
[0055]
1)降温至60℃，用氢氧化钙调节ph 8.0，按物料质量的3
‰
加入碱性蛋白酶，酶解1h，酶解过程中维持ph 8.0-9.0；
[0056]
2)降温至50℃，在自然ph下，添加物料质量3
‰
的中性蛋白酶，继续酶解2h，酶解过程中维持ph 6.0-8.0；
[0057]
3)添加物料质量5
‰
的风味蛋白酶，在50℃继续酶解1h，酶解过程中维持ph 6.0-8.0，酶解结束后用磷酸调节ph至中性。
[0058]
3、灭酶：酶解结束后，升温至90℃保温5min；加入酶解物质量0.5％的珍珠岩，降温至60℃；4、初滤：将步骤3的物料经板框过滤机过滤至脱色罐，板框过滤机的压力为2mpa。
[0059]
5、脱色：用磷酸调节ph至4.0-4.8(60℃测量)，按物料比的1％添加活性炭，搅拌并保温30min；待脱色完毕，用氢氧化钙将ph调节至6.0(ph需在15分钟内无变化，防止反应不充分或者不均匀导致的虚假ph值)，过滤。
[0060]
6、浓缩：将物料浓缩至浓度为45
±
1％(以浓缩塔出料口浓度计)。
[0061]
7、精滤：浓缩液经硅藻土过滤器(孔体积为0.3～1.0cm3/g，过滤精度1～2μm)、纸板过滤机(0.4μm过滤精度)、微孔折叠滤芯(0.22/0.22μm聚丙烯过滤精度)进入无菌罐。
[0062]
8、喷雾干燥：进风温度210℃，出风温度85℃，雾化器频率50hz，密度要求：0.23-0.27g/ml。
[0063]
实施例2：大鲵胶原蛋白肽的制备
[0064]
本实施例提供一种大鲵胶原蛋白肽，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤2，步骤2具体如下：
[0065]
酶解：在酶解罐中投入步骤1经预处理的大鲵鱼原料，按照料液比为1:1.5(g：ml)加入去离子水，开启搅拌，升温至100℃，微沸保温60min，然后进行以下处理：
[0066]
1)降温至60℃，用氢氧化钙调节ph 6.5，按物料质量的1
‰
加入碱性蛋白酶，酶解1.5h，酶解过程中维持ph 6.0-9.0；
[0067]
2)降温至50℃，在自然ph下，添加物料质量1
‰
的中性蛋白酶，继续酶解2.5h，酶解过程中维持ph 6.0-8.0；
[0068]
3)添加物料质量1
‰
的风味蛋白酶，在50℃继续酶解3h，酶解过程中维持ph 6.0-8.0，酶解结束后用磷酸调节ph至中性。
[0069]
实施例3：大鲵胶原蛋白肽的制备
[0070]
本实施例提供了一种大鲵胶原蛋白肽的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0071]
1、大鲵原料预处理：大鲵整鱼经切块和皮、肉、脂肪分离处理后，将皮和肉用搅拌机内切成肉糜，搅拌时间控制在5～20min；
[0072]
2、大鲵肉糜与水以固液比1:1.5～1:7的比例混合，并采用混匀器使固液充分混合均匀，再过20-80目筛；
[0073]
3、向上述步骤2中的大鲵肉糜中加入调节为8-15％浓度的食品级盐酸，在搅拌釜中搅拌处理0.5h-1.5h；
[0074]
4、步骤3处理完毕后的大鲵肉糜加入纯净水清洗两到三次，再加入质量分数为0.5-2％的食品级氢氧化钠进行中和、并调节ph值为9.0-10.0，边加入边搅拌，每7-8min测定一次，直至三次ph值相同，ph值稳定1h后用水清洗，直至ph值洗至7.0，沥水待用；
[0075]
5、酶解：在酶解罐中投入步骤4经预处理的大鲵肉糜，按照料液比为1:1.5(g：ml)加入去离子水，开启搅拌，升温至100℃，微沸保温60min：
[0076]
1)降温至60℃，用氢氧化钙调节ph 8.0，按物料质量的3
‰
加入碱性蛋白酶，酶解1h，酶解过程中维持ph 8.0-9.0；
[0077]
2)降温至50℃，在自然ph下，添加物料质量3
‰
的中性蛋白酶，继续酶解2h，酶解过
程中维持ph 6.0-8.0；
[0078]
3)添加物料质量5
‰
的风味蛋白酶，在50℃继续酶解1h，酶解过程中维持ph6.0-8.0，酶解结束后用磷酸调节ph至中性；
[0079]
6、灭酶：酶解结束后，升温至90℃保温5min；加入酶解物质量0.5％的珍珠岩，降温至60℃；7、初滤：将步骤6的物料经板框过滤机过滤至脱色罐，板框过滤机的压力为2mpa；
[0080]
8、脱色：用磷酸调节ph至4.0-4.8(60℃测量)，按物料比的1％添加活性炭，搅拌并保温30min；待脱色完毕，用氢氧化钙将ph调节至6.0(ph需在15分钟内无变化，防止反应不充分或者不均匀导致的虚假ph值)，过滤；
[0081]
9、浓缩：将物料浓缩至浓度为45
±
1％(以浓缩塔出料口的浓度计)；
[0082]
10、精滤：浓缩液经硅藻土过滤器(孔体积为0.3～1.0cm3/g，过滤精度1～2μm)、纸板过滤机(0.4μm过滤精度)、微孔折叠滤芯(0.22/0.22μm聚丙烯过滤精度)进入无菌罐；11、喷雾干燥：进风温度210℃，出风温度85℃，雾化器频率50hz，密度要求：0.23-0.27g/ml。
[0083]
实施例4：大鲵胶原蛋白肽的制备
[0084]
本实施例提供了一种大鲵胶原蛋白肽的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0085]
1、大鲵原料预处理：大鲵整鱼经切块和皮、肉、脂肪分离处理后，将皮和肉用粉碎机内粉碎，粉碎时间控制在10～20min；
[0086]
2、将步骤1处理好后的大鲵肉浆用0.0.5-0.2mol/l的氢氧化钠溶液浸泡3-5h，以去除脂肪，浸泡的料液比(g：ml)为1:6，浸泡后用去离子水洗涤至中性，沥水待用；
[0087]
3、将步骤2处理后的沥水大鲵肉浆冷冻离心后经冷冻干燥处理，粉碎至40目以下得大鲵肉粉，大鲵肉粉与水以固液比1:1～1:4的比例混合，并采用混匀器使固液充分混合均匀，再过60-80目筛；
[0088]
4、酶解：在酶解罐中投入步骤3经预处理的大鲵肉浆，按照料液比为1:1.5(g：ml)加入去离子水，开启搅拌，升温至100℃，微沸保温60min：
[0089]
1)降温至60℃，用氢氧化钙调节ph8.0，按物料质量的3
‰
加入碱性蛋白酶，酶解1h，酶解过程中维持ph8.0-9.0；
[0090]
2)降温至50℃，在自然ph下，添加物料质量3
‰
的中性蛋白酶，继续酶解2h，酶解过程中维持ph6.0-8.0；
[0091]
3)添加物料质量5
‰
的风味蛋白酶，在50℃继续酶解1h，酶解过程中维持ph 6.0-8.0，酶解结束后用磷酸调节ph至中性；
[0092]
5、灭酶：酶解结束后，升温至90℃保温5min；加入酶解物质量0.5％的珍珠岩，降温至60℃；6、初滤：将步骤6的物料经板框过滤机过滤至脱色罐，板框过滤机的压力为2mpa；
[0093]
7、脱色：用磷酸调节ph至4.0-4.8(60℃测量)，按物料比的1％添加活性炭，搅拌并保温30min；待脱色完毕，用氢氧化钙将ph调节至6.0(ph需在15分钟内无变化，防止反应不充分或者不均匀导致的虚假ph值)，过滤；
[0094]
8、将上述步骤7中分离后的液体再采用纳滤膜进行200～700dal有机小分子的分离；
[0095]
9、浓缩：将步骤8中得到的物料浓缩至浓度为45
±
1％(以浓缩塔出料口浓度计)；
[0096]
10、精滤：浓缩液经硅藻土过滤器(孔体积为0.3～1.0cm3/g，过滤精度1～2μm)、纸板过滤机(0.4μm过滤精度)、微孔折叠滤芯(0.22/0.22μm聚丙烯过滤精度)进入无菌罐；11、
喷雾干燥：进风温度210℃，出风温度85℃，雾化器频率50hz，密度要求：0.23-0.27g/ml。
[0097]
实施例5：抗结直肠癌细胞增殖的生物活性测试-体外实验
[0098]
(1)细胞培养
[0099]
结直肠细胞sw48以及正常肠粘膜上皮细胞ncm356用含10％小牛血清，1％双抗(100u/ml青霉素及100u/ml链霉素)的dmem培养基，在37℃、5％co2、饱和湿度的co2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0100]
(2)cck8测定实施大鲵胶原蛋白肽对sw48及ncm356细胞增殖的影响
[0101]
将大鲵胶原蛋白肽溶解在含10％小牛血清，1％双抗(100u/ml青霉素及100u/ml链霉素)的dmem培养基中，配制成浓度分别为0.5，1，2，4，8和16mg/ml的大鲵胶原蛋白肽溶液，用于cck8加药实验。
[0102]
取对数生长期细胞，以每孔4000个细胞接种于96孔培养板中，每孔加入细胞悬液100μl，在细胞培养箱中培养24h，检查细胞贴壁状态。细胞贴壁良好的96孔板可以进行下一步加药实验。将孔中培养基全部吸出，向各孔中加入不同浓度的大鲵胶原蛋白肽溶液，浓度分别为0.5，1，2，4，8和16mg/ml，对照组不加大鲵胶原蛋白肽，仅加入含10％小牛血清，1％双抗(100u/ml青霉素及100u/ml链霉素)的dmem培养基。每组浓度设4个相同细胞孔，分别处理120小时。培养结束后，向每孔加入浓度为cck8溶液10μl，置于培养箱中继续培养2h，用酶标仪测定450nm的吸光度。
[0103]
大鲵胶原蛋白肽对结直肠癌细胞sw48及ncm356细胞的增殖抑制作用结果见图1，大鲵胶原蛋白肽能抑制结直肠细胞sw48的增殖，而能轻度促进正常肠粘膜上皮细胞ncm356增殖，并且对抑制结直肠细胞sw48具有显著的量效关系，ic50为7.5mg/ml。
[0104]
实施例6：抗结直肠癌细胞增殖的生物活性测试-体内实验
[0105]
(1)细胞培养
[0106]
结直肠细胞sw48用含10％小牛血清，1％双抗(100u/ml青霉素及100u/ml链霉素)的dmem培养基，在37℃、5％co2、饱和湿度的co2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0107]
(2)裸鼠移植瘤模型中实施大鲵蛋白肽对结直肠癌细胞增殖的影响
[0108]
将sw48以及相应的对照细胞大量培养，细胞生长至对数生长期后，将细胞制成混悬液(密度约1
×
106/100μl培养基)，取100μl接种于裸鼠(balb/c nu)背部皮下(2个/只)，建立裸鼠皮下移植瘤模型，待裸鼠成瘤后，随机分为两组，对照组尾静脉注射pbs(一周一次)，实验组尾静脉注射8mg/ml大鲵蛋白肽(一周一次)。每周观察各组肿瘤生长情况，每周绘制生长曲线(图2a)，待移植瘤长至一定大小后处死裸鼠，并通过外科手术完整取出每组移植瘤(图2b)，分析肿瘤中相关信号通路的表达(图2c)。
[0109]
大鲵胶原蛋白肽对结直肠癌细胞sw48的增殖抑制作用结果见图2。可见大鲵胶原蛋白肽能明显抑制结直肠癌的生长，并且可能通过抑制经典pi3k/akt信号通路发挥作用。
[0110]
实施例7：抗结直肠癌细胞增殖的信号传导机制测试-体外实验
[0111]
(1)细胞培养
[0112]
结直肠细胞sw48用含10％小牛血清，1％双抗(100u/ml青霉素及100u/ml链霉素)的dmem培养基，在37℃、5％co2、饱和湿度的co2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0113]
(2)对pi3k/akt信号通路的影响
[0114]
将结肠癌细胞sw48接种于6孔板，按照实验分组分别加入pbs对照及8mg/ml大鲵胶
原蛋白肽48h后，收集细胞加入np-40裂解液冰上裂解30min，离心取上清得到细胞全蛋白裂解液，bca法测定蛋白浓度以定量，取等量总蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其中p-akt(ser473)、akt、p-stat3(tyr705)、stat3、p-ekrekr的表达变化，以gapdh作为内参。结果如图3a所示，pi3k/akt信号通路关键蛋白p-akt(ser473)、p-stat3(tyr705)在加入大鲵胶原蛋白肽后表达水平下降，信号通路抑制，细胞增殖水平下降。进行进一步的补救实验，在四组细胞中分别加入pbs对照、8mg/ml大鲵胶原蛋白肽、8mg/ml大鲵胶原蛋白肽+1mg/ml740y-p(pi3k信号通路激活剂)、1mg/ml740y-p，培养细胞48小时后行werstern blot检测p-akt蛋白表达水平(图3b)。结果显示，使用大鲵胶原蛋白肽后能显著降低p-akt表达水平，在大鲵胶原蛋白肽的基础上加入激动剂后能部分逆转单纯大鲵胶原蛋白肽使用后的下降趋势，由此说明大鲵胶原蛋白肽通过pi3k/akt信号通路抑制癌细胞的增殖。
[0115]
实施例8：大鲵胶原蛋白肽对其他癌细胞的抑制作用
[0116]
(1)细胞培养
[0117]
为了进一步证明大鲵胶原蛋白肽对其他癌细胞的作用，选取乳腺癌细胞系mcf-7、宫颈癌细胞系hela、肺癌细胞系a549、胃癌细胞系ags，用含10％小牛血清，1％双抗(100u/ml青霉素及100u/ml链霉素)的dmem培养基，在37℃、5％co2、饱和湿度的co2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0118]
(2)对不同癌细胞中pi3k/akt信号通路的影响
[0119]
将四种癌细胞接种于6孔板，按照实验分组分别加入pbs对照及8mg/ml大鲵胶原蛋白肽48h后，收集细胞加入np-40裂解液冰上裂解30min，离心取上清得到细胞全蛋白裂解液，bca法测定蛋白浓度以定量，取等量总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同癌细胞系中的p-akt，以gapdh作为内参。结果如图4显示，在不同癌细胞中，大鲵胶原蛋白肽均对p-akt起抑制作用，此实验证明了大鲵胶原蛋白肽对癌细胞抑制增殖作用的广泛性。
[0120]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.大鲵胶原蛋白肽或包含大鲵胶原蛋白肽的组合物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。2.根据权利要求1的应用，所述大鲵胶原蛋白肽来自于大鲵，优选地，来自于大鲵皮和/或大鲵肉和/或大鲵骨。3.根据权利要求1的应用，所述大鲵胶原蛋白肽经由酸水解、碱水解和/或酶解法制备，优选地，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，链蛋白酶，胶原蛋白酶和/或胰蛋白酶；优选地，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和/或胰蛋白酶；优选地，所述大鲵胶原蛋白肽由去除脂肪和非胶原蛋白的大鲵皮和/或大鲵肉和/或大鲵骨经碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶的三段式酶解制得。4.根据权利要求1的应用，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为100～4000道尔顿，优选地，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为500～3000道尔顿，更优选地，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为800～2500道尔顿，更优选地，所述大鲵胶原蛋白肽的平均分子量为800～1500道尔顿，优选地，所述大鲵胶原蛋白肽为疏水性小分子肽。5.根据权利要求1的应用，所述大鲵胶原蛋白肽通过抑制经典pi3k/akt信号通路发挥抗肿瘤作用。6.根据权利要求1的应用，所述肿瘤包括但不限于良性或恶性肿瘤、实体肿瘤、结肠直肠癌、脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、胃肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、阴道癌、宫颈癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、食道癌、喉癌、皮肤癌、骨癌或甲状腺癌、肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、颈部和头部的肿瘤、表皮过度增生、角化棘皮瘤、表皮样癌、大细胞癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏(hodgkins)和非霍奇金氏淋巴瘤、滤泡癌、未分化性瘤、乳头状癌、精原细胞瘤、黑色素瘤、髓性多发性骨髓瘤或血液恶性肿瘤(包括白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、abc dlbcl、慢性淋巴球性白血病(cll)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)/白血病、急性淋巴细胞性白血病、b细胞前淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(wm)、脾边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、血管内大b细胞淋巴瘤。7.根据权利要求1的应用，所述组合物还包括可药用载剂或佐剂。8.根据权利要求1的应用，所述组合物还包括其他抗癌剂。9.根据权利要求8的应用，所述抗癌剂为选自以下的一种或多种的药物：包括芥子、氮芥子气、甲磺酸酯、白消安、磺酸烷基酯、亚硝基脲、乙烯亚胺衍生物和三氮烯或其组合的烷基化剂；包括基质金属蛋白酶抑制剂的抗血管生成剂；包括腺苷脱氨酶抑制剂、叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物或其组合的抗代谢物；包括单克隆抗体、ctla-4抗体、蒽环霉素的抗生素或抗体；芳香酶抑制剂；细胞周期反应调节剂；酶类；法呢基-蛋白质转移酶抑制剂；激素和抗激素药剂以及类固醇(包括合成类似物、糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕激素、孕酮受体激动剂和释放促黄体激素[lhrh]的激动剂和拮抗剂)；胰岛素样生长因子(igf)/胰岛素样生长因子受体(igfr)系统调节剂(包括igfr1抑制剂)；整合素信号传导抑制剂；激酶抑制剂(包括多激酶抑制剂和/或src激酶或src/ab1抑制剂)、细胞周期素依赖性激酶[cdk]抑制剂、泛her、her-1和her-2抗体、vegf抑制剂(包括抗vegf抗
体)、egfr抑制剂、parp(聚adp-核糖聚合酶)抑制剂、丝裂原活化蛋白[map]抑制剂、met抑制剂、mek抑制剂、极光激酶抑制剂、pdgf抑制剂和其它酪氨酸激酶抑制剂或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂；微管干扰剂，例如海鞘素(ecteinascidin)或其类似物和衍生物；微管稳定剂例如紫杉烷、基于铂的抗肿瘤药物(铂)例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂(nedaplatin)、特瑞铂四硝酸酯(triplatin tetranitrate)、菲铂(phenanthriplatin)、吡铂(picoplatin)和赛特铂(satraplatin)以及天然存在的埃博霉素(epothilone)以及其合成类似物和半合成类似物；微管结合的去稳定化剂(包括长春花生物碱)；拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基-蛋白(prenyl-protein)转移酶抑制剂；铂配位复合物；信号转导抑制剂；和其它用作抗癌剂和细胞毒性剂的药剂例如生物反应调节剂、生长因子和免疫调节剂；包含紫杉烷、铂或其组合。10.根据权利要求1的应用，所述组合物为液体制剂或固体制剂，所述液体制剂为口服溶液或注射液；所述固体制剂为冻干粉剂、胶囊剂、片剂，散剂，颗粒剂或膜剂。

技术总结
本申请涉及大鲵胶原蛋白肽或包含大鲵胶原蛋白肽的组合物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。的应用。


技术研发人员：张兆熙 吕瑶 邓晓春
受保护的技术使用者：武汉艾科索生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.20
技术公布日：2023/9/26