单形拟杆菌荚膜多糖提取物及其在促进乳酸菌增殖中的应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及单形拟杆菌荚膜多糖提取物及其在促进乳酸菌增殖中的应用。


背景技术：

2.益生菌被国际益生菌和益生元科学协会定义为“当以足够量施用时会给宿主带来健康益处的活微生物”。其与其他常用的膳食补充剂相比，益生菌提供了独特的市场质量要求，因为它们需要是活的且本身具有高度多样化的微生物。随着益生菌市场的发展，益生菌、益生元、合生元和后生元的概念不断被提出。后生元是益生菌经加工处理后的益生菌代谢物成分统称，包括菌体与代谢产物。研究证实，经过筛选的后生元，增强免疫能力优于原活菌，即使经由高温作用或肠胃消化液处理，仍保有高度生理活性。因此，新型后生元的开发具有重要市场价值。
3.荚膜多糖(capsular polysaccharide，cps)是细菌表面普遍存在的一种多糖聚合物，其通过共价结合的方式固定于细胞壁外层肽聚糖，是细菌发挥作用生理功能重要成分。
4.乳酸菌(lactic acid bacteria，lab)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称，是目前市场应用最为广泛的益生菌之一。其在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，至少包含18个属，共200多种。除极少数外，其绝大部分都是人体内必不可少的、且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。典型乳酸菌种的包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。相关研究表明菊粉等天然多糖可以体内外提高益生菌的丰度。但有别于菊粉等物质，菌株荚膜多糖等新型后生元对于益生菌有何作用尚未有研究报道，因此，其对于乳酸菌能否起到体内外增殖作用等效果对于益生菌复方开发具有重要意义。
5.单形拟杆菌是拟杆菌属中的一种革兰氏阴性棒状细菌，来源于人类和猪粪便菌群，也可以从人类临床样本中分离。对于该菌及其提取物相关研究尚鲜有报道。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了单形拟杆菌提取物及其在促进乳酸菌增殖中的应用。在本发明中，首次发现了单形拟杆菌提取物，尤其是单形拟杆菌荚膜多糖在体内和体外环境中都能有效的促进乳酸菌的生长和增殖，从而实现对于乳酸菌的体外大量扩繁或规模化生产的目的，提高乳酸菌的产量和产出效率。且基于其体内增繁效果，还能提高受试者的胃肠道乳酸菌数量，进而实现促进消化吸收等保健效果，维持人体健康。
7.本发明的第一个方面，提供一种单形拟杆菌荚膜多糖，所述单形拟杆菌荚膜多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，所述阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩尔比为0.51：0.25：300.19：1.95：1.72。
8.在本发明中，发明人通过数据库比对，并未发现现有技术中存在与本发明中的单
形拟杆菌荚膜多糖相同的多糖。且在现有的拟杆菌属(包括脆弱拟杆菌)中得到的多糖中的单糖组成的种类和比例均与本发明中的单形拟杆菌荚膜多糖存在差异，因此，其可能是一种新的结构的细菌胞外杂多糖。
9.在本发明的一些实施方式中，所述单形拟杆菌荚膜多糖的相对分子质量为1.819
×
104da。
10.在本发明的一些实施方式中，所述单形拟杆菌荚膜多糖的总糖含量为99.83％。
11.在本发明的一些实施方式中，所述单形拟杆菌荚膜多糖在3367cm-1
有羟基的强烈吸收。
12.在本发明的一些实施方式中，所述单形拟杆菌荚膜多糖来源于单形拟杆菌atcc 8492。
13.本发明的第二个方面，提供一种单形拟杆菌荚膜多糖的提取方法，包括如下步骤：
14.(1)对单形拟杆菌反复冻融后进行超声破碎，离心收集上清，减压浓缩后进行醇沉；
15.(2)取醇沉沉淀物进行脱蛋白处理，超滤洗涤后使用离子交换纤维素进行层析，nacl洗脱，收集0mol/l峰段的洗脱液，即得单形拟杆菌荚膜多糖。
16.在本发明的一些实施方式中，所述单形拟杆菌荚膜多糖为本发明第一个方面所述的单形拟杆菌荚膜多糖。
17.在本发明的一些实施方式中，所述脱蛋白处理包括使用木瓜蛋白酶和sevag试剂进行脱蛋白。
18.在本发明的一些实施方式中，所述脱蛋白处理为：先使用木瓜蛋白酶进行酶解后，再使用sevag试剂进一步脱除蛋白。
19.在本发明的一些实施方式中，所述超滤使用3kd超滤管。
20.在本发明的一些实施方式中，所述离子交换纤维素为deae cellulose-52离子交换纤维素。
21.在本发明的一些实施方式中，所述层析中，使用的洗脱液为nacl溶液。
22.在本发明的一些实施方式中，所述nacl溶液的洗脱浓度依次为0、0.05、0.1、0.3、0.5mol/l。
23.在本发明的一些实施方式中，所述提取方法还包括使用葡聚糖凝胶层析柱进一步纯化。
24.在本发明的一些实施方式中，所述葡聚糖凝胶层析的洗脱液为0.1mol/l nacl溶液。
25.本发明的第三个方面，提供单形拟杆菌提取物作为唯一活性物质在促进乳酸菌生长或增殖中的应用。
26.在本发明的一些实施方式中，所述单形拟杆菌提取物为单形拟杆菌荚膜多糖。
27.在本发明的一些实施方式中，所述乳酸菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。
28.在本发明中，发明人通过体外试验证实了单形拟杆菌荚膜多糖对于乳酸菌具有促增殖作用，其中，对嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌的体外环境的生长具有显著的促进或刺激作用，而对于罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的增殖促进作用则相对较小。
29.本发明的第四个方面，提供单形拟杆菌提取物在制备改善体内环境中乳酸菌丰度的产品中的应用。
30.在本发明的一些实施方式中，所述单形拟杆菌提取物为单形拟杆菌荚膜多糖。
31.在本发明的一些实施方式中，所述乳酸菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。
32.在本发明的一些实施方式中，所述产品包括饲料、饲料添加剂、食品、食品添加剂和药品。
33.在本发明的一些实施方式中，所述产品中还包括饲料、食品或药学中可接受的辅料。
34.在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括但不限于：溶剂、乳化剂、软化剂、抗氧化剂、防腐剂、螯合剂、ph调节剂、增稠剂、渗透促进剂、遮光剂。
35.在本发明的一些实施方式中，所述产品的适用对象为动物，所述动物选自人、猫、牛、羊、猪、狗、鸡、鸭、鹅、兔、鼠；优选所述动物为人。
36.在本发明的一些实施方式中，所述产品中的单形拟杆菌提取物含量为0.1～100wt％。
37.在本发明的一些实施方式中，所述单形拟杆菌提取物含量是以每l菌液(培养基)中的菌体质量进行衡量的，在本发明的一些实施方式中，所述单形拟杆菌提取物含量为0.1～10mg菌体/l培养基。
38.在本发明的一些实施方式中，所述产品中的单形拟杆菌提取物含量为5mg菌体/l培养基。
39.在本发明的一些实施方式中，所述体内环境为胃肠道环境。
40.在本发明中，发明人通过小鼠体内试验证实了单形拟杆菌荚膜多糖对于乳酸菌具有体内促增殖作用，其中，尤其是对于嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌具有非常显著的促生长作用，而对罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌有一定的促进作用，但效果并不十分显著。
41.本发明的有益效果是：
42.本发明首次发现了一种单形拟杆菌荚膜多糖，并通过体内和体外试验验证了该单形拟杆菌荚膜多糖具有促进乳酸菌增殖的效果，且安全有效，无毒副作用，从而可以进一步实现对于乳酸菌的体外大量扩繁或规模化生产的目的，提高乳酸菌的产量和产出效率，或基于其体内增繁效果，用于提高受试者的胃肠道乳酸菌数量，进而实现促进消化吸收等保健效果，达到维持人体健康的效果。
附图说明
43.图1为单形拟杆菌粗荚膜多糖不同组分经deae cellulose-52离子交换纤维素层析，使用nacl溶液作为洗脱液时的梯度洗脱曲线。
44.图2为经deae cellulose-52离子交换纤维素层析后进一步使用sephacryl s-300hr葡聚糖凝胶纯化后的洗脱曲线。
45.图3为单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b的红外图谱。
46.图4为单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b的紫外图谱。
47.图5为混合单糖标准品pmp衍生化的液相色谱图。
48.图6为单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b的单糖衍生化液相色谱图。
49.图7为单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b体外对乳酸菌株增殖的影响，其中，a～e分别对应嗜酸乳杆菌cip 76.13、干酪乳杆菌atcc 393、植物乳杆菌dsm 10667、鼠李糖乳杆菌jsm1136和罗伊氏乳杆菌jcm 1112。
50.图8为单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b对小鼠体重的影响。
51.图9为单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b对小鼠肠道乳酸菌株生长的影响。
具体实施方式
52.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
53.在下述实施例中，所用单形拟杆菌选择商品化标准菌株单形拟杆菌atcc 8492。所用嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)为嗜酸乳杆菌cip 76.13。所用干酪乳杆菌(lacticaseibacillus casei)为干酪乳杆菌atcc 393。所用植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)为植物乳杆菌dsm 10667。所用罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)为罗伊氏乳杆菌jcm 1112。所用鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)为鼠李糖乳杆菌jsm1136。
54.乳酸菌株的培养及鉴定
55.在超净工作台中，用浸有75％酒精的脱脂棉擦拭分别载有单形拟杆菌atcc 8492、嗜酸乳杆菌cip 76.13、干酪乳杆菌atcc 393、植物乳杆菌dsm 10667、罗伊氏乳杆菌jcm 1112和鼠李糖乳杆菌jsm1136菌株的冻存管，晾干酒精后，解开缠绕的封口膜，用酒精灯围绕管口处加热后，打开冻存管，并向菌株冻干粉中加入500μl的无菌水，待溶解混匀后，用无菌接种环挑取菌液划在哥伦比亚血平板上，在37℃，厌氧条件培养48h。48h后从划线平板中挑取单个菌落到新的血平板中进行培养，37℃，厌氧条件培养48h。
56.细菌基因组dna提取：使用细菌基因组dna提取试剂盒(天根生化科技)对培养得到的各菌株的基因组dna进行提取，具体操作参照说明书。在获得dna后，对其dna浓度以及纯度进行检测，od260/od280比值在1.7-1.9范围视为为合格。
57.pcr扩增：以合格的dna为模板进行pcr扩增。
58.pcr扩增体系如表1所示。
59.表1 pcr扩增体系
60.组分含量taq pcr master mix12.5μldna模板0.5μl上游引物(f)1μl下游引物(r)1μl无菌水10μl总体积25μl
61.其中，上游引物为27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’(seq id no：1)；
62.下游引物为1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’(seq id no：2)。
63.pcr扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环30次；72℃延长10min。扩增产物委托生工生物工程(上海)股份限公司进行16s rrna测序，以确定菌种无误。
64.单形拟杆菌荚膜多糖的提取和纯化
65.将确认后的单形拟杆菌atcc 8492于bhi液体培养基中，37℃培养24h，活化两代后，以2％(v/v)的接种量接种于bhi液体培养基中进行扩大培养，培养温度为37℃，培养时间为48h。
66.培养48h后，4℃、4500rpm离心发酵液30min以获得菌体(沉淀)，用pbs清洗2次。对菌体沉淀反复冻融10次。然后加10倍体积的ddh2o进行超声破碎处理20min，间隔30s。4500rpm离心30min，收集上清液。沉淀部分继续重复上述步骤超声、离心步骤。汇集所有上清，减压浓缩至原体积的1/5，边搅拌边加入预冷的95％乙醇使溶液中的乙醇终浓度为80％，4℃过夜。次日去取出4000rpm离心30min后，即得醇沉后的单形拟杆菌荚膜多糖粗提物。
67.对单形拟杆菌荚膜多糖粗提物进行脱蛋白处理。采用木瓜蛋白酶结合sevag法对单形拟杆菌荚膜多糖粗提物进行脱蛋白，具体操作为：将得到的单形拟杆菌荚膜多糖粗提物用适量超纯水溶解后加入木瓜蛋白酶使溶液中的木瓜蛋白酶终浓度为1mg/ml，60℃搅拌条件下水浴1h，100℃煮沸15min以充分灭活其中的木瓜蛋白酶。4000rpm离心30min，取上清液，加入其1/4体积的sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4:1)，涡旋10min后4000rpm离心20min。取水层重复操作，直至水层与三氯甲烷层中间的白色乳状物被除尽。收集水层，减压浓缩除去残留的有机试剂后，冻干，得到脱去蛋白的固体形态的单形拟杆菌荚膜多糖。
68.超纯水复融固体形态的单形拟杆菌荚膜多糖，用3kd超滤管进行超滤洗涤，4000rpm离心，重复三次。留少量液体重悬后冷冻干燥得到单形拟杆菌粗荚膜多糖粗提物。
69.使用deae cellulose-52离子交换纤维素层析柱对单形拟杆菌粗荚膜多糖粗提物进行纯化。称取20g的deae cellulose 52离子交换纤维素于玻璃烧杯中，加入足量的超纯水溶胀至体积不变后，先用0.5mol/l的naoh溶液处理1h，随后用超纯水反复清洗至中性，再用0.5mol/l的hcl溶液处理1h，以超纯水洗至中性。层析柱规格为2.6
×
30cm，清洗干净后垂直固定于铁架台上，加入1/3柱体积超纯水，打开出液口。随后沿着玻璃棒缓缓将填倒入层析柱中，让其自然沉降，并用软棒轻轻敲打柱体以排除气泡，随后反复添加填料(deae cellulose-52离子交换纤维素)至其离层析柱顶端5cm处时停止装柱，连接恒流泵，用超纯水以1.0ml/min的流速平衡。称取50mg单形拟杆菌粗荚膜多糖粗提物充分溶于10ml超纯水中，4500rpm离心15min后，取上清并用0.45μm滤膜过滤。上样，打开恒流泵开始洗脱。洗脱液依次为0、0.05、0.1、0.3、0.5mol/l的nacl溶液，流速为1.0ml/min，每管收集8ml。收集的样液采用硫酸苯酚法在490nm检测吸光度，并绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线，收集0mol/l nacl溶液峰段下的组分。然后将收集后的洗脱液分别用3kd超滤管浓缩洗涤后，进行冷冻干燥后得到bu-cps-1，置于干燥器中保存备用。
70.进一步使用sephacryl s-300hr葡聚糖凝胶纯化。sephacryl s-300hr为预处理填料，保存于20％乙醇中，使用前先用超纯水洗净。层析柱规格为1.6
×
90cm，清洗干净后垂直固定于铁架台上，加入1/3柱体积超纯水，打开出液口。随后沿着玻璃棒缓缓将填倒入层析柱中，让其自然沉降，并用软棒轻轻敲打柱体以排除气泡，随后反复添加填料至合适高度，
待填料液面保持平静后，连接恒流泵，用5倍柱体积0.1mol/l nacl溶液冲洗葡聚糖凝胶柱，以清除填料中残留的乙醇，并进一步压实凝胶柱填料。然后分别称取50mg经deae 52纯化得到的各个组分，充分溶于10ml超纯水中，4500rpm离心15min后，取上清并用0.45μm滤膜过滤。以滤液为样品上样，打开恒流泵开始洗脱。洗脱液为0.1mol/l nacl溶液，流速为0.5ml/min，每管收集4ml。收集的样液采用硫酸苯酚法隔管检测，并绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线，收集洗脱峰下的洗脱液。对洗脱液进行浓缩、透析、冻干后得到纯化后的单形拟杆菌荚膜多糖(bu-cps-1b)。其中，在本实施例中选择bu-cps-1b组分作为单形拟杆菌荚膜多糖进行下述检测，bu-cps-1b组分的峰段分布为16-32，产量84％。bu-cps-1b各组分对应的梯度洗脱曲线如图1和2所示。
71.取干燥后的bu-cps-1b适量并压成片状，使用atr-ftir进行红外光谱测试，在波数4000-400cm-1
范围内进行红外扫描。
72.结果如图3所示，红外判定bu-cps-1b在3367cm-1
有羟基的强烈吸收。
73.使用紫外光谱分析纯化后的多糖样品中是否含有核酸和蛋白质。具体操作为：用超纯水将bu-cps-1b配制成1mg/ml溶液，在190-400nm波长区域内进行紫外全波长扫描，观察260nm和280nm处是否有吸收峰以判断纯化后的多糖样品中是否含有核酸和蛋白质。
74.结果如图4所示，紫外检测发现260/280出无蛋白和核酸吸收峰，说明纯化后的多糖样品中不含核酸和蛋白质。
75.以葡萄糖为标准，用苯酚硫酸法对bu-cps-1b的总糖含量进行测定。其中，样品中总糖含量可根据标准曲线计算：
[0076][0077]
其中，c为根据标准曲线计算得到的浓度，m为实际称量质量，v为提取液总体积。
[0078]
具体操作为：称取2-5mg样品，加1ml无菌水溶解后，超声提取10min，12000rpm离心10min。吸取0.4ml上清，用ddh2o稀释后与苯酚浓硫酸混合，待反应结束后于490nm处测定吸光值，基于得到的葡萄糖标准曲线计算总糖含量。
[0079]
通过硫酸苯酚法得到的葡萄糖标曲为y＝2.81x+0.0551，r2＝0.9986。带入计算后发现bu-cps-1b总糖含量为99.83％，其糖纯度含量高。
[0080]
使用凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,gpc)检测bu-cps-1b的多糖相对分子量，同时检验其纯度。具体操作为：首先相继进样不同分子量的葡聚糖标准品，记录其保留时间(tr)，并以各葡聚糖标准品的tr为横坐标，相应的分子量(mw)的对数为纵坐标绘制标准曲线，得出lg(mw)与tr的回归方程，具体为：lg(mw)＝-1.0977x tr+12.271，相关系数r2＝0.994。色谱条件为：高效液相色谱仪为岛津lc-20at，色谱柱为polysep-gfc-p 4000色谱柱(phenomenex，300
×
7.8mm)，检测器为蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector,elsd)，检测器的设定温度为60℃，增益值为10，柱温为35℃，以超纯水为流动相，流速为1.0ml/min，进样量为20μl进行检测。
[0081]
采用hpgpc法测定bu-cps-1b的相对分子质量，根据线性回归方程，将其保留时间tr＝7.59min带入计算得到bu-cps-1b的相对分子质量为1.819
×
104da。
[0082]
对bu-cps-1b进行单糖组成鉴定。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)柱前衍生化-高效液相色谱法测定bu-cps-1b的单糖组成。具体步骤为：称取5mg bu-cps-1b于具塞反
应管中，加入2ml三氟乙酸(tfa)，密封后于油浴锅内135℃水解3h，水解完全后进行冷却。加入5ml甲醇减压浓缩至旋干，重复处理3次以除去残余的tfa。再加入800μl去离子水溶解。取100μl完全水解的多糖溶液，加入0.5mol/l的pmp甲醇溶液和0.3mol/l的naoh溶液各100μl，混匀后置于70℃水浴反应30min，冷却后加入105μl 0.3mol/l hcl溶液。加入200μl的超纯水稀释。随后加入600μl氯仿溶液，涡旋混匀后离心(10000rpm，15min)，弃下层氯仿，重复3次以除去残留的pmp。收集水层经0.45μm滤膜过滤后使用hplc检测。色谱条件为：色谱系统采用的是thermo ics5000离子色谱系统(ics5000，thermo fisher scientific，usa)，利用电化学检测器对单糖组分进行分析检测。色谱柱为dionex
tm
carbopac
tm
pa20(150*3.0mm，10μm)液相色谱柱。进样量为5μl。流动相a(h2o)，流动相b(0.1m naoh)，流动相c(0.1m naoh，0.2m naac)，流速0.5ml/min；柱温为30℃；洗脱梯度:0min，a相/b相/c相(95：5：0，v/v)；26min，a相/b相/c相(85：5：10，v/v)；42min，a相/b相/c相(85：5：10，v/v)；42.1min，a相/b相/c相(60：0：40，v/v)；52min，a相/b相/c相(60：40：0，v/v)；52.1min，a相/b相/c相(95：5：0，v/v)；60min，a相/b相/c相(95：5：0，v/v)。通过对比各标准品单糖(衍生化处理后)的出峰时间和峰面积，对bu-cps-1b组分进行定性与定量分析，得出bu-cps-1的单糖组成及摩尔比。
[0083]
结果如图5和图6所示。
[0084]
将荚膜多糖的离子色谱图(图5)与混合单糖标准品衍生化产物峰图(图6)进行对比，，根据保留时间可知单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b主要是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，所述阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩尔比为0.51：0.25：300.19：1.95：1.72。且通过数据库比对发现，本发明中的bu-cps-1b的单糖组成与现有的拟杆菌属(包括脆弱拟杆菌)中得到的多糖中的单糖组成的种类和比例存在差异，推测其可能是一种新的结构的细菌胞外杂多糖。
[0085]
单形拟杆菌荚膜多糖对乳酸菌的体外增殖效果
[0086]
(1)单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b溶液的配制：
[0087]
取100mg上述实施例中得到的纯化单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b，按照0.2％、1％和2％(v/v)的量接种于mrs培养基(液体)中，0.22μm微孔滤膜过滤后即得用于体外增殖实验的单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b溶液。
[0088]
(2)单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b对乳酸菌的体外增殖：
[0089]
取上述实施例中复苏的乳酸菌(嗜酸乳杆菌cip 76.13、干酪乳杆菌atcc 393、植物乳杆菌dsm 10667、罗伊氏乳杆菌jcm 1112和鼠李糖乳杆菌jsm1136)，传代三代后用pbs稀释至od600＝0.2。进一步稀释5倍后进行种板，并等体积加入不同浓度(0％、0.1％、0.5％和1％)的单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1溶液。置于厌氧培养箱中，于不同时间点(0、12、24、36和48h)检测细菌的od600并绘制生长曲线。
[0090]
结果如图7所示。
[0091]
为了探究本发明实施例中的单形拟杆菌荚膜多糖对乳酸菌生长的影响，选择了应用最广泛的5株乳酸菌的代表菌株，包括嗜酸乳杆菌cip 76.13、干酪乳杆菌atcc 393、植物乳杆菌dsm 10667、罗伊氏乳杆菌jcm 1112和鼠李糖乳杆菌jsm1136。在厌氧条件下，观察加入0.1％。0.5％和1％浓度单形拟杆菌荚膜多糖对不同乳酸菌株生长的影响。结果发现，随着时间和浓度的增长，单形拟杆菌荚膜多糖对嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌的生
长具有显著的促进或刺激作用，而对于罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的增殖促进作用则相对较小。单形拟杆菌荚膜多糖对乳酸菌的体内增殖效果
[0092]
取15只雌性六周龄c57bl/6小鼠，适应性喂养一周后，根据体重随机分为2组(每组7-8只)：正常对照组(control)和单形拟杆菌荚膜多糖组(bu-cps)，正常组灌胃200μlpbs，bu-cps组每天灌胃200μl的1mg/ml的单形拟杆菌荚膜多糖bu-cps-1b溶液。
[0093]
同时记录小鼠在实验期间的体重变化。
[0094]
实验结束当天收集小鼠粪便，利用粪便基因组dna提取试剂盒(诺唯赞)获得总dna(作为dna模板)后，用qpcr体系进行定量测定。
[0095]
qpcr扩增体系如表2所示。
[0096]
表2qpcr扩增体系
[0097][0098][0099]
其中，上下游引物的选择如表3所示。
[0100]
表3各乳酸菌对应的引物序列
[0101][0102]
qpcr扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环45次；溶解曲线程序设定为95℃，1s；65℃，15s，采集15次，95℃维持。
[0103]
结果如图8-图9所示。
[0104]
为了探究单形拟杆菌荚膜多糖的安全性，发明人使用单形拟杆菌荚膜多糖对小鼠进行灌胃，并观察其连续灌胃9天的体重变化。结果发现，灌胃单形拟杆菌荚膜多糖后小鼠体重保持稳定，且有一定的升高的趋势，说明单形拟杆菌荚膜多糖无明显毒副作用，且能够一定程度上的有益于动物的生长发育。
[0105]
此外，为了探究单形拟杆菌荚膜多糖在动物体内对乳酸菌生长的影响，通过定量测定小鼠粪便中的微生物特异性基因来探究灌胃单形拟杆菌荚膜多糖对体内乳酸菌属及乳酸菌株相对丰度的影响。结果可以看出，单形拟杆菌荚膜多糖可以体内刺激乳酸菌属的生长，尤其是对于嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌具有非常显著的促生长作用，而对罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌有一定的促进作用，但效果并不十分显著。而对于植物乳杆菌，由于粪便中并未检出，因此，不能确定其实际体内效果。
[0106]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种单形拟杆菌荚膜多糖，其特征在于，所述单形拟杆菌荚膜多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，所述阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩尔比为0.51：0.25：300.19：1.95：1.72。2.权利要求1所述的单形拟杆菌荚膜多糖的提取方法，包括如下步骤：(1)对单形拟杆菌反复冻融后进行超声破碎，离心收集上清，减压浓缩后进行醇沉；(2)取醇沉沉淀物进行脱蛋白处理，超滤洗涤后使用离子交换纤维素进行层析，nacl洗脱，收集0mol/l峰段的洗脱液，即得单形拟杆菌荚膜多糖。3.单形拟杆菌提取物作为唯一活性物质在促进乳酸菌生长或增殖中的应用。4.单形拟杆菌提取物在制备改善体内环境中乳酸菌丰度的产品中的应用。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述单形拟杆菌提取物为单形拟杆菌荚膜多糖。6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述乳酸菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括饲料、饲料添加剂、食品、食品添加剂和药品。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品中还包括饲料、食品或药学中可接受的辅料。9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品中的单形拟杆菌提取物含量为0.1～100wt％。10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述体内环境为胃肠道环境。

技术总结
本发明公开了单形拟杆菌荚膜多糖提取物及其在促进乳酸菌增殖中的应用，所述单形拟杆菌提取物为单形拟杆菌荚膜多糖。本发明首次发现了一种单形拟杆菌荚膜多糖，并通过体内和体外试验验证了该单形拟杆菌荚膜多糖具有促进乳酸菌增殖的效果，且安全有效，无毒副作用，从而可以进一步实现对于乳酸菌的体外大量扩繁或规模化生产的目的，提高乳酸菌的产量和产出效率，或基于其体内增繁效果，用于提高受试者的胃肠道乳酸菌数量，进而实现促进消化吸收等保健效果，达到维持人体健康的效果。达到维持人体健康的效果。


技术研发人员：谢智勇 马冲 于汉生
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/9/23