蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用

1.本发明涉及生物医药领域中，蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用。


背景技术：

2.中性粒细胞在肿瘤进展中作用的两面性越来越被研究者们所关注，因此提出了中性粒细胞的两种极化状态以区分肿瘤相关中性粒细胞(tans)的不同功能——抗肿瘤中性粒细胞(n1)和促肿瘤中性粒细胞(n2)1(类似不同极化状态的巨噬细胞)。近年来一系列研究表明tans通过直接促进肿瘤细胞增殖及侵袭、加强胞外基质重构及血管生成、维持免疫抑制性微环境等方式促进肿瘤进展
2-4
。然而，目前关于是否存在真正意义的n1、n2中性粒细胞亚群，及其在肿瘤发展和预后中的意义仍存有争议，并且，中性粒细胞的动态异质性受其定植的组织微环境影响很大，这进一步限制了其作为标志物应用于肿瘤诊疗。
3.近年来研究发现，恶性hcc患者外周血中心粒细胞与淋巴细胞比值(nlr)增高5，并且患者肝癌组织中会出现大量弥散性中性粒细胞浸润6，因此，2019年最新版who肿瘤分类(消化系统)指南定义了一种新的hcc病理亚型——中性粒细胞浸润型，并将中性粒细胞作为患者不良预后的标志物。然而，按照指南标准(中性粒细胞浸润比例》50％)，该型hcc患者在总患者人群中占比《1％，这大大限制了在临床实践中将中性粒细胞作为标志物应用于hcc诊疗，并且其中并没有考虑到中性粒细胞异质性对患者预后的不同意义7。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何对中性粒细胞高浸润hcc患者预后实施精准分层。
5.为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测蛋白质组合表达量的物质在制备肝细胞癌患者预后或精准预后分层试剂盒中的应用，所述蛋白质组合为髓过氧化物酶(mpo,uniprot编号：p05164)和/或丙酮酸激酶(pkm，uniprot编号：p14618)。
6.其中，精准预后分层是指利用mpo与pkm表达丰度对肝细胞癌患者的生存期或不同时间(如12个月、24个月、60个月等)内的生存率进行预后分析。
7.上述应用中，所述检测蛋白质组合表达量的物质可包括通过质谱和/或免疫组织化学染色检测髓过氧化物酶和丙酮酸激酶表达量的物质。
8.所述质谱可为数据依赖型串联质谱。
9.上述应用中，免疫组织化学染色检测所用物质可为髓过氧化物酶特异性抗体和/或丙酮酸激酶特异性抗体。
10.上述应用中，所述髓过氧化物酶的表达量可为其在肝癌组织中的表达量。
11.上述应用中，所述丙酮酸激酶的表达量可为其在肝癌组织中的表达量。
12.上述应用中，所述检测蛋白质组合表达量的物质还可包括数据分析模型，所述数
据分析模型用于将所述蛋白质组合表达量数据输入cox回归模型，根据模型结果将患者分为高风险组或低风险组。
13.本发明中，肝细胞癌预后分层方法可通过将无标定量质谱(或免疫组化)检测的mpo表达量和pkm表达量输入cox回归模型获得。
14.本发明中，无标定量质谱蛋白表达量可通过如下方法获得：
15.1.数据产生方法
16.首先获取肝细胞癌患者的样本队列以及预后随访数据，同时获取手术切除的肝细胞癌组织样本，将样本进行蛋白提取、酶解后，通过ibaq无标定量方法进行高通量样本制备，随后通过数据依赖性质谱采集技术获取质谱数据，谱图原始文件使用maxquant软件进行定量解析，得到样本蛋白质组定量信息结果。
17.2.数据预处理方法
18.对于得到的蛋白质表达矩阵，使用r语言软件程序包limma中的quantile算法进行标准化，对于缺失值使用全局最小值进行插补。
19.本发明发现，在mpo高表达患者中，仅pkm同时高表达的hcc患者预后较差,而当pkm低表达时，患者的预后仍然较好。可利用mpo和pkm对肝细胞癌患者精准预后分层利用联合标志物mpo和pkm精准分层中性粒细胞高浸润hcc患者的预后，从而补充现行基于中性粒细胞诊断hcc患者预后的临床指南。
20.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术
21.人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
22.图1为流程分析图。
23.图2为独立hcc人群中mpo低表达hcc、mpo高表达hcc、以及mpo高表达hcc中pkm高表达、低表达hcc患者的kaplan-meier生存分析。
24.图3为ihc检测mpo低表达hcc、mpo高表达hcc、以及mpo高表达hcc中pkm达高表、低表达hcc患者的kaplan-meier生存分析。
具体实施方式
25.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
26.实施例1、利用mpo+pkm组合标志物精准筛选预后不良的中性粒细胞高浸润hcc患者分析流程如图1所示。
27.1、样本纳入
28.经患者知情同意，从复旦大学中山医院和北京大学肿瘤医院收集接受了外科手术切除的早期肝细胞癌患者。排除标准如下：(1)术前接受了化疗或放疗；(2)非初次手术；(3)非巴塞罗那分期0期或a期；(4)存在hcv感染；(5)失访或临床资料不全。最终共纳入101例肝
细胞癌患者，纳入标准如下：(1)巴塞罗那分期0期或a期肝细胞癌患者；(2)切除组织足够可以进行蛋白质组学数据产出；(3)随访信息与临床资料齐全。本研究得到了复旦大学中山医院和北京大学肿瘤医院伦理委员会的批准。
29.术后对患者进行随访，如死亡，预后时间记录为术后到死亡的时间间隔，若未死亡，预后时间记录为术后到最后一次随访的时间间隔，作为右删失数据。
30.2、蛋白质组学数据获取及预处理
31.肝癌组织蛋白提取。取肝细胞癌患者的的冷冻肿瘤组织，加入含蛋白酶抑制剂(roche，货号为04693116001)和磷酸酶抑制剂(roche，货号为04906837001)的t-per组织蛋白提取试剂(thermo，货号为78510)裂解蛋白，经超声破碎仪(scientz)破碎组织(25％振幅超声1min,其中超声3秒，间断3秒)，之后将所得液体在4度以16000g离心10分钟，取上清液作为组织蛋白提取物，使用bradford蛋白定量试剂(thermo，货号为23246)测定蛋白浓度。
32.超滤管辅助的组织蛋白酶切及酶切后肽段冻干。具体步骤如下：取500μg上述肝癌组织蛋白提取物用8m尿素溶液(用0.1m tris-hcl配置，ph8.5)稀释至500μl，将稀释后的样本溶液置于30kda超滤管(millipore，货号为ufc503096)中离心20分钟，然后向超滤管中加入200μl含10mm二硫苏糖醇的尿素溶液，37度孵育4小时进行还原烷基化反应。孵育结束后通过离心弃去反应溶剂，然后向超滤管中加入含50mm碘乙酰胺的尿素溶液，室温避光孵育30分钟。然后依次用200μl尿素溶液、200μl50 mm碳酸氢铵溶液分别洗涤超滤管三次，每次洗涤后以14000g室温离心15分钟。之后向超滤管中加入100μl含0.1μg/μl胰蛋白酶(promega，货号为v528a)的50mm碳酸氢铵溶液，37度孵育12小时。酶切结束后，以14000g离心15分钟收集酶切后肽段，并用100μl 50mm碳酸氢铵溶液洗涤两次，离心收集洗涤液与前一步收集的肽段混合，用nanodrop 2000c(thermo)测定肽段浓度。使用真空离心浓缩仪(eppendorf)将酶切后肽段冻干后置于-80度储存。质谱检测前，将所得肽段样品用氨水(ph10)中重新溶解，使用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)检测系统进行检测。通过数据依赖性质谱采集技术获取ibaq无标定量质谱数据，谱图原始文件使用maxquant软件进行定量解析，得到样本蛋白质组定量信息结果。对于得到的蛋白质表达矩阵，使用r语言软件程序包limma中的quantile算法进行标准化，对于缺失值使用全局最小值进行插补。
33.3、利用mpo+pkm组合标志物精准筛选预后不良的中性粒细胞高浸润hcc患者
34.提取蛋白质表达矩阵中的髓过氧化物酶(mpo,uniprot编号：p05164)与丙酮酸激酶(pkm，uniprot编号：p14618)的定量数据，首先将mpo表达量输入cox回归模型，根据mpo表达量以及cox回归的结果，将24例(23.8％)hcc患者定义为mpo高表达组(中性粒细胞高浸润组)，剩余77例(76.2％)定义为mpo低表达组(中性粒细胞低浸润组)。定义方法如下：将蛋白丰度取以2为底的对数，mpo丰度值大于等于22的为高表达组，低于22的为低表达组。
35.在24例mpo高表达hcc患者中，根据无标定量质谱检测的pkm表达量以及cox回归模型结果，将16例(66.7％)hcc患者定义为高风险，8例(33.3％)定义为低风险。定义方法如下：将蛋白丰度取以2为底的对数，pkm丰度值大于等于28.5的为高表达组，低于28.5的为低表达组。
36.各患者的mpo和pkm表达以及预后信息见表1。
37.表1、患者的mpo和pkm表达情况以及预后分析
38.39.40.[0041][0042]
kaplan-meier生存分析结果显示，对于所有入选患者，mpo高表达的24例患者存活12个月的生存率为87.5％，存活24个月的生存率为75.0％，存活60个月的生存率为75％。mpo低表达的77例患者存活12个月的生存率为98.7％，存活24个月的生存率为94.8，存活60个月的生存率为89.6％。mpo高表达预后风险比为2.63(95％ ci：0.911-7.57)，p值为6.47e-02。
[0043]
对于mpo高表达的24例患者，pkm高表达的16例患者存活12个月的生存率为
81.3％，存活24个月的生存率为62.5％，存活60个月的生存率为62.5％。pkm低表达的8例患者在随访时间内均存活。pkm高表达预后风险比为1.06e+09(95％ ci：0-inf)，p值为2.86e-02。
[0044]
以上结果表明，联合使用mpo和pkm可将中性粒细胞高浸润hcc患者区分为预后截然不同的两群，mpo和pkm同时高表达的hcc患者预后最差，而mpo高表hcc中的pkm低表者的预后仍然比较好(图2)。
[0045]
2、免疫组织化学染色验证
[0046]
选用上海芯超生物科技有限公司商品化的hcc组织芯片(hlivh180su11，hlivh180su18)对hcc组织进行免疫组织化学染色验证，具体检测步骤如下：(1)脱蜡：依次将切片放入二甲苯ⅰ15min，二甲苯ⅱ15min，二甲苯iii 15min，无水乙醇ⅰ5min，无水乙醇ⅱ5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，蒸馏水清洗。(2)抗原修复：将组织切片置于盛满edta抗原修复缓冲液(ph9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复：中火9min至沸，停火7min，保温再转中低火6min，待自然冷却后将玻片置于pbs中清洗3次，每次5min。(3)封闭：用3％h2o2(中杉金桥，货号为pv-6001)阻断内源过氧化物酶活性，并用正常羊血清(中杉金桥，货号为zli-9056)室温封闭20min。(4)一抗：用即用型兔抗mpo抗体(中杉金桥，货号为za-0197)或鼠抗pkm2抗体(proteintech,货号为60268-1-ig,1:40000使用)于4度孵育过夜。(5)二抗：将玻片置于pbs中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后滴加与一抗相应种属的hrp标记二抗(中杉金桥，货号为pv-6001、6002)覆盖组织，室温孵育50min。(6)dab显色及复染：将玻片置于pbs中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的dab显色液(servicebio，货号为g1211)，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。然后用苏木素(servicebio，货号为g1004)复染3min左右，自来水清洗，苏木素分化液(servicebio，货号为g1039)分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液(servicebio，货号为g1040)返蓝，流水冲洗。(7)封片：用中性树胶(servicebio，货号为g1403)封片。(8)图像采集及结果判读：利用nanozoomer 2.0-rs扫片机(hamamatsu)进行图片采集，然后依据pkm的染色比例积分(少于5％计0分；5％-25％计1分；26％-50％计3分；51％-75％计3分；大于75％计4分)与染色强度积分(阴性计0分；弱阳性计1分；中阳性计2分；强阳性计3分)的乘积计算pkm的染色积分。mpo染色强度通过直接计数hcc间质mpo阳性细胞数获得。
[0047]
各患者的mpo和pkm免疫组织化学染色情况以及预后信息见表2。
[0048]
表2、患者的mpo和pkm免疫组织化学染色情况以及预后分析
[0049]
[0050]
[0051]
[0052]
[0053]
[0054][0055]
对hcc组织mpo及pkm的免疫组织化学染色结果的kaplan-meier生存分析显示，对于所有患者，mpo高表达的52例患者存活12个月的生存率为61.5％，存活24个月的生存率为51.9％，存活60个月的生存率为28.8％。mpo低表达的121例患者存活12个月的生存率为78.5％，存活24个月的生存率为62.0％，存活60个月的生存率为47.9％。mpo高表达预后风险比为1.68(95％ ci：1.12-2.53)，p值为1.13e-02。
[0056]
对于mpo高表达的52例患者，pkm高表达的37例患者存活12个月的生存率为59.4％，存活24个月的生存率为45.9％，存活60个月的生存率为18.9％。pkm低表达的15例患者存活12个月的生存率为66.7％，存活24个月的生存率为66.7％，存活60个月的生存率为53.3％。pkm高表达预后风险比为1.68(95％ ci：1.12-2.53)，p值为1.13e-02。
[0057]
以上免疫组织化学染色结果验证了mpo+pkm组合标志物对于中性粒细胞高浸润hcc的精准预后诊断，进一步证实mpo高表达hcc患者具有显著预后差异。虽然同为mpo高表达患者，但是仅pkm同时高表达的hcc患者预后较差,而当pkm低表达时，患者的预后仍然较好(图3)。
[0058]
以上结果不但进一步证明中性粒细胞浸润对于hcc患者预后的不同意义，也为临床提供一种可转化应用的策略来精准筛选中性粒细胞高浸润的预后不良hcc患者。
[0059]
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[0066]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.检测蛋白质组合表达量的物质在制备肝细胞癌患者预后或精准预后分层试剂盒中的应用，所述蛋白质组合为髓过氧化物酶和/或丙酮酸激酶。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测蛋白质组合表达量的物质包括通过质谱和/或免疫组织化学染色检测髓过氧化物酶和丙酮酸激酶表达量的物质。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述质谱为数据依赖型串联质谱。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：免疫组织化学染色检测所用物质为髓过氧化物酶特异性抗体和/或丙酮酸激酶特异性抗体。5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述髓过氧化物酶的表达量为其在肝癌组织中的表达量。6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述丙酮酸激酶的表达量为其在肝癌组织中的表达量。7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述检测蛋白质组合表达量的物质还包括数据分析模型，所述数据分析模型用于将所述蛋白质组合表达量数据输入cox回归模型，根据模型结果将患者分为高风险组或低风险组。

技术总结
本发明公开了蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用。本发明发现肝细胞癌患者肝癌组织中髓过氧化物酶(MPO)和丙酮酸激酶(PKM)的表达量可以用于肝细胞癌患者的预后或精准预后分层，在MPO高表达患者中，仅PKM同时高表达的HCC患者预后较差,而当PKM低表达时，患者的预后仍然较好。本发明可利用MPO和PKM对肝细胞癌患者精准预后分层。用MPO和PKM对肝细胞癌患者精准预后分层。


技术研发人员：贺福初 孙爱华 古智文 董乾
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2023.01.10
技术公布日：2023/9/23