免疫学测定方法与流程

1.本发明涉及免疫测定。具体地，本发明涉及一种免疫测定，其中免疫反应在抗c3抗体存在下进行。


背景技术：

2.诊断剂领域中的测量方法包括免疫测定，其利用免疫反应来测量生物样品中存在的分析物。免疫测定采用抗原抗体反应，因此该方法的特异性非常高。
3.生物样品中含有各种物质，并且其中通常含有引起非特异性反应的物质，即所谓的非特异性因子(干扰因子/非特异性反应因子/非特异性结合分子)。非特异性反应是促进不基于特异性反应的结合或抑制特异性免疫反应的现象，非特异性反应导致测量误差。作为非特异性因子，已知嗜异性抗体和类风湿因子(rf)。嗜异性抗体是对作为免疫测定的主要成分的动物来源的抗体表现出反应性的人抗体的总称，并且hama(人抗小鼠免疫球蛋白抗体)被称为典型的嗜异性抗体。类风湿因子出现在类风湿性关节炎患者中，在对动物来源的抗体表现出反应性的特性方面与hama相似，并且已知类风湿因子和hama的身份实际上是人免疫球蛋白g或免疫球蛋白m(非专利文献1)。
4.作为抑制免疫测定中的非特异性反应的技术，例如已知专利文献1。专利文献1公开了一种抑制由类风湿因子(rf)引起的非特异性反应的方法，其通过预先用足量的能够与rf的反应位点结合的动物来源的抗体对样品进行预处理。作为动物来源的抗体，公开了抗人igg抗体、抗人iga抗体和/或抗人igm抗体。
5.引用列表
6.专利文献
7.专利文献1：jp-a-07-012818
8.非专利文献
9.非专利文献1：clinical chemistry,第23卷,supplementary book,175a-1至175a-10(1994)


技术实现要素：

10.技术问题
11.专利文献1描述了一种使用抗人igm抗体、抗人igg抗体或抗人iga抗体来抑制天然抗体或rf引起的非特异性反应的方法。这是目前利用各种试剂的实际使用的方法，但本发明人进行的试验表明，存在即使使用这些抗体也无法抑制的非特异性反应。本发明的目的在于抑制免疫测定方法中的非特异性反应。
12.问题的解决方案
13.为了解决该问题，本技术的发明人对各种物质抑制非特异性反应的效果进行了研究，结果发现，通过在抗c3抗体的存在下进行免疫反应，可以抑制非特异性反应。至此，完成了本技术的发明。即，本技术的发明具有以下的结构。
14.这里，已知抗c3抗体用于在免疫测定中检测待测物质(c3本身是分析物)，但抑制免疫反应中的非特异性反应的效果完全未知。
15.《1》
16.一种免疫测定方法，其包括在免疫学测定样品中的分析物的方法中，在抗c3抗体的存在下进行免疫反应。
17.《2》
18.根据《1》的免疫测定方法，其中所述免疫测定方法是基于同质法或异质法的方法。
19.《3》
20.根据《1》或《2》的免疫测定方法，其中基于同质法的方法是乳胶免疫凝集测量方法。
21.《4》
22.根据《3》的免疫测定方法，其包括：
23.使样品中的分析物和抗c3抗体在溶液中彼此接触的步骤，
24.将带有分析物的特异性结合配偶体的乳胶颗粒添加到溶液中的步骤，和
25.光学检测溶液中乳胶颗粒的凝集程度的步骤。
26.《5》
27.根据《1》至《4》中任一项的免疫测定方法，其中，抗c3抗体为选自由抗ic3b抗体、抗c3dg抗体、抗c3d抗体和抗c3b抗体组成的组中的任意一种或多种。
28.《6》
29.一种用于抑制免疫学测量样品中的分析物的方法中的非特异性反应的方法，其包括，在抗c3抗体的存在下进行免疫反应。
30.《7》
31.根据《6》的用于抑制非特异性反应的方法，其中所述免疫测定方法是基于同质法或异质法的方法。
32.《8》
33.根据《6》或《7》的用于抑制非特异性反应的方法，其中，基于均质法的方法是乳胶免疫凝集测量方法。
34.《9》
35.根据《8》的用于抑制非特异性反应的方法，其包括：
36.使样品中的分析物和抗c3抗体在溶液中彼此接触的步骤，
37.将带有分析物的特异性结合配偶体的乳胶颗粒添加到溶液中的步骤，和
38.光学检测溶液中乳胶颗粒的凝集程度的步骤。
39.《10》
40.根据《6》至《9》中任一项的免疫测定方法，其中，抗c3抗体为选自由抗ic3b抗体、抗c3dg抗体、抗c3d抗体和抗c3b抗体组成的组中的任意一种或多种。
41.《11》
42.免疫测定试剂，其含有抗c3抗体。
43.《12》
44.根据《11》的免疫测定试剂，其中所述免疫测定的方法是基于同质法或异质法的方
complement science:from basics to clinical/measurement method,hajime kitamura,interdisciplinary planning co.,ltd.(2010.11)，第27页的图10)。
69.实施方式的描述
70.(免疫测定方法)
71.本发明的免疫测定方法是一种特征在于在免疫测定样品中分析物的方法中在抗c3抗体存在下进行免疫反应的方法。换句话说，在该方法中，在作为用于抑制非特异性反应的试剂的抗c3抗体的存在下，使用除抗c3抗体之外的特异性结合配偶体对样品中的分析物进行免疫学测量。
72.免疫测定方法进一步粗略地分为同质法和异质法。
73.同质法是指不进行b/f(结合/游离)分离而专门检测样品与试剂液的混合液(反应液)中的分析物所进行的反应的测定方法，异质法是通过b/f分离操作洗涤/除去未参与结合反应的多余成分后，进行和检测主要反应的测量方法。
74.虽然异质法存在问题，因为该方法由于洗涤步骤而包括许多步骤并且需要测量时间，但异质方法具有优点，因为该方法受非特异性反应物质的影响相对较小。另一方面，虽然同质法存在问题，因为该方法不包括洗涤步骤，因此容易受到非特异性反应的影响，但同质法由于方法简单，步骤更少，并且测量所需的时间很短，而在临床诊断领域广泛需要。
75.同质法包括使用免疫凝集测定(比浊免疫测定，tia)和免疫色谱法(侧流型和流通型)的测量方法。tia是一种基于通过交联分析物的特异性结合配偶体例如抗体的作用形成的免疫复合物的凝集程度来定性或定量检测样品中的分析物(待测物质)的方法，尤其是乳胶免疫凝集测定(以下有时称为ltia)，它使用乳胶颗粒作为不溶性载体来放大凝集信号，是一种很好的通用测量方法，适用于各种检测项目，因为该测定适合光学检测并且易于自动化。
76.异质法包括使用孔板的elisa、化学发光测量等。
77.本发明可用于任何免疫测定方法，但较容易受到非特异性反应影响的同质法是优选的，因为预期可以明显地享受到益处。
78.(抗c3抗体)
79.本发明中用于抑制非特异性反应的抗c3抗体是针对c3的抗体，并且可以是任何抗体，只要其识别对应于c3的c3d的部分即可。
80.c3是经典途径中的补体蛋白之一，由于具有电迁移性，也被称为补体第三成分或β1c球蛋白。c3是分子量为180kda的蛋白质，具有分子量为110kda的α链和分子量为70kda的β链通过-ss-键交联的结构，为补体系统的核心蛋白质。如图4所示，c3通过c3b和ic3b分解为c3dg，并进一步分解为c3d。本发明中使用的抗c3抗体可以是任何抗体，只要其识别通过c3分解产生的与c3d对应的部分即可，并且在这个意义上，可以使用抗ic3b抗体、抗c3b抗体、抗c3dg抗体和抗c3d抗体中的任一种。其中，特别优选抗c3d抗体。
81.本发明中使用的抗c3抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。更优选单克隆抗体。
82.作为本发明中使用的抗c3抗体，除了整个抗体分子之外，还可以使用具有抗原-抗体反应性的抗体的功能片段。
83.本发明中使用的抗c3抗体可以是通过一般动物(小鼠、山羊、绵羊等)的免疫步骤
获得的抗体或者使用基因重组技术等将氨基酸序列改变为与用免疫原(待测物质/分析物)免疫的动物不同的动物物种的序列的抗体(嵌合抗体、人源化抗体、完全人源化抗体等)。抗体的功能片段包括f(ab')2和fab'，它们是具有抗原抗体反应性的片段，以及单链抗体(scfv)、vhh抗体(重链抗体的重链可变结构域)、ignar(新抗原受体)抗体等。抗体的功能片段可以通过用蛋白酶(例如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)处理如上所述获得的抗体来制备。在本发明中，抗c3抗体的功能片段可以是任何片段，只要该片段含有对应于如上所述的c3d的部分即可。本发明中，除非另有说明，抗c3抗体还包括功能片段。
84.作为本发明中使用的针对c3的抗体，可以使用由抗c3b抗体、抗ic3b抗体、抗c3dg抗体和抗c3d抗体组成的组中的任意一种，并且还可以使用选自该组中的任意两种或更多种的组合。
85.在本说明书中，抗体“与”抗原“反应”和抗体“识别”抗原同义地使用，但不应当限于这些例子并且应当在最广义上解释。抗体是否与抗原(化合物)“反应”可以通过抗原固定化elisa、竞争性elisa、夹心elisa等来确认，也可以通过利用表面等离子共振原理的方法(spr法)等来确认。spr法可以使用以biacore(注册商标)的名称市售的装置、传感器和试剂来进行。
86.本发明中使用的针对c3的抗体可以通过将c3(例如市售的人来源的c3d蛋白)作为抗原(免疫原)溶解在溶剂(例如磷酸缓冲生理盐水)中并将该溶液施用于动物进行免疫来制备。必要时，可以向溶液中添加适当的佐剂，然后可以使用该乳剂对动物进行免疫。作为佐剂，可以使用通常使用的佐剂，例如油包水乳剂、水包油包水乳剂、水包油乳剂、脂质体、氢氧化铝凝胶，以及源自生物学成分的蛋白质和肽物质等。例如，可以适当使用不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂等。佐剂的施用途径、剂量和施用时机没有特别限制，但期望适当地选择，使得可以在用抗原免疫的动物中增强所需的免疫应答。
87.用于免疫的动物种类也没有特别限制，但优选哺乳动物。例如，可以使用小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、绵羊、羊驼等，更优选可以使用小鼠或大鼠。动物可以根据一般方法进行免疫，并且可以例如通过将抗原溶液、优选与佐剂的混合物皮下、皮内、静脉内或腹膜内注射至动物来进行免疫。由于免疫应答通常根据要免疫的动物的种类和系而不同，因此期望根据所使用的动物适当地设定免疫方案。抗原的施用优选在第一次免疫后重复几次。
88.为了获得单克隆抗体，随后进行以下操作，但该方法不限于此。产生单克隆抗体的方法本身是本领域已知的并且是普遍使用的，因此本领域技术人员可以使用抗原容易地产生用于本发明的免疫学分析方法的抗体(例如，参见antibodies,a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,(1988),第6节等)。
89.最终免疫后，从免疫的动物中取出作为抗体产生细胞的脾细胞或淋巴结细胞，通过与具有高生长潜力的源自骨髓瘤的细胞系进行细胞融合，可以产生杂交瘤。优选将具有高抗体产生潜力(质量/量)的细胞用于细胞融合，并且源自骨髓瘤的细胞系优选与待融合的产生抗体的细胞所源自的动物具有相容性。细胞的融合可以按照本领域已知的方法进行，例如可以采用聚乙二醇法、使用仙台病毒的方法、使用电流的方法等。获得的杂交瘤可以根据本领域通常使用的条件进行增殖，并且可以在检查所产生的抗体的特性的同时选择期望的杂交瘤。杂交瘤的克隆可以通过例如有限稀释分析、软琼脂分析等公知的方法来进行。
90.考虑到所产生的抗体用于实际测量的条件，还可以在选择阶段有效地选择杂交瘤。例如，通过使通过免疫动物而获得的抗体在存在其交叉反应性待检查的化合物的情况下与固定在固相上的c3反应，并将反应性与不存在其交叉反应性待检查的化合物的情况下的反应性相比较，可以更有效地选择产生所需抗体的杂交瘤。此外，还可以通过使免疫动物获得的抗体与固定在固相上的c3在存在源自生物学样品的成分的情况下反应，并将反应性与不存在源自生物学样品的成分的情况下的反应性进行比较来更有效地选择产生期望抗体的杂交瘤。
91.在克隆步骤之后，所选择的杂交瘤是否产生具有所需特性的单克隆抗体可以通过使用诸如elisa、ria和荧光抗体方法的方法测定所产生的抗体和c3的结合潜能来检查。
92.通过大规模培养如上所述选择的杂交瘤，可以产生具有所需特性的单克隆抗体。大规模培养方法没有特别限制，但其实例包括在适当的培养基中培养杂交瘤并由此在培养基中产生单克隆抗体的方法，将杂交瘤腹膜内注射到哺乳动物，使杂交瘤增殖并在腹水中产生抗体的方法等。单克隆抗体的纯化可以通过适当组合上述从抗血清中纯化抗体的方法，例如deae阴离子交换层析、亲和层析、硫酸铵分级分离、peg分级分离、乙醇分级分离来进行。
93.使抗c3抗体存在于免疫反应系统中的方法可以是使用抗c3抗体作为免疫测定试剂的成分之一的方法，也可以是添加到用于样品等的稀释液或预处理液中的方法。
94.例如，当免疫测定试剂为液体试剂时，免疫反应系统(或处于反应系统中)是指样品和液体免疫测定试剂混合的液相(或处于液相)，并且其中进行免疫反应。
95.例如，在ltia的情况下，可以将样品与含有抗c3抗体的ltia测量试剂混合，或者将样品预先与含有抗-c3抗体的预处理液混合，然后与免疫测定试剂混合。
96.在elisa的情况下，可以预先将样品与含有抗c3抗体的预处理液混合，然后滴到微孔板中，或者可以将样品与包含抗c3抗体和检测抗体的溶液混合，然后再滴到微孔板中。
97.另外，在化学发光测量试剂的情况下，可以预先将样品与含有抗c3抗体的预处理液混合，然后与免疫测定试剂混合，或者可以将抗c3抗体包含在免疫测定试剂中(例如，含有用于检测的抗体或抗原以及磁性颗粒的溶液)。
98.当免疫反应在固相上进行时，如在免疫层析等上，免疫反应系统(或处于免疫反应系统中)是指在其上进行液体样品和结合配偶体的免疫反应的固相(或处于固相上)。在这种情况下，可以预先将样品与含有抗c3抗体的预处理液混合，然后将其滴到免疫层析测试条中。或者，可以将抗c3抗体干燥并保持在样品垫上，并且抗c3抗体可以随着样品滴加而溶解并在固相中展开从而存在于反应系统中。
99.在本发明中，抗c3抗体的浓度可以是不会强烈影响分析物和特异性结合配偶体的免疫反应并且能够表现出抑制非特异性反应的期望效果的任何浓度，并且本领域技术人员可以根据分析物和样本的种类适当地设定浓度。免疫反应系统中的抗c3抗体浓度也根据免疫反应系统的试剂成分而不同，但作为10μl样本中的抗c3抗体的重量，为0.1至1000μg，优选为1.0至750μg，更优选2.0至500μg，进一步优选3.0至250μg，最优选5.0至150μg，但浓度不限于这些浓度。例如，有时优选5.0至120μg、5.0至110μg、5.0至100μg、5.0至80μg、5.0至60μg、5.0至50μg。作为该范围的下限，有时优选10.0μg或以上、15.0μg或以上或20.0μg或以上。
100.可以使用一种抗c3抗体，或者也可以使用多于一种抗c3抗体的混合物。另外，可以组合使用单克隆抗体和多克隆抗体，也可以使用与不溶性载体结合的抗c3抗体。当组合使用两种以上抗c3抗体时，抗体的总浓度可以是上述浓度范围内的任何浓度。
101.当本发明的测量试剂中预先含有抗c3抗体时，可以以在反应系统中达到上述浓度的方式将抗c3抗体包含在测量试剂中。
102.(乳胶免疫凝集测定(ltia))
103.现在将解释作为本发明的免疫测定方法之一的ltia。通过ltia测量分析物的方法可以大致分为两种。
104.在第一种方法中，带有分析物的特异性结合配偶体的乳胶颗粒与分析物反应形成夹心型免疫复合物。然后根据由于免疫复合物的形成而导致的乳胶颗粒的凝集程度来测量分析物。
105.在第二种方法中，将固定有多种分析物或其类似物(包括其片段)的蛋白质等预先添加到试剂中。当这些蛋白质等与样品中的分析物竞争时，试剂中所含的分析物与固定有分析物的特异性结合配偶体的胶乳颗粒之间的免疫复合物的形成受到抑制。然后根据由于免疫复合物形成的抑制而对所述胶乳颗粒的凝集的抑制程度来测量分析物(抗原)。
106.作为分析物和分析物的特异性结合配偶体，可以根据目的选择任何物质。例如，当分析物是抗原时，可以选择诸如多克隆抗体和单克隆抗体(包括重组抗体和抗体的功能片段)的抗体作为分析物的特异性结合配偶体。当分析物是抗体时，可以选择抗原例如天然形式和重组抗原作为分析物的特异性结合配偶体。本技术的发明可以用于这两种方法，具体地，举例说明以下步骤：
107.(1)使样品中的分析物和抗c3抗体在溶液中彼此接触的步骤；
108.(2)将带有分析物的特异性结合配偶体的乳胶颗粒添加到步骤(1)后的溶液中的步骤；
109.(3)光学检测步骤(2)后的溶液中乳胶颗粒的凝集程度的步骤。
110.这里，步骤(3)意指“在步骤(2)期间或在步骤(2)之后测量分析物和胶乳颗粒的凝集反应而不进行任何洗涤/分离步骤的步骤”。
111.在ltia中，可以通过光学或电化学观察产生的凝集程度来测量待测物质。光学观察法是利用光学装置测量散射光强度、吸光度或透射光强度的方法(终点法、速率法等)。样品中包含的分析物的浓度(定量值)是通过将通过测量样品获得的吸光度等的测量值与通过测量标准物(具有已知分析物浓度的样品)获得的吸光度等的测量值进行比较来计算的。在这点上，诸如透射光和散射光的吸光度等可以通过单波长测量或双波长测量(由两个波长产生的差或比值)来测量。测量的波长通常确定在500nm至900nm的范围内。
112.本发明的样品中的分析物可以通过手工过程或使用诸如测量装置的装置来测量。测量装置可以是通用的自动分析装置，也可以是专用的测量装置(专用装置)。测量优选通过两步法(双试剂法)等使用多个操作步骤的方法进行。
113.(特异性结合配偶体-带有乳胶颗粒)
114.可以通过已知的方法例如物理吸附法、化学键合法或其组合将分析物的特异性结合配偶体固定并负载在胶乳颗粒上。
115.物理吸附法可以根据已知的方法进行，例如，通过将分析物的特异性结合配偶体
和乳胶颗粒在诸如缓冲液的溶液中混合并使两者彼此接触，或者通过使溶解在缓冲液等中的分析物的特异性结合配偶体与载体接触。
116.化学键合方法可以根据1983年发行的日本临床病理学学会、临床病理学出版学会编辑的“extra special issue of clinical pathology,no.53,immunoassay for clinical examination-techniques and applications
‑”
；由1991年发行的日本生化学会，东京kagaku dojin编辑的“new courses in biochemical experiment 1,protein iv”等中描述的已知方法，例如，通过将分析物的特异性结合配偶体和载体与二价交联试剂如戊二醛、碳二亚胺、酰亚胺酯和马来酰亚胺混合并接触，使分析物的特异性结合配偶体和载体的氨基、羧基、硫醇基、醛基、羟基等与二价交联试剂反应。
117.构成本发明的胶乳颗粒的合成聚合物没有特别限制，但其实例包括聚苯乙烯、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、衣康酸聚合物、苯乙烯-亲水性羧基单体共聚物例如苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-丙烯酸共聚物和苯乙烯-衣康酸共聚物等。其中，优选苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-衣康酸共聚物、苯乙烯和苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物。特别优选苯乙烯和苯乙烯-(甲基)丙烯酸共聚物。
118.胶乳颗粒上携带的特定物质的特异性结合配偶体优选为多于一种以形成夹心结构。当特定物质具有多于一个被抗体识别的位点时，特异性结合配偶体可以是一种。例如，当特异性结合配偶体是单克隆抗体时，使用具有不同识别位点的两种或更多种单克隆抗体。此外，例如，当特异性结合配偶体是多克隆抗体时，多克隆抗体可以源自一种抗血清或源自多于一种抗血清。此外，可以组合使用单克隆抗体和多克隆抗体。
119.当需要进行处理以抑制胶乳颗粒的自发凝集、非特异性反应等时，可以通过已知的方法处理载体进行封闭(掩蔽)，例如用诸如牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白、明胶、卵白蛋白或其盐的蛋白质、表面活性剂、脱脂奶粉等接触或覆盖乳胶颗粒的表面。
120.(免疫测定试剂)
121.本发明的免疫测定方法的免疫反应使用免疫测定试剂进行，该试剂的特征在于，除了主要反应成分之外，还含有抗c3抗体。主要反应成分包括分析物的特异性结合配偶体(抗c3抗体除外)以及不溶性载体，如免疫测定颗粒、免疫层析试纸条和微孔板等。
122.本发明的免疫测定试剂可以含有缓冲液、蛋白质、肽、氨基酸、核酸、脂质、磷脂、糖类、无机盐、聚合物化合物、表面活性剂、另一种抑制非特异性反应的试剂、防腐剂等，只要抑制非特异性反应的效果不被抑制即可。作为用于缓冲或调节样品的ph、离子强度、渗透压等的成分，例如，试剂可以含有缓冲液，例如乙酸、柠檬酸、磷酸、tris、甘氨酸、硼酸、碳酸、邻苯二甲酸、琥珀酸、马来酸、咪唑和good's缓冲剂及其钠盐、钾盐、钙盐等。另外，试剂可以含有诸如聚乙烯吡咯烷酮的聚合物、磷脂聚合物等作为促进凝集形成的成分。
123.构成试剂中的抗c3抗体浓度可以是这样的方式，即当试剂和样品混合时，即在测量时，该浓度可以调节到免疫反应系统中的浓度，并且根据试剂类型而不同。
124.(试剂盒)
125.本发明的试剂盒的特征在于，试剂盒成分中至少含有抗c3抗体。除了涉及免疫测定的试剂之外，试剂盒成分还包括样品稀释液、样品提取液等，但在本发明中，可以将抗c3抗体添加到其中的任意一种或其中的两种或更多种中。试剂盒成分还可以包括用户指南、样品采集工具(采集移液管、注射器、棉拭子、过滤器等)。
126.将分别解释采用免疫测定方法的试剂成分。
127.《乳胶免疫凝集测量方法》
128.作为免疫测定方法的乳胶免疫凝集测量方法的试剂(ltia试剂)作为例子。
129.(1)第一试剂，其含有抗c3抗体。
130.(2)第二试剂，其含有带有分析物的特异性结合配偶体的乳胶颗粒。
131.第一试剂通常含有缓冲液，并且缓冲液中的抗c3抗体浓度可以是任何形式，使得当试剂与样品混合时，即在测量时，可以将浓度调节至优选的抗c3抗体浓度，并且随试剂类型的不同而不同。抗c3抗体可以包含在第一试剂中以及第二试剂中。
132.在ltia试剂中，在通用的第一试剂中所含的抗c3抗体的浓度为1至2000μg/ml，优选为5至1500μg/ml，更优选为10至1000μg/ml，进一步优选为15至500μg/ml，最优选25至500μg/ml，但不限于该浓度。
133.当在对样本进行ltia之前向样本添加样本稀释液、预处理液等时，预处理液中可以含有抗c3抗体，并且预处理液中的抗c3抗体浓度为1至2000μg/ml，优选5至1500μg/ml，更优选10至1000μg/ml，进一步优选15至500μg/ml，最优选25至500μg/ml，但不限于该浓度。
134.抗c3b抗体、抗ic3b抗体、抗c3dg抗体和抗c3d抗体也可以以与上述抗c3抗体相似的浓度范围使用。
135.作为用于本发明的免疫测定颗粒，除了胶乳颗粒之外，还可以使用能够带有分析物的特异性结合配偶体的已知颗粒。例如，金属胶体、二氧化硅、碳等的无机颗粒也可以用作本发明的免疫测定颗粒。
136.免疫测定颗粒的尺寸可以在0.05至1μm的范围内适当地确定，使得考虑到所使用的光学测量方法(例如，用于测量透射光的浊度计、用于测量散射光的比浊法等)，可以获得期望的测量灵敏度、期望的测量范围等。在自动分析装置的光学测量中，通常使用0.1至0.4μm的平均粒径，但其大小并不限于此。
137.《elisa》
138.elisa是一种使用各种类型的抗原-抗体反应的组合并且其中酶标记的抗原或抗体最终掺入到反应系统中以检测酶活性的方法。为了检测酶活性，使用具有随反应变化的吸收光谱的底物，根据抗原-抗体反应类型的组合，有直接测定、间接测定、夹心测定、竞争测定等。
139.作为本发明的免疫测定方法的夹心elisa的试剂显示为实例：
140.(a)不溶性载体，其上固定有与分析物反应的抗体；
141.(b)用标记物质标记并与分析物反应的抗体。
142.(a)的不溶性载体优选为平板，标记物质可以适当选择并使用。固定在不溶性载体上的抗体捕获含有样品的溶液中的分析物并在不溶性载体上形成复合物。标记物质标记的抗体与捕获的分析物结合并与复合物形成三明治。通过采用适合标记物质的方法测定标记物质的量，可以测定样品中的分析物。作为将抗体固定于不溶性载体的方法，使抗体与标记物质结合的方法等具体方法，可以没有特别限制地使用本领域技术人员已知的方法。
143.在elisa中，可以使用于本发明的抗c3抗体存在于免疫反应系统中，例如，通过向样品稀释剂、预处理液等中添加或向用于进行抗原-抗体反应的溶液中添加。
144.《免疫层析》
145.对作为本发明的免疫测定方法的免疫层析的试剂成分(测试条成分)进行说明。
146.免疫层析测试条；
147.当抗体用作特异性结合配偶体时，测试条在多孔膜等不溶性载体片上在含有样品的溶液的展开方向上按此顺序排列有“1.样品施加部分”,“2.保持标记抗体的部分(标记抗体保持部分)”和“3.“其上固定有用于捕获由标记抗体和针对分析物的抗体形成的复合物的抗体的部分(捕获抗体部分)”。
148.免疫层析至少包括上述测试条。当将预定量的含有分析物的样品添加到样品施加部分时，样品通过毛细管现象进入标记保持部，分析物和标记抗体彼此结合并形成复合物。复合物在膜中展开，当复合物进入捕获抗体部分时，被固定在膜上的抗体(捕获抗体)捕获，形成捕获抗体-分析物-标记抗体复合物。通过用一种方法(例如，如在胶体金等中使标记可视化时的凝集图像，或者在酶的情况下通过添加底物的显色反应)检测标记，可以检测分析物。
149.在免疫层析中，可以使用于本发明的抗c3抗体存在于反应体系中，例如，通过向样品稀释剂、预处理液等中添加或在样品施加部分或标记保持部分中添加，然后干燥和保持。
150.《化学发光测量》
151.在该方法中，在使抗原或抗体结合的磁性颗粒与分析物反应形成复合物之后，利用磁铁去除未反应的物质。进一步添加含有标记抗体的试剂，利用磁铁除去未反应的物质后，添加发光试剂，测定发光强度。使用酶作为标记的测定称为化学发光酶免疫测定(cleia)。使用钌-吡啶络合物等金属络合物作为标记，通过电化学反应来测量发光强度的测定称为电化学发光免疫测定(eclia)。使用化学发光物质作为标记的测定称为化学发光免疫测定(clia)。
152.作为本发明的免疫测定方法的cleia的试剂显示为实例。
153.(a)磁性颗粒，其上固定有与分析物反应的抗体(或抗原)。
154.(b)抗体(或抗原)，其用酶标记并与分析物反应。
155.(c)发光试剂。
156.固定在磁性颗粒上的抗体捕获含有样品的溶液中的分析物并形成复合物。用酶标记物质标记的抗体与捕获的分析物结合并与复合物形成三明治。通过使酶标记物质与发光试剂反应并测量发光强度，可以测量样品中的分析物。
157.在cleia中，可以使用于本发明的抗c3抗体存在于免疫反应系统中，例如，通过向样品稀释剂、预处理液等中添加或向进行抗原-抗体反应的溶液中添加。
158.(特异性结合配偶体)
159.在本发明中，分析物的特异性结合配偶体可以是除抗c3抗体之外的蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖、核酸、半抗原等。尽管分子量的高低及其来源(例如天然的或合成的)没有特别限制，但特异性结合配偶体可以是可用于免疫测定的抗体或抗原。
160.抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。更优选单克隆抗体。
161.在本发明中，作为抗体，除了整个抗体分子之外，还可以使用具有抗原-抗体反应性的抗体的功能片段。抗体可以是通过一般动物(小鼠、山羊、绵羊等)的免疫步骤获得的抗体或者使用基因重组技术等将氨基酸序列改变为与用免疫原(待测物质/分析物)免疫的动物不同的动物物种的序列的抗体(嵌合抗体、人源化抗体、完全人源化抗体等)。抗体的功能
片段包括f(ab')2和fab'，它们是具有抗原-抗体反应性的片段，以及单链抗体(scfv)、vhh(重链抗体的重链可变结构域)抗体、ignar(新抗原受体)抗体等。抗体的功能片段可以通过用蛋白酶(例如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)处理如上所述获得的抗体来制备。
162.(样品)
163.含有本发明的分析物的样品的实例包括人或动物的血液、血清、血浆、培养上清液、尿液、脊髓液、唾液、汗液、腹水、细胞或组织的提取物等。
164.本发明中的样品除了从活体获得的样品本身之外，还包括经过稀释和纯化等预处理的样品。
165.(待测物质/分析物)
166.本发明的免疫测定试剂可以使用样品中含有的各种物质作为分析物。分析物是不与用于抑制非特异性反应的抗c3抗体反应的物质。分析物可以是蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖类、核酸、半抗原等，但没有特别限制，只要该物质理论上可以测量即可。其实例包括crp(c-反应蛋白)、lp(a)、mmp3(基质金属蛋白酶-3)、抗磷脂抗体、胶原iv、psa、bnp(脑钠肽)、胰岛素、白蛋白、胱抑素c、rf(类风湿因子)、kl-6、降钙素原、fdp、d-二聚体、sf(可溶性纤维蛋白)、tat(凝血酶-抗凝血酶iii复合物)、pai-1、苯妥英、苯巴比妥、卡马西平、丙戊酸、茶碱、tarc(胸腺和活化调节趋化因子)、sil-2r(可溶性白细胞介素2受体)等。
167.(抑制非特异性反应的方法)
168.生物样品中所含的一些成分经常会引起本不应引起的免疫测定颗粒的凝集(正测量误差)，或不会引起本应引起的免疫测定颗粒的凝集(负测量误差)，所述免疫测定颗粒上固定有分析物的特异性结合配偶体。这些被称为非特异性反应，已知会导致各种测量误差。
169.在本发明中，抑制非特异性反应是指作用于生物样品中引起非特异性反应的因子(非特异性因子)，并抑制免疫反应以外的反应对测量的影响。本发明可以通过在抗c3抗体存在下进行免疫反应来抑制非特异性反应。
170.(抑制非特异性反应的试剂)
171.本发明的用于抑制非特异性反应的试剂应当包含在免疫测定方法中能够抑制源自样品的非特异性反应并且包含至少抗c3抗体作为活性成分的物质。对于本发明的用于抑制非特异性反应的试剂，试剂组分中包括抗c3抗体的组分可以原样使用，或者也可以不进行任何修饰或改变。本发明的用于抑制非特异性反应的试剂可以含有缓冲液、蛋白质、肽、氨基酸、核酸、脂质、磷脂、糖类、无机盐、聚合物化合物、表面活性剂、其它抑制非特异性反应的试剂、防腐剂等，只要抑制非特异性反应的效果不被抑制即可。
172.下面参考实施例详细解释本发明，但本发明不应限于以下实施例。
实施例
173.[实施例i：ltia中非特异性反应的抑制：tarc的测量]
[0174]
以下示出使用添加了本技术发明的抗c3d多克隆抗体和其他抑制非特异性反应的试剂通过ltia测量样品的tarc浓度的试验。使用的样品是显示出与通过化学发光酶免疫测定法(cleia)测量值(比较例1)接近的值的样品(对照样本：样本1-3)和显示出非特异性反应并且具有与比较例1的测量值大不相同的值的样品(偏离样本：样本4-10)
[0175]
[比较例(有时缩写为“cmp.ex.”)1](cleia测量)
[0176]
1.测量方法
[0177]
1-1.测量试剂
[0178]
hiscl(注册商标)tarc(sysmex corporation)
[0179]
1-2.样品
[0180]
生理盐水(otsuka生理盐水)和样本(血清)1-10
[0181]
1-3.测量程序
[0182]
使用hiscl(注册商标)-5000(sysmex corporation)根据试剂所附文件进行测量。
[0183]
2.测量结果
[0184]
测量结果如表1所示。
[0185]
比较例1所示的cleia包括b/f分离操作并具有洗涤步骤。因此，cleia是不易受到样品来源的非特异性反应影响的测量方法，因此将其用作比较例。
[0186]
[比较例2](ltia测量：不添加用于抑制非特异性反应的试剂)
[0187]
1.测量方法
[0188]
1-1.测量试剂
[0189]
制备由如下所示的第一试剂和第二试剂组成的ltia试剂。
[0190]
(1)第一试剂
[0191]
100mm mops-naoh(ph 7.5)
[0192]
500mm nacl
[0193]
0.5％ bsa
[0194]
(2)第二试剂
[0195]
抗人tarc单克隆抗体致敏乳胶(两种)
[0196]
5mm mops-naoh(ph 7.0)
[0197]
这里，抗人tarc单克隆抗体是使用市售的tarc抗原通过本领域技术人员已知的方法获得的。市售tarc抗原包括ccl17、胸腺和活化调节趋化因子(shenandoah biotechnology,inc.)、ccl17/tarc、人(lifespan biosscience,inc.)和人tarc(ccl17)(abeomics,inc.)。此外，通过本领域技术人员已知的方法选择可用于tarc抗原的夹心测定的单克隆抗体的组合。参照jp-a-2017-181377中描述的方法制备抗人tarc单克隆抗体致敏乳胶。
[0198]
1-2.样品
[0199]
与对比例1的样品相同。
[0200]
1-3.测量程序
[0201]
将第一试剂和第二试剂合并，使用日立自动分析仪3500测量样品的tarc浓度。具体而言，向2.4μl样品中添加120μl第一试剂，在37℃下孵育5分钟后，添加40μl第二试剂并搅拌。在接下来的五分钟内，在570nm的主波长和800nm的副波长下测量由于凝集形成引起的吸光度的变化，并且通过将吸光度的变化应用于通过测量具有已知浓度的标准物而获得的校准曲线来计算测量值。
[0202]
2.测量结果
[0203]
测量结果如表1所示。另外，比较例2的测量值与比较例1的测量值的相关性示于图1。
[0204]
[比较例3](ltia测量：添加hbr-1)
[0205]
除了在比较例2所示的第一试剂中以100μg/ml添加用于抑制非特异性反应的市售试剂hbr-1(scantibodies laboratory，inc.)以外，用与比较例2相同的方法进行测量。测量结果如表1所示。另外，比较例3的测量值与比较例1的测量值的相关性示于图2。
[0206]
[实施例1](ltia测量：添加抗c3d多克隆抗体)
[0207]
除了在比较例2所示的第一试剂中以100μg/ml添加抗c3d多克隆抗体(bio-rad)以外，通过与比较例2相同的方法进行测量。测量结果如表1所示。另外，实施例1的测量值与比较例1的测量值的相关性示于图3。
[0208]
[表1]
[0209]
样品中测量的tarc值(pg/ml)
[0210][0211]
(结果与讨论)
[0212]
根据比较例1至3、实施例1以及参考例1的结果，对本技术的发明的效果进行讨论。
[0213]
(1)检查对照样本(样本编号1至3)的测量结果。
[0214]
对照样本的cleia测量值(比较例1)和未添加抑制非特异性反应的试剂的ltia测量值(比较例2)大致相同。另外，添加了本技术的发明的抗c3d多克隆抗体的ltia测量值(实施例1)也与比较例1和比较例2大致相同。因此，可知抗c3d多克隆抗体的添加对未表现出非特异性反应的样本的测量值没有影响。这里，在比较例3中，样本3的测量值与比较例1的测量值不同。据信当添加hbr-1时会发生不期望的反应。
[0215]
(2)检查偏离样本(样本编号4至10)的测量结果。
[0216]
4号样本的cleia测量值(比较例1)为205pg/ml，而未添加抑制非特异性反应的试剂的情况下的ltia测量值(比较例2)为669pg/ml，这是有很大差异的测量值。另外，添加了hbr-1的ltia的测量值(比较例3)为634pg/ml，与比较例1相比有很大差异。另一方面，添加本技术的发明的抗c3d多克隆抗体的ltia的测量值(实施例1)为271pg/ml，显示出接近比较例1的值的趋势。对于样本5至10也得到了类似的结果。
[0217]
根据以上结果，通过在免疫测定中的免疫反应系统中存在本技术的发明的抗c3d抗体，可以抑制源自样品的非特异性反应。本发明能够抑制即使使用市售的抑制非特异性反应的试剂hbr-1也无法抑制的非特异性反应，这是出乎意料的结果。
[0218]
这里，虽然试验中使用的偏离样本是含有大范围浓度的rf的样本，但是没有发现rf的量和测量值的偏离之间存在相关性(数据未示出)。因此，暗示本技术的发明的抗c3d抗体抑制非特异性反应的效果不太可能受到rf量的影响。
[0219]
[实施例ii：ltia中非特异性反应的抑制：sil-2r的测量]
[0220]
以下示出使用添加了本技术的发明的抗c3d多克隆抗体和其他抑制非特异性反应的试剂通过ltia测量样品的sil-2r浓度的试验。使用的样品是显示出与通过化学发光酶免疫测定(cleia)测得的值(比较例4)接近的值的样品(对照样本：样本11-15)和显示出非特异性反应并且具有与比较例4的测得值大不相同的值的样品(偏离样本：样本16和17)。
[0221]
[比较例4](cleia测量)
[0222]
1.测量方法
[0223]
1-1.测量试剂
[0224]
lumipulse presto(注册商标)il-2r(fujirebio inc.)
[0225]
1-2.样品
[0226]
样本(血清)11-17
[0227]
1-3.测量程序
[0228]
使用lumipulse(注册商标)-l2400(fujirebio inc.)根据试剂所附文件进行测量。
[0229]
2.测量结果
[0230]
测量结果如表2所示。
[0231]
比较例4所示的cleia包括b/f分离操作并具有洗涤步骤。因此，cleia是不易受到样品来源的非特异性反应影响的测量方法，因此将其用作比较例。
[0232]
[比较例5](ltia测量：不添加用于抑制非特异性反应的试剂)
[0233]
1.测量方法
[0234]
1-1.测量试剂
[0235]
根据jp-a-2017-181377中描述的方法制备第一试剂和第二试剂。
[0236]
1-2.样品
[0237]
与对比例4的样品相同。
[0238]
1-3.测量程序
[0239]
将第一试剂和第二试剂合并，并使用日立7180型自动分析仪测量样品的sil-2r浓度。具体而言，向5.6μl样品中添加120μl第一试剂，在37℃下孵育5分钟后，添加40μl第二试剂并搅拌。在接下来的五分钟内，在570nm的主波长和800nm的副波长下测量由于凝集形成引起的吸光度的变化，并且通过将吸光度的变化应用于通过测量具有已知浓度的标准物而获得的校准曲线来计算测量值。
[0240]
2.测量结果
[0241]
测量结果如表2所示。
[0242]
[比较例6](ltia测量：添加hbr-1)
[0243]
除了在比较例5所示的第一试剂中以100μg/ml添加hbr-1(scantibodies laboratory，inc.)以外，用与比较例5相同的方法进行测量。测量结果如表2所示。
[0244]
[实施例2](ltia测量：添加抗c3d多克隆抗体)
[0245]
除了在比较例5所示的第一试剂中以100μg/ml添加抗c3d多克隆抗体(bio-rad)以外，用与比较例5相同的方法进行测量。测量结果如表2所示。
[0246]
[表2]
[0247]
样品中测量的sil-2r值(u/ml)
[0248][0249]
(结果与讨论)
[0250]
根据比较例4至6和实施例2的结果，对本技术的发明的效果进行讨论。
[0251]
(1)检查对照样本(样本编号11至15)的测量结果。
[0252]
对照样本的cleia测量值(比较例4)和未添加抑制非特异性反应的试剂的ltia测量值(比较例5)大致相同。另外，添加了本技术的发明的抗c3d多克隆抗体的ltia测量值(实施例2)也与比较例4和比较例5的测量值大致相同。因此，可知抗c3d多克隆抗体的添加对未表现出非特异性反应的样本的测量值没有影响。
[0253]
(2)检查偏离样本(样本编号16和17)的测量结果。
[0254]
样本编号16的cleia测量值(比较例4)为346u/ml，而未添加抑制非特异性反应的试剂的情况下的ltia测量值(比较例5)为1401u/ml，这是有很大差异的测量值。另外，添加了hbr-1的ltia的测量值(比较例5)为1216u/ml，与比较例4相比有很大差异。
[0255]
另一方面，添加本技术的发明的抗c3d多克隆抗体的ltia的测量值(实施例2)为409u/ml，显示出接近比较例4的值的趋势。对于样本17也得到了类似的结果。
[0256]
根据以上结果，通过在免疫测定中的免疫反应系统中存在本技术的发明的抗c3d抗体，可以抑制源自样品的非特异性反应。因为本发明可以抑制非特异性反应，该非特异性反应使用市售的用于抑制非特异性反应的试剂hbr-1也不能抑制，所以本发明的抗c3d抗体抑制非特异性反应的效果是出乎意料的结果。
[0257]
[实施例iii:elisa中非特异性反应的抑制：sil-2r的测量]
[0258]
以下示出使用添加了本技术发明的抗c3d多克隆抗体和其他抑制非特异性反应的试剂通过elisa测量样品的sil-2r浓度的试验。使用的样品是显示出与通过化学发光酶免疫测定法(cleia)测得的值(比较例7)接近的值的样品(对照样本：样本18-22)和显示出非特异性反应并且具有与比较例7的测得值大不相同的值的样品(偏离样本：样本23)。
[0259]
[比较例7](cleia测量)
[0260]
1.测量方法
[0261]
1-1.测量试剂
[0262]
lumipulse presto(注册商标)il-2r(fujirebio inc.)
[0263]
1-2.样品
[0264]
血清样本18-23
[0265]
1-3.测量程序
[0266]
使用lumipulse(注册商标)l2400(fujirebio inc.)根据测量试剂所附文件进行测量。
[0267]
2.测量结果
[0268]
测量结果如表3所示。
[0269]
[比较例8](elisa测量：不添加用于抑制非特异性反应的试剂)
[0270]
1.测量方法
[0271]
1-1.样品
[0272]
与对比例7的样品相同。
[0273]
1-2.测量程序
[0274]
使用与比较例5中使用的抗体相同的抗体。
[0275]
将抗sil-2r单克隆抗体以10μg/ml溶解在含有150mm氯化钠(ph7.2；以下称为pbs)的20mm磷酸盐缓冲液中，并将100μl溶液分配到96孔微孔板的孔中。将板在4℃下静置过夜。
[0276]
用400μl含有0.05％吐温(注册商标)20的pbs(以下称为pbst)洗涤孔三次后，加入200μl含有1％牛血清白蛋白的pbst(以下称之为bsa-pbst)，并在室温下封闭孔一小时。该板被用作elisa板。
[0277]
用400μl pbst洗涤elisa板的孔三次后，将100μl用样品稀释剂(bsa-pbst)稀释40倍的样品加入孔中，并将板在室温下静置一小时。用400μl pbst洗涤孔三次后，将100μl生物素标记的抗sil-2r单克隆抗体(用bsa-pbst稀释至0.50μg/ml)分配到孔中，并将板在室温下静置一小时。用400μl pbst洗涤孔三次后，将100μl hrp标记的链霉亲和素(thermofishier scientific)(用bsa-pbst稀释至0.20μg/ml)分配到孔中，并将板在室温下静置30分钟。用400μl pbst洗涤孔三次后，加入50μl含有0.2％邻苯二胺和0.02％过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液(ph5.0)，并将板在室温下放置10分钟。然后，通过加入50μl 4.5n硫酸停止酶促反应，并测量在492nm波长下的吸光度。
[0278]
使用已知浓度的标准品作为校准器，并计算待测样品中的sil-2r值。测量结果如表3所示。
[0279]
[比较例9](elisa测量：添加hbr-1)
[0280]
除了在比较例8所示的样本稀释剂(bsa-pbst)中以100μg/ml添加hbr-1(scantibodies laboratory，inc.)以外，用与比较例8相同的方法进行测量。测量结果如表3所示。
[0281]
[实施例3](elisa测量：添加抗c3d多克隆抗体)
[0282]
除了在比较例8所示的样本稀释剂(bsa-pbst)中以100μg/ml添加抗c3d多克隆抗体(bio-rad)以外，用与比较例8相同的方法进行测量。测量结果如表3所示。
[0283]
[表3]
[0284]
样品中测量的sil-2r值(u/ml)
[0285][0286]
(结果与讨论)
[0287]
根据比较例7至9和实施例3的结果，对本技术的发明的效果进行讨论。
[0288]
(1)检查对照样本(样本编号18至22)的测量结果。
[0289]
对照样本的cleia测量值(比较例7)和未添加抑制非特异性反应的试剂的elisa测量值(比较例8)大致相同。另外，添加了本技术的发明的抗c3d多克隆抗体的ltia测量值(实施例3)也与比较例7和比较例8的测量值大致相同。因此，可知抗c3d多克隆抗体的添加对未表现出非特异性反应的样本的测量值没有影响。
[0290]
(2)检查偏离样本(样本编号23)的测量结果。
[0291]
样本编号23的cleia测量值(比较例7)为1534u/ml，而未添加抑制非特异性反应的试剂的情况下的elisa测量值(比较例8)为2132u/ml，这是有很大差异的测量值。另外，添加了hbr-1的elisa的测量值(比较例9)为2155u/ml，与比较例7相比有很大差异。
[0292]
另一方面，添加本技术的发明的抗c3d多克隆抗体的elisa的测量值(实施例3)为1338u/ml，显示出接近比较例4的值的趋势。结果发现，通过添加抗c3d多克隆抗体，可以抑制比较例8和9中引起的一些非特异性反应。
[0293]
根据以上结果，通过在免疫测定中的免疫反应系统中存在本技术的发明的抗c3d抗体，可以抑制非特异性反应。因为本发明可以抑制非特异性反应，其使用市售的用于抑制非特异性反应的试剂hbr-1也不能抑制，所以本发明的抗c3d抗体抑制非特异性反应的效果是出乎意料的结果。发现这种抑制非特异性反应的效果不仅在实施例i和ii的同质测定系统中表现出，而且在实施例iii的异质测定系统中也表现出。
[0294]
[实施例iv：ltia中非特异性反应的抑制：sil-2r的测量]
[0295]
以下示出使用添加了本技术的发明的抗c3d多克隆抗体和其他抑制非特异性反应的试剂通过ltia测量样品的sil-2r浓度的试验。使用的样品是显示出与通过化学发光酶免疫测定法(cleia)测得的值(比较例10)接近的值的样品(对照样本：样本12、24和25)和显示出非特异性反应并且具有与比较例10的测得值大不相同的值的样品(偏离样本：样本16和17)。
[0296]
[比较例10](cleia测量)
[0297]
1.测量方法
[0298]
1-1.测量试剂
[0299]
lumipulse presto(注册商标)il-2r(fujirebio inc.)
[0300]
1-2.样品
[0301]
样本(血清)12、16、17、24和25
[0302]
1-3.测量程序
[0303]
使用lumipulse(注册商标)-l2400(fujirebio inc.)根据试剂所附文件进行测量。
[0304]
2.测量结果
[0305]
测量结果如表4所示。
[0306]
[比较例11](ltia测量：不添加抑制非特异性反应的试剂)
[0307]
1.测量方法
[0308]
1-1.测量试剂
[0309]
使用比较例5中制备的第一试剂和第二试剂。
[0310]
1-2.样品
[0311]
与对比例10的样品相同。
[0312]
1-3.测量程序
[0313]
通过与比较例5中相同的方法进行测量。
[0314]
2.测量结果
[0315]
测量结果如表4所示。
[0316]
[比较例12](ltia测量：添加hbr-1)
[0317]
使用与比较例6相同的试剂。测量结果如表4所示。
[0318]
[实施例4](ltia测量：添加抗c3d多克隆抗体)
[0319]
通过与比较例5中相同的方法进行测量，不同之处在于将抗c3d多克隆抗体(bio-rad)以25μg/ml(实施例4-1)、50μg/ml(实施例4-2)、100μg/ml(实施例4-3)、200μg/ml(实施例子4-4)和500μg/ml(实施例4-5)添加到比较例5所示的第一试剂中。测量结果如表4所示。
[0320]
[表4]
[0321][0322]
(结果与讨论)
[0323]
根据比较例10至12和实施例4-1至4-5的结果，对本技术的发明的效果进行讨论。
[0324]
(1)检查对照样本(样本编号12、24和25)的测量结果。
[0325]
对照样本的cleia测量值(比较例10)和未添加抑制非特异性反应的试剂的ltia测量值(比较例11)大致相同。另外，添加了本技术的发明的抗c3d多克隆抗体的ltia测量值(实施例4-1至4-5)也与比较例4和比较例10和11的测量值大致相同。因此，可知抗c3d多克隆抗体的添加对未表现出非特异性反应的样本的测量值没有影响。
[0326]
(2)检查偏离样本(样本编号16和17)的测量结果。
[0327]
样本编号16的cleia测量值(比较例10)为346u/ml，而未添加抑制非特异性反应的试剂的情况下的ltia测量值(比较例11)为1419u/ml，这是有很大差异的测量值。另外，添加了hbr-1的ltia的测量值(比较例12)为1216u/ml，与比较例10相比有很大差异。另一方面，添加25μg/ml本技术的发明的抗c3d多克隆抗体的ltia的测量值(实施例4-1)为352u/ml，显示出接近比较例10的值的趋势。类似地，添加50和500μg/ml本技术的发明的抗c3d多克隆抗体(实施例4-2和4-5)的ltia的测量值分别为395和374u/ml，显示出接近比较例10的值的趋势。此外，对于样本17也得到了类似的结果。本技术的发明的抗c3d多克隆抗体显示出至少在25至500μg/ml范围内抑制非特异性反应的效果。
[0328]
[参考例1](补体c3d特异性单克隆抗体的制备)
[0329]
1.材料
[0330]
(1)完全弗氏佐剂：fujifilm wako pure chemical corporation制造，014-09541
[0331]
(2)不完全弗氏佐剂：fujifilm wako pure chemical corporation制造，011-09551
[0332]
(3)骨髓瘤细胞(sp2/o)
[0333]
(4)rpmi1640，glutamax：gibco制造，61870-036
[0334]
(5)胎牛血清(fbs)：biological industries制造，04-001-1a
[0335]
(6)hat培养基：cosmo bio co.，ltd.制造，16213004
[0336]
(7)96孔板：nunc，167008
[0337]
(8)hrp标记羊抗小鼠igg(h&l)：southern biotech制造，1031-05
[0338]
(9)补体c3d，人：sigma-aldrich制造，204870
[0339]
(10)补体c3d羊抗人多克隆抗体：lifespan biosciences公司制造，ls-c147220
[0340]
(11)生物素标记试剂盒-nh2：dojindo molecular technologies制造，lk03
[0341]
(12)c3d，人，克隆3：hycult biotech制造，hm2198
[0342]
2.产生针对人来源的补体c3d单克隆抗体的杂交瘤的生产
[0343]
(2-1)动物的免疫
[0344]
作为免疫原，使用市售的人来源的补体c3d(sigma-aldrich制造)。将等量的用含有150mm氯化钠的20mm磷酸盐缓冲液(ph7.2；以下称为pbs)稀释的免疫原和完全弗氏佐剂混合制备乳液，并将每只小鼠20μg的乳液注射到balb/cajcl小鼠中。此外，使用第二次注射的不完全弗氏佐剂，每只小鼠重复注射10μg，间隔两周四次(包括第一次免疫在内，总共五次)。通过如下所述的抗原固定化elisa测量通过从尾静脉取血获得的抗血清的抗体效价。
[0345]
(2-2)免疫的动物血清的抗体效价的评价(抗原固定化elisa)
[0346]
通过免疫原固定化elisa(抗原固定化elisa)观察免疫的动物血清中抗补体c3d的抗体的存在。抗原固定化elisa的细节如下。
[0347]
(2-2-1)抗原固定化elisa板的制备
[0348]
将免疫原补体c3d以0.5μg/ml溶解在pbs中，并将50μl溶液分配到96孔微孔板的孔中。将板在室温下静置两小时。
[0349]
用400μl含有0.05％吐温(注册商标)20的pbs(以下称为pbst)洗涤孔三次后，加入100μl含有1％牛血清白蛋白的pbst(以下称之为bsa-pbst)，并在室温下封闭孔一小时。该板被用作elisa板。
[0350]
(2-2-2)抗原固定化elisa
[0351]
从elisa板的孔中除去bsa-pbst后，将50μl用bsa-pbst连续稀释的免疫的动物的抗血清和未免疫的动物的血清添加到孔中，将板静置在室温下放置一小时。用400μl pbst洗涤孔3次后，将用bsa-pbst稀释9500倍的50μl hrp标记的抗小鼠igg(h&l)分配到孔中，并将板在室温下静置一个小时。用400μl pbst洗涤孔三次后，加入50μl含有0.2％邻苯二胺和0.02％过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液(ph5.0)，并将板在室温下放置10分钟。然后，通过加入50μl 1.5n硫酸停止酶促反应，并测量在492nm波长下的吸光度。从作为测量结果观察到抗体效价增加的小鼠中，取出脾脏和淋巴结，制备脾脏和淋巴节来源的细胞并用于细胞融合。
[0352]
(2-3)细胞融合
[0353]
将脾脏来源的细胞或淋巴结来源的细胞与骨髓瘤细胞以一比一的细胞比例混合，并通过电脉冲法融合细胞。将融合细胞悬浮在hat培养基中，并在37℃、5％co2的co2培养箱中培养8天，从而获得融合细胞(杂交瘤)。
[0354]
(2-4)杂交瘤的筛选(夹心elisa)
[0355]
使用抗补体c3d多克隆抗体通过夹心elisa选择杂交瘤。夹心elisa的详细内容如下。
[0356]
(2-4-1)夹心elisa板的生产
[0357]
将抗小鼠igg抗体以5μg/ml溶解在pbs中，并将50μl溶液分配到96孔微孔板的孔中。将板在室温下静置两小时。
[0358]
用400μl含有0.05％吐温(注册商标)20的pbs(以下称为pbst)洗涤孔三次后，加入100μl含有1％牛血清白蛋白的pbst(以下称之为bsa-pbst)，并在室温下封闭孔一小时。该板被用作elisa板。
[0359]
(2-4-2)夹心elisa
[0360]
从elisa板的孔中除去bsa-pbst后，将杂交瘤的培养上清液加入孔中，并将板在室温下静置1小时。用400μl pbst洗涤孔三次后，将50μl补体c3d(thermofishier scientific)(用bsa-pbst稀释至50ng/ml)分配到孔中，并将板在室温下静置1小时。在用400μl pbst洗涤孔三次后，将50μl抗补体c3d多克隆抗体(由lifespan biosciences制造)分配到孔中，该抗体使用生物素标记试剂盒(由dojindo molecular technologies制造)用生物素标记并用bsa-pbst稀释至0.8μg/ml，并且将板在室温下静置1小时。用400μl pbst洗涤孔三次后，将50μl hrp标记的链霉亲和素(用bsa-pbst稀释至0.20μg/ml)分配到孔中，并将板在室温下静置30分钟。用400μl pbst洗涤孔三次后，加入50μl含有0.2％邻苯二胺和0.02％过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液(ph5.0)，并将板在室温下放置10分钟。然后，通过加入50μl 1.5n硫酸停止酶促反应，并测量在492nm波长下的吸光度。选择作为测量结果具有高吸光度的孔作为具有产生抗补体c3d抗体的杂交瘤的孔(阳性孔)。这里，使用浓度为1μg/ml
的市售的小鼠来源的抗c3d单克隆抗体(由hycult biotech制造)作为阳性对照，而不是杂交瘤的培养上清液。
[0361]
(2-5)克隆
[0362]
使用(2-4)中选择的产生抗补体c3d抗体的杂交瘤株，获得杂交瘤的单克隆，并纯化单克隆抗体。通过常规方法(有限稀释分析)进行克隆。通过与上述夹心elisa类似的方法选择阳性孔，最终获得5种产生单克隆抗体的杂交瘤。由杂交瘤s3520x(x＝1至5)产生的单克隆抗体称为s3520x抗体。
[0363]
[实施例v：ltia中非特异性反应的抑制：sil-2r的测量]
[0364]
以下示出使用添加有参考例1中制备的本技术的发明的抗c3d单克隆抗体的试剂通过ltia测量样品的sil-2r浓度的试验。使用与实施例iv相同的样品。
[0365]
[实施例5](ltia测量：添加抗c3d单克隆抗体)
[0366]
除了将参考例1中制备的五种抗c3d单克隆抗体分别以100μg/ml添加到比较例5中所示的第一试剂中之外，通过与比较例5相同的方法进行测量。添加的克隆编号如下。实施例5-1：克隆号s35201，实施例5-2：克隆号s35202，实施例5-3：克隆号s35203，实施例5-4：克隆号s35204，和实施例5-5：克隆号s35205。测量结果如表5所示。
[0367]
[表5]
[0368][0369]
(结果与讨论)
[0370]
根据比较例10至12和实施例5-1至5-5的结果，对本技术的发明的效果进行讨论。
[0371]
(1)检查对照样本(样本编号12、24和25)的测量结果。
[0372]
比较例10和11的测量结果如实施例iv的讨论中所述。另外，添加了本技术的发明的抗c3d单克隆抗体的ltia测量值(实施例5-1至5-5)也与比较例10和比较例11的测量值大致相同。结果发现，抗c3d单克隆抗体的添加不会影响未表现出非特异性反应的样本的测量值。
[0373]
(2)检查偏离样本(样本编号16和17)的测量结果。
[0374]
比较例10、11和12的测量结果如在实施例iv的讨论中所述。另一方面，添加100μg/ml本技术的发明的抗c3d多克隆抗体克隆号s35201的ltia的测量值(实施例5-1)为377u/ml，显示出接近比较例10的测量值的趋势。类似地，添加100μg/ml本技术发明的抗c3d单克隆抗体，克隆号s35202至s35205的ltia的测量值(实施例5-2至5-5)为339至368u/ml，显示出接近比较例10的测量值的趋势。此外，对于样本17也得到了类似的结果。本技术的发明的抗c3d单克隆抗体表现出抑制非特异性反应的效果。
[0375]
根据以上结果，本技术的发明的抗c3d抗体抑制样品来源的非特异性反应的效果可以用多克隆抗体和单克隆抗体获得。在免疫测定中进行精确的测量是极其重要的，并且通过本发明可以抑制即使用抑制非特异性反应的市售试剂也不能抑制的非特异性反应具有重要意义。
[0376]
工业实用性
[0377]
根据本发明，通过在抗c3抗体存在下进行免疫反应，即使当样品中含有非特异性因子时，也可以进行精确的免疫测定。

技术特征：
1.用于免疫学测量样品中分析物的免疫测定方法，其包括在抗c3抗体的存在下进行免疫反应。2.根据权利要求1所述的免疫测定方法，其中所述方法是同质法或异质法。3.根据权利要求1或2所述的免疫测定方法，其中所述同质法是乳胶免疫凝集测量方法。4.根据权利要求3所述的免疫测定方法，其包括使样品中的分析物和抗c3抗体在溶液中彼此接触，将带有分析物的特异性结合配偶体的乳胶颗粒添加到溶液中，和光学检测溶液中乳胶颗粒的凝集程度。5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫测定方法，其中，抗c3抗体为选自由抗ic3b抗体、抗c3dg抗体、抗c3d抗体和抗c3b抗体组成的组中的任意一种或多种。6.用于抑制免疫学测量样品中的分析物的免疫测定方法中的非特异性反应的方法，其包括，在抗c3抗体的存在下进行免疫反应。7.根据权利要求6的用于抑制非特异性反应的方法，其中所述免疫测定方法是同质法或异质法。8.根据权利要求6或7的用于抑制非特异性反应的方法，其中，同质法是乳胶免疫凝集测量法。9.根据权利要求8的用于抑制非特异性反应的方法，其包括使样品中的分析物和抗c3抗体在溶液中彼此接触，将带有分析物的特异性结合配偶体的乳胶颗粒添加到溶液中，和光学检测溶液中乳胶颗粒的凝集程度。10.根据权利要求6至9中任一项的免疫测定方法，其中，抗c3抗体为选自由抗ic3b抗体、抗c3dg抗体、抗c3d抗体和抗c3b抗体组成的组中的任意一种或多种。11.免疫测定试剂，其包含抗c3抗体。12.根据权利要求11所述的免疫测定试剂，其中所述免疫测定的方法是同质法或异质法。13.根据权利要求12所述的免疫测定试剂，其中所述同质法是乳胶免疫凝集测量方法。14.根据权利要求11至13中任一项所述的免疫测定试剂，其中，抗c3抗体为选自由抗ic3b抗体、抗c3dg抗体、抗c3d抗体和抗c3b抗体组成的组中的任意一种或多种。15.免疫测定试剂盒，其包含抗c3抗体。16.根据权利要求15所述的免疫测定试剂盒，其中所述免疫测定的方法是同质法或异质法。17.根据权利要求16所述的免疫测定试剂盒，其中，所述同质法为乳胶免疫凝集测量方法，所述免疫测定试剂盒包括：(1)第一试剂，其含有抗c3抗体；和(2)第二试剂，其含有带有分析物的特异性结合配偶体的乳胶颗粒。18.根据权利要求15至17中任一项所述的免疫测定试剂，其中，抗c3抗体为选自由抗ic3b抗体、抗c3dg抗体、抗c3d抗体和抗c3b抗体组成的组中的任意一种或多种。19.用于抑制免疫测定方法中的非特异性反应的试剂，其包含抗c3抗体作为活性成分。
20.根据权利要求19所述的用于抑制免疫测定方法中的非特异性反应的试剂，其中，抗c3抗体为选自由抗ic3b抗体、抗c3dg抗体、抗c3d抗体和抗c3b抗体组成的组中的任意一种或多种。

技术总结
本发明的目的在于抑制免疫反应测量方法中的非特异性反应。提供了免疫测定方法，其特征在于在免疫学测量样品中的分析物的方法中，在抗C3抗体的存在下进行免疫反应。此外，提供了在免疫学测量样品中分析物的方法中抑制非特异性反应的方法，该方法的特征在于在抗C3抗体存在下进行免疫反应。体存在下进行免疫反应。


技术研发人员：藤村建午 野本悌吾 清水知 高良勇辉
受保护的技术使用者：积水医疗株式会社
技术研发日：2022.01.25
技术公布日：2023/9/26