施氏假单胞菌XN05-1、其应用及所得植物抗盐菌剂

施氏假单胞菌xn05-1、其应用及所得植物抗盐菌剂
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及到一种施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1、其应用及所得植物抗盐菌剂。


背景技术：

[0002][0003]
高盐环境会对植物造成渗透胁迫、离子胁迫以及氧化胁迫，从而抑制植物的生长发育。土壤盐渍化严重危害作物生长，现有微生物菌剂虽在一定程度上提高植物耐盐性，但这些菌剂的环境适应性不强、耐盐度不高。越来越多的研究表明，根际微生物能够增加植物的抗盐能力，并且会与其宿主共同进化以抵抗外界胁迫，而耐盐植物之所以能够耐受较高的盐胁迫，除了自身的生理机制之外，根际微生物也发挥着重要的作用。因此，相比于普通土壤微生物，野生耐盐植物的根际微生物能够耐受更高的盐度，环境适应性更强，亟待开发利用。


技术实现要素：

[0004]
本发明提供了一种施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1、其应用及所得植物抗盐菌剂，通过对获得的施氏假单胞菌进行耐盐和促生能力测定，发现其具有溶解有机磷的活性、具有较强的产生长素能力、能够产生胞外多糖(0.26mg/l)，同时具有良好的耐盐能力，可有效解决现有菌剂环境适应性不强、耐盐度不高的问题。
[0005]
为了达到上述目的，本发明提供了一种施氏假单胞菌pseudomonasstutzeri xn05-1，其特征在于，保藏编号为cgmcc no.26683，于2023年02月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址中国北京。
[0006]
作为优选，所述施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1具有如seq id no.1所示核苷酸序列。
[0007]
本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1的pcr扩增方法，包括以下步骤：
[0008]
1)提取分离自土壤悬浊液中细菌菌株的基因组dna；
[0009]
2)以细菌菌株的基因组dna为模板，使用上游引物和下游引物，采用rtaq酶进行pcr扩增；
[0010]
其中：pcr反应体系为：2
×
taq master mix 12.5μl、正反向引物(10μm)各1μl、dna模板1μl、ddh2o 9.5μl，总体系25μl。
[0011]
作为优选，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，循环30次；最后72℃延伸10min。
[0012]
作为优选，所述引物对为：
[0013]
正向引物：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；
[0014]
反向引物：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’。
[0015]
本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1在提高野大豆耐盐能力中的应用。
[0016]
作为优选，所述施氏假单胞菌xn05-1在每盆接种浓度为107cfu/g时，相比未接种的野大豆，根长提高114.01％，根重提高24.38％。
[0017]
本发明还提供了一种植物抗盐菌剂，以上述技术方案所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1为主要有效成分。
[0018]
作为优选，所述植物为野大豆。
[0019]
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
[0020]
本发明提供了一种施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1，通过对获得的施氏假单胞菌进行耐盐和促生能力测定，发现其具有溶解有机磷的活性、具有较强的产生长素能力(170.31μg/ml)、能够产生胞外多糖(0.26mg/l)，并且首次提出了可将该施氏假单胞菌用于提高野大豆耐盐能力中，具有良好的耐盐能力，在6％的nacl浓度下仍然生长，其中最适nacl浓度为3.0％，并且在每盆接种浓度为107cfu/g时，相比未接种的野大豆根长可提高114.01％，根重可提高24.38％。该施氏假单胞菌的获得能够丰富现有微生物制剂的种类，有效解决了现有菌剂环境适应性不强、耐盐度不高的问题。
附图说明
[0021]
图1为本发明实施例提供的菌株xn05-1在na培养基上的菌落形态；
[0022]
图2为本发明实施例提供的菌株xn05-1的盐度耐受范围；
[0023]
图3为本发明实施例提供的盐胁迫环境下菌株xn05-1在野大豆根系的定殖情况；左边为对照，右边为接种菌株xn05-1；
[0024]
图4为本发明实施例提供的接种菌株xn05-1后野大豆在盐胁迫下的生长情况；***表示p《0.001；**表示p《0.01。
具体实施方式
[0025]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]
实施例1土壤样品采集
[0027]
将盐胁迫后的野大豆植株连根拔起，抖落根部松散附着的土壤，将紧密附着的根际土样品放入无菌自封袋，低温运回实验室进行菌株分离培养。
[0028]
实施例2施氏假单胞菌的筛选
[0029]
2.1试剂：
[0030]
na培养基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂粉20.0。
[0031]
nb培养基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0。
[0032]
盐度测试培养基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，不同浓度氯化钠0-60g。
[0033]
pko无机磷培养基(g/l)：葡萄糖10.0，(nh4)2so
4 0.5，mgso4·
7h2o0.1，nacl 0.2，kcl 0.2，feso4·
7h2o 0.003，mnso4·
4h2o 0.03，ca3(po4)25.0，酵母粉0.5，琼脂20.0。
[0034]
有机磷细菌培养基：购买自青岛海博生物技术有限公司。
[0035]
改良cas琼脂培养基：购自北京酷来搏科技有限公司。
[0036]
其它生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。
[0037]
2.2细菌的分离培养：
[0038]
在无菌环境中将根际土样品与0.85％生理盐水充分混合(1:9，w/v)。静置后吸取100μl上清液加入到900μl生理盐水中，梯度稀释至10-4
。分别吸取10-2-10-4
浓度的稀释液100μl涂布于营养琼脂(na)培养基上。在28℃下恒温培养3d，根据菌落颜色、形态、表面光滑度等挑取不同的单菌落，经2-3次划线纯化，接种于nb液体培养基，振荡培养24h至对数生长期，吸取菌液与50％甘油1:1混匀，于-80℃冰箱冷冻保存。
[0039]
发现一种优势菌株(菌落数占比～30％)，随机挑取一个单菌落，编号为xn05-1。在na培养基上培养48h后，菌落特征为浅黄色、湿润、边缘光滑整齐，菌落直径达到2mm，如图1所示。
[0040]
2.3施氏假单胞菌的筛选及分子鉴定：
[0041]
采用菌落pcr技术，使用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)对细菌16s rrna基因序列进行扩增。具体采用的扩增体系为：2
×
taq master mix 12.5μl、正反向引物(10μm)各1μl、dna模板1μl、ddh2o 9.5μl，总体系25μl；扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，循环30次；最后72℃延伸10min。
[0042]
将pcr产物送往青岛睿博生物技术有限公司进行测序，所得细菌序列经校对后上传至ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)进行比对。经比对，如图1所示，菌株xn05-1的16s rrna基因序列与施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri相似度最高，为99.67％，因此，初步认定菌株xn05-1为施氏假单胞菌，具有seq id no.1所示核苷酸序列。该施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1的保藏编号为cgmcc no.26683，于2023年02月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0043]
实施例3施氏假单胞菌xn05-1的耐盐能力和促生指标
[0044]
3.1施氏假单胞菌xn05-1的耐盐能力
[0045]
配置不同nacl浓度(0-6％)的培养基，高压灭菌后分装于96孔培养板中，按照1％的接种量接种xn05-1菌液，24h后用酶标仪测定培养液的od值。
[0046]
3.2施氏假单胞菌xn05-1的促生指标
[0047]
利用不同的指示培养基测定了施氏假单胞菌xn05-1的溶磷活性、胞外多糖产生能力以及铁载体产生能力。
[0048]
3.2.1溶磷活性测定：将10μl od
600
＝0.6的菌液接种到pko无机磷和有机磷细菌培养基上，28℃培养3天，观察菌落周围是否形成透明圈，用增溶指数(si)评估菌株的增溶作用，计算公式如下：溶解指数(si)＝(晕+菌落直径)/菌落直径。
[0049]
3.2.2胞外多糖产生能力测定：将菌株xn05-1接种至nb培养基，过夜培养后，静置48h(od
600
＝1.5)。随后取200μl菌液与200μl苯酚(5％)、1ml浓硫酸混匀，在波长485nm下检测od值。同时，取200μl不同浓度的葡萄糖做标准曲线，将菌液的od
485
值带入标准曲线，计算胞外多糖产生量。
[0050]
3.2.3铁载体产生能力测定：将xn05-1菌株接种到cas琼脂培养基，30℃培养7d，观
察细菌菌落周围的颜色变化，颜色从蓝色变为橙色或者深黄色，表明菌株可以产生铁载体。
[0051]
结果发现，菌株xn05-1在6％的nacl浓度下仍然能够生长，其中最适nacl浓度为3.0％(图2)；具有溶解有机磷的活性、具有较强的产生长素能力
[0052]
(170.31μg/ml)、能够产生胞外多糖(0.26mg/l)；不具有溶解无机磷和产铁载体能力。
[0053]
实施例4施氏假单胞菌xn05-1在野大豆根际的定殖能力
[0054]
将野大豆种子用3％次氯酸钠溶液消毒处理，随后放在湿润的滤纸上催芽三天，随后转移到96孔培养板进行短期培养，待株高长至3cm左右转移至试管中，每个试管均装满1/2霍格兰培养液，并加入终浓度为200mm的nacl。将标记绿色荧光蛋白的施氏假单胞菌xn05-1接种至nb培养基，28℃、180r/min下摇床培养24h。取1ml od
600
＝0.5的菌液，加入培养试管中，对照组加入1ml无菌水。继续培养7天后，利用激光共聚焦显微镜观察菌株xn05-1在野大豆根系的定殖情况。
[0055]
结果发现，如图3所示，添加菌株xn05-1后，野大豆根系表面呈现大量绿色光斑，而对照组没有出现绿色光点，说明菌株xn05-1能够成功定殖在野大豆根系。
[0056]
实施例5施氏假单胞菌xn05-1提高野大豆耐盐性
[0057]
将新鲜的施氏假单胞菌xn05-1接种至nb培养基，28℃、180r/min下摇床培养24h。4℃、6000r/min离心5min，用无菌水重悬至od
600
＝0.5。将野大豆种子用3％次氯酸钠溶液消毒处理，随后放在湿润的滤纸上催芽三天。每个小盆装200g大田土，每盆放入4棵萌发的野大豆种子，置于人工气候室培养。移栽后3天用200mm nacl进行胁迫处理，同时浇灌20ml xn05-1菌液，对照组浇灌等量无菌水，每组设置6个重复。培养15天后测量野大豆的株高、根长、株重和根重。
[0058]
结果发现，如图4所示，盐胁迫下菌株xn05-1虽对野大豆的株高和株重影响不大，但能显著提高其根长(增加114.01％)和根重(增加24.38％)，说明菌株xn05-1通过促进野大豆的根系延伸帮助其提高耐盐性。

技术特征：
1.施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1，其特征在于，保藏编号为cgmcc no.26683，于2023年02月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。2.根据权利要求1所述的施氏假单胞菌xn05-1，其特征在于，所述施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1具有seq id no.1所示核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1的pcr扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取分离自土壤悬浊液中细菌菌株的基因组dna；2)以细菌菌株的基因组dna为模板，使用上游引物和下游引物，采用rtaq酶进行pcr扩增；其中：pcr反应体系为：2
×
taq master mix 12.5μl、正反向引物(10μm)各1μl、dna模板1μl、ddh2o 9.5μl，总体系25μl。4.根据权利要求3所述的pcr扩增方法，其特征在于，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，循环30次；最后72℃延伸10min。5.根据权利要求3所述的pcr扩增方法，其特征在于，所述引物对为：正向引物：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；反向引物：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’。6.如权利要求1或2所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1在提高野大豆耐盐能力中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述施氏假单胞菌xn05-1在每盆接种浓度为107cfu/g时，相比未接种的野大豆，根长提高114.01％，根重提高24.38％。8.植物抗盐菌剂，其特征在于，以权利要求1或2所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri xn05-1为主要有效成分。9.根据权利要求8所述的植物抗盐菌剂，其特征在于，所述植物为野大豆。

技术总结
本发明提供了一种施氏假单胞菌XN05-1、其应用及所得植物抗盐菌剂，属于微生物技术领域。本发明提供的施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri XN05-1，保藏编号为CGMCC No.26683，于2023年02月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。本发明通过对获得的施氏假单胞菌进行耐盐和促生能力测定，发现其具有溶解有机磷的活性、具有较强的产生长素能力、能够产生胞外多糖，同时具有良好的耐盐能力，可有效解决现有菌剂环境适应性不强、耐盐度不高的问题。题。题。


技术研发人员：郑艳芬 张成省 李义强 李喆 王友强 周亚男 隋晓娜 赵栋霖 杨晏哲
受保护的技术使用者：中国农业科学院烟草研究所（中国烟草总公司青州烟草研究所）
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/9/23