血红蛋白F的测定方法与流程

血红蛋白f的测定方法
技术领域
1.本发明涉及血液待测体中的血红蛋白f的测定方法。


背景技术：

2.血液待测体中的各种血红蛋白可以在高效液相色谱等分离分级法中测定。作为血红蛋白的一种的血红蛋白f(hbf)的测定值由于成为异常血红蛋白症、地中海贫血症的诊断材料，因此要求高的准确性。作为使用液相色谱的血红蛋白f的测定方法，可以举出下述专利文献1所公开的方法。
3.在先技术文献
4.专利文献
5.专利文献1：日本特开2014-235023号公报。


技术实现要素：

6.发明要解决的问题
7.在将血液待测体供于阳离子交换液相色谱而得到的色谱图中，在从柱的溶出速度比hbf峰快的一侧出现合成峰，该合成峰是血红蛋白a(hba)的糖化物即血红蛋白a1(hba1)中的血红蛋白a1a(hba1a)峰和血红蛋白a1b(hba1b)峰重叠的峰。
8.因此，本公开的实施方式的课题在于，基于将血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图，更准确地测定hbf。
9.解决问题的手段
10.推测：如hba糖化后成为hba1c那样，hbf也受到糖化等修饰而成为修饰型hbf。由于修饰型hbf也是hbf的一种，因此为了更准确地测定hbf，还需要测定修饰型hbf的峰值。在发明人的实验中，观察到该合成峰的大小根据hbf峰的大小而变化。基于该观察结果，推测在该合成峰中还含有hbf的修饰物。合成峰中所含的hba1a、hba1b、修饰型hbf的电荷、大小相互接近，因此难以用阳离子交换色谱分离hba1a、hba1b、修饰型hbf，无法准确地测定修饰型hbf的峰值。其结果，无法测定血液待测体中的hbf总量(换言之，未被修饰的hbf浓度与修饰型hbf浓度的合计浓度)。
11.本公开的一个方式的hbf的测定方法中，基于将已知含有hba1c且hbf相对于总血红蛋白低于规定含有率的第一血液待测体组供于液相色谱而得到的色谱图，预先决定第一相关式，该第一相关式是hba1c峰值与包含hba1a峰和hba1b峰的合成峰值的相关式；将测定对象的血液待测体的hba1c峰值带入第一相关式而得到合成峰值，将该合成峰值从该血液待测体的包含hba1a峰和hba1b峰的合成峰值中减去，计算出修饰hbf峰值；将该修饰hbf峰值与该血液待测体的hbf峰值相加来校正该hbf峰值。
12.发明效果
13.根据本发明的实施方式，基于将血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图，能够更准确地测定hbf。
附图说明
14.图1示意性示出将血液待测体供于高效液相色谱而得到的血红蛋白的色谱图的示例。
15.图2示意性示出通常待测体中hbf峰与合成峰的关系。
16.图3示意性示出高hbf待测体中hbf峰与合成峰的关系。
17.图4是将血液待测体1供于高效液相色谱而得到的色谱图。
18.图5是将血液待测体2供于高效液相色谱而得到的色谱图。
19.图6是将血液待测体3供于高效液相色谱而得到的色谱图。
20.图7是将血液待测体4供于高效液相色谱而得到的色谱图。
21.图8是示出将健康人的血液受待测体组供于高效液相色谱而得到的色谱图中的、hba1c峰值与包含hba1a峰和hba1b峰的合成峰值之间的相关关系的散布图。
22.图9是示出将已知含有hbf的血液待测体组供于高效液相色谱而得到的色谱图中的、hbf峰值与修饰hbf峰值之间的相关关系的散布图。
具体实施方式
23.以下，参照附图，对本公开的实施方式进行说明。各图中共用的符号即使没有特别的说明，也表示相同的部分。此外，本公开中的“峰值”是指通过色谱图确认的各峰的高度或面积，可以使用相对值，也可以使用绝对值。该相对值可以是相对于色谱图的面积整体的比例，也可以是相对于色谱图中所占的与血红蛋白相关的峰面积整体的比例，或者，也可以是相对于特定的峰(例如，hba0峰)的面积的比例。
24.(1)第一实施方式
25.将血液待测体供于阳离子交换液相色谱时，可以得到例如图1中示意性示出的血红蛋白的色谱图。在该色谱图中，按照从柱的溶出速度快的顺序，确认到包含hba1a峰11和hba1b峰12(参照图2和图3)的合成峰10、hbf峰20、不稳定型hba1c峰30、hba1c峰40、hba0峰50和hba2峰60(参照图4～图7)。
26.分别将hbf峰值小于1％的通常的血液待测体的色谱图示意性示出于图2中，并将高hbf血症患者的血液待测体的色谱图示意性示出于图3中。比较两个图中大致相同大小的hba1c峰40可知，图3的色谱图的hbf峰20比图2的色谱图的hbf峰20高。此时，图3的色谱图的合成峰10也比图2的色谱图的合成峰10高。
27.在此，如图2所示，合成峰10中包含hba的糖化物即hba1中的hba1a峰11和hba1b峰12。并且，如图3所示，hbf峰20增大时，合成峰10增大。由于该合成峰10中包含作为糖化物的hba1a峰11和hba1b峰12，如图3所示，因此认为该合成峰10的增大量是由于hbf修饰物即修饰hbf峰13的增大而引起的。另一方面，在图2所示的通常待测体中修饰hbf峰13极少，认为合成峰10的大部分被hba1a峰11和hba1b峰12占据。
28.另一方面，假设不管是在图2所示的通常待测体中，还是在图3所示的高hbf待测体中，hba1a峰11值和hba1b峰12值的合计相对于hba1c峰40的比例大致恒定。在该假设下，在通常待测体中，如果发现hba1c峰40的峰值与合成峰10的峰值(实质上hba1a峰11的峰值和hba1b峰12的峰值的合计值)之间的相关关系，则能够将该相关关系带入高hbf待测体的hba1c峰40中来计算合成峰10中的hba1a峰11和hba1b峰12的合计。hba1a峰11的峰值和
hba1b峰12的峰值的合计值与合成峰10的峰值之差基于修饰hbf峰13值。并且，认为能够通过从图3所示的色谱图中的合成峰10中减去该计算出的合计来计算出修饰hbf峰13。而且，如后述的实施例(参照图8)所示，可知对于多个通常待测体，hba1c峰40与合成峰10之间存在高的相关关系。
29.基于该相关关系，本公开的第一实施方式的hbf的测定方法基于将已知含有hba1c且不含hbf的第一血液待测体组供于液相色谱而得到的色谱图，预先决定hba1c峰值与包含hba1a峰和hba1b峰的合成峰值的相关式即第一相关式，将测定对象的血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图的hba1c峰值带入所述第一相关式而得到合成峰值，将该合成峰值从该血液待测体的包含hba1a峰和hba1b峰的合成峰值中减去，计算出修饰hbf峰值，将修饰hbf峰值与该血液待测体的hbf峰值相加来校正该hbf峰值。该hbf峰值与血液待测体中所含的hbf浓度相关，因此能够基于该hbf峰值求出例如hbf量相对于血液待测体中所含的hbf浓度、总血红蛋白量的比例等。
30.具体而言，针对已知含有hba1c且hbf相对于总血红蛋白低于规定含有率的多个血液待测体，基于hba1c峰值与合成峰值(实质上hba1a峰值与hba1b峰值的合计)之间的相关关系，决定第一相关式。此外，这里所说的“规定含有率”可以是hbf峰值为正常值以下(例如，总血红蛋白的峰值的5％，优选为3％，进一步优选为1％)。关于该“hbf相对于总血红蛋白低于规定含有率的多个血液待测体”，可以作为通过液相色谱对血液待测体中含有的血红蛋白进行分离分析时得到的hbf峰值表示低于上述规定含有率的血液待测体而得到，并且例如，也可以通过使用液体色谱以外的测定原理(例如毛细管电泳)的分析，得到血红蛋白f的含量相对于总血红蛋白低于规定含有率的血液待测体。对于该第一相关式，若将hba1c峰值设为变量x，并将合成峰值设为变量y，则如下述式(1)所示。
31.y＝a1x+b1ꢀ……ꢀ
(1)
32.x：hba1c峰值(变量)
33.y：合成峰值(变量)
34.a1：斜率(常数)
35.b1：截距(常数)
36.然后，根据从测定对象的血液待测体得到的色谱图求出hba1c峰值，将其代入上述式(1)的变量x，估计合成峰值作为计算出的变量y。从色谱图所示的合成峰10得到的(即，使用色谱图中所示的合成峰10测定的)合成峰值中减去该计算出的合成峰值的估计值，计算出合成峰10中所含的修饰hbf峰值。然后，通过将该计算出的修饰hbf峰值与从色谱图得到的hbf峰20的峰值相加，校正该hbf峰值，估计血液待测体中真hbf峰值。修饰hbf峰值如下述式(2)那样表示，若将修饰hbf峰值设为w，并将hbf峰值设为变量z，则真hbf峰值(v)如下述式(3)所示。
37.w＝y-(a1x+b1)
ꢀ……ꢀ
(2)
38.v＝z+w＝z+(y-(a1x+b1))
ꢀ……ꢀ
(3)
39.v：真hbf峰值(变量)
40.w：修饰hbf峰值(变量)
41.x：hba1c峰值(变量)
42.y：合成峰值(变量)
43.z：hbf峰值(变量)
44.a1：斜率(常数)
45.b1：截距(常数)
46.(2)第二实施方式
47.在上述第一实施方式中，以在测定对象的血液待测体中含有hba1c作为前提，但在未含有hba1c的血液待测体、未检测hba1c的血液待测体中，无法将hba1c峰值带入第一相关式。
48.因此，在第二实施方式的hbf的测定方法中，如上述的第一实施方式所示，预先决定第一相关式，进而，根据将已知含有hba1c和hbf的第二血液待测体组供于液相色谱而得到的色谱图，将hba1c峰值带入所述第一相关式而得到合成峰值，从该第二血液待测体组中的含有hba1a峰和hba1b峰的合成峰值中减去所述合成峰值而得到该第二血液待测体组的修饰hbf峰估计值，预先决定该第二血液待测体组的hbf峰值与所述修饰hbf峰估计值的相关式、即第二相关式，将测定对象的血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图的hbf峰值带入所述第二相关式来计算出修饰hbf峰值，将所述修饰hbf的峰值与该血液待测体的hbf峰值相加而校正该hbf峰值。
49.具体而言，首先，如上述第一实施方式所述，决定由上述式(1)表示的第一相关式。
50.接着，对于已知均含有hba1c和hbf的多个血液待测体的色谱图，首先求出hba1c峰值，将其代入上述式(1)的变量x，估计合成峰值作为计算出的变量y。将该计算出的合成峰值从由色谱图所示的合成峰10得到的(即，使用色谱图中所示的合成峰10测定的)合成峰值中减去，由此计算出合成峰10中所含的修饰hbf峰值。另一方面，从相同的色谱图得到hbf峰值，根据该hbf峰值与计算出的修饰hbf峰值的相关关系，决定第二相关式。关于该第二相关式，若将hbf峰值设为变量z，并将修饰hbf峰值设为w，则如下述式(4)所示。
51.w＝a2z+b2ꢀ……ꢀ
(4)
52.w：修饰hbf峰值(变量)
53.z：hbf峰值(变量)
54.a2：斜率(常数)
55.b2：截距(常数)
56.然后，根据从测定对象的血液待测体得到的色谱图求出hbf峰值，将其代入上述式(4)的变量z，计算出变量w作为修饰hbf峰值。然后，通过将该计算出的修饰hbf峰值与从色谱图得到的hbf峰值相加，来校正该hbf峰值，并估计血液待测体中的真hbf峰值。血液待测体中的真hbf峰值(v)如下述式(5)所示。
57.v＝z+w＝z+(a2z+b2)
ꢀ……ꢀ
(5)
58.v：真hbf峰值(变量)
59.w：修饰hbf峰值(变量)
60.z：hbf峰值(变量)
61.a2：斜率(常数)
62.b2：截距(常数)
63.此外，也可以代替上述第二相关式，根据hbf峰值与校正hbf峰值(hbf峰值与修饰hbf峰值的合计)的相关关系，决定第三相关式。若将hbf峰值设为变量z，并将真hbf峰值即
校正hbf峰值设为v，则该第三相关式如下述式(6)所示。
64.v＝a3z+b3ꢀ……ꢀ
(6)
65.v：真hbf峰值(变量)
66.z：hbf峰值(变量)
67.a3：斜率(常数)
68.b3：截距(常数)
69.然后，根据从测定对象的血液待测体得到的色谱图求出hbf峰值，将其代入上述式(5)或上述式(6)的变量z，估计校正hbf峰值、即血液待测体中的真hbf峰值作为计算出的变量v。
70.(3)第三实施方式
71.上述第一实施方式适于含有hba1c的血液待测体。另外，上述第二实施方式适于不含有hba1c的血液待测体。因此，期望根据色谱图中是否含有hba1c，分开使用上述第一实施方式的测定方法和上述第二实施方式的测定方法。
72.即，在第三实施方式的hbf的测定方法中，如上述第一实施方式所示，预先决定第一相关式，另外，如上述第二实施方式所示，预先决定第二相关式。然后，在将测定对象的血液待测体供于液相色谱而得到的对象色谱图具有hba1c峰的情况下，如上述第一实施方式所示，对该血液待测体的hbf峰值进行校正。另一方面，在将测定对象的血液待测体供于液相色谱而得到的对象色谱图不具有hba1c峰的情况下，如上述第二实施方式所示，对该血液待测体的hbf峰值进行校正。
73.实施例
74.(1)液相色谱装置
75.将市售的高效液相色谱的装置与填充有由甲基丙烯酸酯共聚物构成的亲水性聚合物的市售阳离子交换色谱柱连接。在阳离子交换色谱柱的下游流路的规定位置上安装有用于检测流路中流动的血红蛋白的浓度的光学检测器(具体而言为吸光度计)。
76.(2)洗脱液
77.将3种洗脱液调整为下述表1所示的组成的水溶液。
78.[表1]
[0079][0080]
此外，将洗脱液a的ph调整为5.08，将洗脱液b的ph调整为8.0，将洗脱液c的ph调整为6.82。对于这些洗脱液的血红蛋白的溶出力，洗脱液a最小，洗脱液b最大。
[0081]
(3)色谱图
[0082]
在上述(1)的液相色谱装置中流动洗脱液a使色谱柱平衡。然后，将溶血的血液待测体导入到柱。然后，使洗脱液a流动13秒钟，溶出hba1a、hba1b、hbf和hba1c。接着，使以1:9混合洗脱液a和洗脱液c而成的液体流动5秒钟，溶出hba0。接着，使洗脱液c流动5秒钟，溶出
hba2。然后，使洗脱液b流动2秒钟，将残留于柱的血红蛋白全部溶出后，使洗脱液a流动5秒钟。在该溶出的期间，根据在检测波长420nm下用光学检测器得到的吸光度，制作色谱图。
[0083]
将得到的色谱图的示例示于图4～图7。从这些图可知，hbf峰20的面积(hbf峰值)越大，合成峰10的面积(合成峰值)越大。因此，强烈推测包含hba1a峰11和hba1b峰12(参照图3)的合成峰10包括修饰hbf峰13(参照图3)。
[0084]
(4)第一相关式
[0085]
为了决定第一相关式，准备了健康人的血液待测体(hbf峰值低于总血红蛋白峰值1％的血液待测体)66人份。从这些血液待测体分别得到色谱图，分别测定hba1c峰值和合成峰值后，可知存在图8的散布图所示的相关关系。此外，图的横轴表示hba1c峰值，纵轴表示合成峰值(即hba1a峰值与hba1b峰值的合计)。另外，若将hba1c峰值设为变量x，并将合成峰值设为变量y，则图8中虚线直线所示的第一相关式如下述式(7)所示。该第一相关式的相关系数(r)为0.8951。
[0086]
y＝0.1475x+0.8048
ꢀ……ꢀ
(7)
[0087]
x：hba1c峰值(变量)
[0088]
y：合成峰值(变量)
[0089]
此外，推测：这样含有hba1a和hba1b的合成峰10与hba1c峰40表示相关关系是因为，hba1a、hba1b、hba1c均为hba0的糖化物，hba0的糖化所产生的hba1a、hba1b、hba1c的各自的比率大致恒定。
[0090]
然后，根据从测定对象的血液待测体得到的色谱图，测定hba1c峰值，将其作为变量x而代入上述式(7)，计算出hba1a峰值与hba1b峰值的合计值(以下，称为“ab值”)作为变量y。从色谱图测定的合成峰值与该ab值之差基于修饰hbf峰值。因此，从由色谱图测定的合成峰值中减去该ab值，计算出修饰hbf峰值。并且，推测：将该计算出的修饰hbf峰值加入到由色谱图测定的hbf峰值的值是该血液待测体的正确的hbf峰值。
[0091]
(2)第二相关式
[0092]
为了决定第二相关式，准备了健康人的血液待测体(hbf峰值低于总血红蛋白峰值1％的血液待测体)66人份和高hbf症患者的血液待测体48人份。从这些血液待测体分别得到色谱图。从这些色谱图测定hba1c峰值，将其作为变量x代入上述式(7)，计算出ab值作为变量y。进而，从由色谱图测定的合成峰值中减去该ab值，计算出修饰hbf峰值。并且，可知从这些色谱图测定的hbf峰值与计算出的修饰hbf峰值之间存在如图9的散布图所示的相关关系。此外，图的横轴表示hbf峰值，纵轴表示修饰hbf峰值。另外，若将hbf峰值设为变量z，并将修饰hbf峰值设为变量w，则图9中的虚线直线所示的第二相关式如下述式(8)所示。该第二相关式的相关系数(r)为0.9697。
[0093]
w＝0.2323z
ꢀ……ꢀ
(8)
[0094]
然后，从由测定对象的血液待测体得到的色谱图测定hbf峰值，将其作为变量z代入上述式(8)，计算出修饰hbf峰值作为变量w。并且，推测：将该计算出的修饰hbf峰值加入到从色谱图测定的hbf峰值后的值是该血液待测体的正确的hbf峰值。
[0095]
工业应用性
[0096]
本发明能够用于使用液相色谱的血液待测体中的hbf的测定。
[0097]
符号说明
[0098]
10：合成峰；
[0099]
11：hba1a峰；
[0100]
12：hba1b峰；
[0101]
13：修饰hbf峰；
[0102]
20：hbf峰；
[0103]
30：不稳定型hba1c峰；
[0104]
40：hba1c峰；
[0105]
50：hba0峰；
[0106]
60：hba2峰。

技术特征：
1.一种血红蛋白f的测定方法，其中，基于将已知含有血红蛋白a1c且血红蛋白f相对于总血红蛋白低于规定含有率的第一血液待测体组供于液相色谱而得到的色谱图，预先决定第一相关式，所述第一相关式是血红蛋白a1c峰值与包含血红蛋白a1a峰和血红蛋白a1b峰的合成峰值的相关式；将测定对象的血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图的血红蛋白a1c峰值带入所述第一相关式而得到合成峰值，将该合成峰值从该血液待测体的包含血红蛋白a1a峰和血红蛋白a1b峰的合成峰值中减去，计算出修饰血红蛋白f峰值；将所述修饰血红蛋白f峰值与该血液待测体的血红蛋白f峰值相加来校正该血红蛋白f峰值。2.一种血红蛋白f的测定方法，其中，基于将已知含有血红蛋白a1c且血红蛋白f相对于总血红蛋白低于规定含有率的第一血液待测体组供于液相色谱而得到的色谱图，预先决定第一相关式，所述第一相关式是血红蛋白a1c峰值与包含血红蛋白a1a峰和血红蛋白a1b峰的合成峰值的相关式；基于将已知含有血红蛋白a1c和血红蛋白f的第二血液待测体组供于液相色谱而得到的色谱图，将血红蛋白a1c峰值带入所述第一相关式而得到合成峰值，从该第二血液待测体组的包含血红蛋白a1a峰和血红蛋白a1b峰的合成峰值中减去所述合成峰值而得到该第二血液待测体组的修饰血红蛋白f峰估计值，使用该第二血液待测体组的血红蛋白f峰值和所述修饰血红蛋白f峰估计值，预先决定第二相关式，所述第二相关式是血红蛋白f峰值与修饰血红蛋白f峰值的相关式；将测定对象的血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图的血红蛋白f峰值带入所述第二相关式，计算出修饰血红蛋白f峰值；将所述修饰血红蛋白f峰值与该血液待测体的血红蛋白f峰值相加来校正该血红蛋白f峰值。3.一种血红蛋白f的测定方法，其中，基于将已知含有血红蛋白a1c且血红蛋白f相对于总血红蛋白低于规定含有率的第一血液待测体组供于液相色谱而得到的色谱图，预先决定第一相关式，所述第一相关式是血红蛋白a1c峰值与包含血红蛋白a1a峰和血红蛋白a1b峰的合成峰值的相关式；基于将已知含有血红蛋白a1c和血红蛋白f的第二血液待测体组供于液相色谱而得到的色谱图，将血红蛋白a1c峰值带入所述第一相关式而得到合成峰值，从该第二血液待测体组的包含血红蛋白a1a峰和血红蛋白a1b峰的合成峰值中减去所述合成峰值而得到该第二血液待测体组的修饰血红蛋白f峰估计值，使用该第二血液待测体组的血红蛋白f峰值和所述修饰血红蛋白f峰估计值，预先决定第二相关式，所述第二相关式是血红蛋白f峰值与修饰血红蛋白f峰值的相关式；在将测定对象的血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图具有血红蛋白a1c峰的情况下，将该血液待测体的血红蛋白a1c峰值带入所述第一相关式而得到合成峰值，将该合成峰值从该血液待测体的包含血红蛋白a1a峰和血红蛋白a1b峰的合成峰值中减去，计算出修饰血红蛋白f峰值；将所述修饰血红蛋白f峰值与该血液待测体的血红蛋白f峰值相加来校正该血红蛋白f
峰值；在将测定对象的血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图不具有血红蛋白a1c峰的情况下，将该血液待测体的血红蛋白f峰值带入所述第二相关式，计算出修饰血红蛋白f峰值；将所述修饰血红蛋白f峰值与该血液待测体的血红蛋白f峰值相加来校正该血红蛋白f峰值。4.根据权利要求2或3所述的血红蛋白f的测定方法，其中，代替所述第二相关式，预先决定第三相关式，所述第三相关式是该第二血液待测体组的血红蛋白f峰值与该血红蛋白f峰值和所述修饰血红蛋白f峰估计值的合计值之间的相关式；将测定对象的血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图的血红蛋白f峰值带入所述第三相关式，对该血红蛋白f峰值进行校正。5.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其中，所述液相色谱为阳离子交换色谱。

技术总结
本发明涉及血红蛋白F的测定方法。本发明的课题在于，基于将血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图，更准确地测定HbF。本发明的解决手段在于，基于将已知含有HbA1c且HbF相对于总血红蛋白低于规定含有率的第一血液待测体组供于液相色谱而得到的色谱图，预先决定HbA1c峰值与包含HbA1a峰和HbA1b峰的合成峰值的相关式即第一相关式；将测定对象的血液待测体供于液相色谱而得到的色谱图的HbA1c峰值带入第一相关式而得到合成峰值，将该合成峰值从该血液待测体的包含HbA1a峰和HbA1b峰的合成峰值中减去，计算出修饰HbF峰值；将该修饰HbF峰值与该血液待测体的HbF峰值相加来校正该HbF峰值。值。值。


技术研发人员：石川一辉
受保护的技术使用者：爱科来株式会社
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/9/23