用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体为用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组。


背景技术：

2.干细胞是一类具有自我更新复制、高度增殖和多向分化潜能并保持未分化状态的细胞，间充质干细胞(mesenchyma stem cell，mscs)是干细胞家族的重要成员，来源于中胚层的成体干细胞；被认为是再生医学领域最有临床应用前景的种子细胞。
3.随着再生医学领域的发展，人源间充质干细胞(human mesenchyma stem cell，hmscs)其因来源广泛、繁殖能力强、居多向分化的潜能被广泛运用于实验研究和临床治疗中。hmscs的生物学有效性质量属性的评价是其质量评价的重要内容，也是影响其临床研究和产品研发的重要环节。体外评价hmscs向不同细胞谱系分化的能力是hmscs生物学有效性质量评价的核心内容。目前普遍接受2006年isct首次提出的“三系”诱导分化能力的评价方法。
4.目前，成骨细胞诱导分化鉴定常用的是茜素红染色法。hmscs分化成骨后会矿化形成钙结节且有钙分泌，利用茜素红可以与钙发生显色反应，生成深红色化合物的特点，使成骨诱导细胞沉积的钙结节被染成了深红色。染色法具有操作简便，耗时较短，能直观反映检测结果的优点，但该方法在一些未经诱导分化的细胞或无成骨分化能力的细胞中表现为阳性。此外，染色法还有灵敏度低、定量范围较窄、手动操作时间较长等缺点。据文献报道，可利用骨细胞特定基因表达，通过该基因转录的mrna的多少来衡量的该基因表达水平，从而达到细胞分化能力鉴定的目的，可将此特定基因作为hmscs向骨细胞分化的一个分子标志物。
5.alpp基因编码碱性磷酸酶。成骨过程大致可分为细胞增殖及基质分泌期、细胞外基质成熟期、细胞外基质矿化期，其中ⅰ型胶原为早期骨形成的标志物，碱性磷酸酶常出现在基质成熟期。因此，可以通过检测alpp基因的表达水平来检测hmscs向骨细胞分化的能力。而荧光定量pcr技术是定量分析mrna的最通用、最快速、最简便的方法，该方法通过荧光强度变化实时监测产物量的变化，具有很高的灵敏性和特异性。


技术实现要素：

6.解决的技术问题
7.针对现有技术的不足，本发明提供了用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组，解决了常用的茜素红染色法具有灵敏度低、定量范围较窄、手动操作时间较长的缺点，并且通过检测alpp基因的表达水平来检测hmscs向骨细胞分化能力的方式还不够全面的问题。
8.技术方案
9.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：用于定量检测干细胞体外
诱导分化成骨细胞的引物组，包括正向扩增引物、反向扩增引物和内参基因gapdh的引物序列；
10.引物序列为：
11.seq id为no:1，目标基因为alpp，参考序列为nm_000237.3，序列(5
’→3’
)为f:caaaccgagacacaagcactcccac，片段长度为151；
12.seq id为no:2，目标基因为alpp，参考序列为nm_000237.3，序列(5
’→3’
)为r:agagtgacgggtccgtcacgttgtt，片段长度为151；
13.seq id为no:3，目标基因为gapdh，参考序列为nm_002046.7，序列(5
’→3’
)为f:gccatcactgccacccagaagac，片段长度为179；
14.seq id为no:4，目标基因为gapdh，参考序列为nm_002046.7，序列(5
’→3’
)为r:acgttggcagtggggacacggaa，片段长度为179。
15.优选的，所述正向扩增引物包括其核苷酸序列。
16.优选的，所述pcr反应包括pcr反应液，所述pcr反应液包括dntp、荧光染料和taq聚合酶。
17.优选的，所述引物组包括实验方法，具体实验步骤为：
18.s1.人源间充质干细胞的培养及成骨分化诱导
19.培养人源间充质干细胞至80-90％融合，分别设置成骨对照组和实验组，并选用相应培养基进行培养、染色鉴定诱导结果；
20.s2.待检hmscs样本的总rna提取
21.待培养及鉴定结束，采用rnaprep pure培养细胞/细菌总rna提取试剂盒相关提取步骤进行总rna提取；
22.s3.rna逆转录
23.根据相关操作规范，使用上述所提rna进行反转录；
24.s4.real-time pcr反应
25.使用成骨细胞分化相关基因alpp的引物片段结合superreal premix plus(sybr green)试剂盒方法进行混合体系配置、加样、设置并运行扩增程序；
26.s5.结果分析
27.根据荧光定量pcr反应数据，计算相对定量结果对hmscs进行成骨诱导分化鉴定。
28.一种定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的alpp基因引物组的应用，包括所述引物在荧光定量pcr检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的分化潜能的试剂盒中的应用。
29.有益效果
30.本发明提供了用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组。具备以下有益效果：
31.本发明提供了用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组，本发明具有灵敏度高、特异性高、应用场景可量化可统计的优点，其中灵敏度：使用实时荧光定量pcr技术，通过荧光强度变化实时监测产物量的变化，从分子层面对hmscs成骨分化能力鉴定提供了特定标记物进行检测，具有很高的灵敏性；特异性：对成骨分化特定基因产物进行扩增，避免染色法造成的假阳性结果，评价hmscs诱导分化成骨细胞的能力具有高度特异性；应用场景：现有技术手段针对间充质干细胞的生物学有效性检测中的分化能力检测，多用诱导
分化后的染色法进行结果判定，该方法虽有较直观的视觉图像呈现，但也有明显的缺点：假阳性、假阴性常见，显色灵敏度不够，也因观察方法为显微镜下观察法，视觉区域较微观，结果判定和观察时显微镜视野区域选择与变化关系巨大，而本专利涉及的引物如应用到干细胞诱导分化后的检测实验中，可以直接的避免上述弊端，得到可量化、可统计的数据结论。
附图说明
32.图1为本发明实验结果图组；
33.图2为本发明设计引物序列表图；
34.图3为本发明反应体系表图；
35.图4为本发明qpcr扩增程序表图；
36.图5为本发明rna提取及反转录浓度数据表图；
37.图6为本发明荧光定量pcr结果表图；
38.图7为本发明相对定量结果表图。
具体实施方式
39.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.实施例：
41.如图1-7所示，本发明实施例提供用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组，其特征在于：包括正向扩增引物、反向扩增引物和内参基因gapdh的引物序列；
42.引物序列为：
43.seq id为no:1，目标基因为alpp，参考序列为nm_000237.3，序列(5
’→3’
)为f:caaaccgagacacaagcactcccac，片段长度为151；
44.seq id为no:2，目标基因为alpp，参考序列为nm_000237.3，序列(5
’→3’
)为r:agagtgacgggtccgtcacgttgtt，片段长度为151；
45.seq id为no:3，目标基因为gapdh，参考序列为nm_002046.7，序列(5
’→3’
)为f:gccatcactgccacccagaagac，片段长度为179；
46.seq id为no:4，目标基因为gapdh，参考序列为nm_002046.7，序列(5
’→3’
)为r:acgttggcagtggggacacggaa，片段长度为179。
47.正向扩增引物包括其核苷酸序列，如序列表seq id no:1所示；反向序列如序列表seq id no:2所示；正向扩增引物和反向扩增引物，分别由seq id no:3、seq id no:4所示引物组成。
48.所述正向扩增引物包括其核苷酸序列，所述pcr反应包括pcr反应液，所述pcr反应液包括dntp、荧光染料和taq聚合酶。
49.所述引物组包括实验方法，具体实验步骤为：
50.s1.人源间充质干细胞的培养及成骨分化诱导
51.培养人源间充质干细胞至80-90％融合，分别设置成骨对照组和实验组，并选用相
应培养基进行培养、染色鉴定诱导结果；
52.s2.待检hmscs样本的总rna提取
53.待培养及鉴定结束，采用rnaprep pure培养细胞/细菌总rna提取试剂盒相关提取步骤进行总rna提取；
54.s3.rna逆转录
55.根据相关操作规范，使用上述所提rna进行反转录；
56.s4.real-time pcr反应
57.使用成骨细胞分化相关基因alpp的引物片段结合superreal premix plus(sybr green)试剂盒方法进行混合体系配置、加样、设置并运行扩增程序；
58.s5.结果分析
59.根据荧光定量pcr反应数据，计算相对定量结果对hmscs进行成骨诱导分化鉴定。
60.所述引物包括在荧光定量pcr检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的分化潜能的试剂盒中的应用。
61.real-time pcr反应体系为：
62.组分成分为2
×
superreal premix plus，20μl体系为10μl；
63.组分成分为正向引物(10μm)，20μl体系为0.5μl；
64.组分成分为反向引物(10μm)，20μl体系为0.5μl；
65.组分成分为cdna模板，20μl体系为1μl；
66.组分成分为rnase-free ddh20，20μl体系为8μl；
67.real-time pcr反应中qpcr扩增程序为；
68.阶段为预变性，循环为1
×
，温度为95℃，时间为15min，内容为预变性，荧光信号采集为否；
69.阶段为pcr反应，循环为40
×
，温度为95℃，时间为10sec，内容为变性，荧光信号采集为否；
70.阶段为pcr反应，循环为40
×
，温度为63℃，时间为20sec，内容为退火，荧光信号采集为否；
71.阶段为pcr反应，循环为40
×
，温度为72℃，时间为30sec，内容为延伸，荧光信号采集为是。
72.结果中rna提取及反转录浓度数据如下：
73.样本为rna，对照组为288ng/ul，成骨诱导组为322.7ng/ul；
74.样本为cdna，对照组为784.3ng/ul，成骨诱导组为840.4ng/ul；
75.荧光定量pcr结果为：
76.实验组别为实验组，孔位为d06，检测基因为alpp，ct值为28.85；
77.实验组别为实验组，孔位为e06，检测基因为alpp，ct值为28.4；
78.实验组别为实验组，孔位为f06，检测基因为alpp，ct值为28.74；
79.实验组别为实验组，孔位为d07，检测基因为gapdh，ct值为13.83；
80.实验组别为实验组，孔位为e07，检测基因为gapdh，ct值为13.48；
81.实验组别为实验组，孔位为f07，检测基因为gapdh，ct值为13.6；
82.实验组别为对照组，孔位为a06，检测基因为alpp，ct值为28.3；
83.实验组别为对照组，孔位为b06，检测基因为alpp，ct值为29.25；
84.实验组别为对照组，孔位为c06，检测基因为alpp，ct值为29.19；
85.实验组别为对照组，孔位为a07，检测基因为gapdh，ct值为11.91；
86.实验组别为对照组，孔位为b07，检测基因为gapdh，ct值为11.34；
87.实验组别为对照组，孔位为c07，检测基因为gapdh，ct值为12.76；
88.实验组别为阴性对照，孔位为a08，检测基因为alpp，ct值为0；
89.实验组别为阴性对照，孔位为b08，检测基因为alpp，ct值为0；
90.实验组别为阴性对照，孔位为c08，检测基因为alpp，ct值为0；
91.实验组别为阴性对照，孔位为d08，检测基因为gapdh，ct值为0；
92.实验组别为阴性对照，孔位为e08，检测基因为gapdh，ct值为0；
93.实验组别为阴性对照，孔位为f08，检测基因为gapdh，ct值为0；
94.相对定量结果为：
95.对照组为2.99e-05，实验组为8.12e-06，改变倍数为3.70。
96.一种定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的alpp基因引物组的应用，包括引物在荧光定量pcr检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的分化潜能的试剂盒中的应用。
97.图1中四张图分别为测定间充质干细胞分化诱导成骨细胞的核酸电泳结果示意图、alpp基因表达量结果图、对照组染色结果图、实验组诱导分化成骨的染色结果图。
98.基于上述内容具体还包括：
99.(1)人源间充质干细胞的培养及成骨分化诱导：培养人源间充质干细胞至80％-90％融合，分别设置成骨对照组和实验组，并选用相应培养基进行培养、染色鉴定诱导结果；
100.(2)待检hmscs样本的总rna提取：待培养及鉴定结束，采用rnaprep pure培养细胞/细菌总rna提取试剂盒相关提取步骤进行总rna提取；
101.(3)rna逆转录：根据相关操作规范，使用上述所提rna进行反转录；
102.(4)real-time pcr反应：使用成骨细胞分化相关基因alpp的引物片段结合superreal premix plus(sybr green)试剂盒方法进行混合体系配置、加样、设置并运行扩增程序。
103.(5)结果分析：根据荧光定量pcr反应数据，计算相对定量结果。
104.采用荧光定量pcr法对hmscs体外成骨分化后alpp基因表达量的检测及计算进一步的为：
105.依据试验方案，选择干细胞库冻存的人脐带来源间充质干细胞进行复苏、计数。所选细胞批号为：2022110141cr-p3。
106.选用6孔板进行培养，当hmscs培养至80％-90％融合，分别设置成骨对照组和实验组，各2孔。对照组使用完全间充质干细胞培养基，实验组使用成骨诱导培养基(含高糖dmem，10％fbs，1μmol/l地塞米松，200μmol/l抗坏血酸，10μmol/lβ-甘油磷酸钠)，诱导21d，每,2-3天换液1次。培养结束后镜下观察细胞形态变化，成骨诱导组用茜素红s染色鉴定钙结节。
107.样本总rna提取及反转录
108.rna提取及反转录分别用天根试剂盒rnaprep pure cell/bacteria kit、
fastking rt kit(with gdnase)说明书步骤进行。用紫外/可见光分光光度计(型号：nano drop 2000，本机构编号：mea-01-03)检测所提取样本的rna浓度并手动记录浓度,a260/a280及a260/a230。用1％琼脂糖凝胶电泳对提取的rna进行检测。
109.real-time pcr实验
110.引物设计
111.使用primer 3.0软件设计引物，设计成骨细胞分化相关基因alpp，内参基因gapdh，以上引物经过blast检验。以上引物对均由上海生工生物合成。
112.加样
113.real-time pcr反应：采用市购superreal premix plus(sybr green)，包括成cdna模板、2
×
superreal premix plus、引物和阴性对照；其余组分按以下表格比例表格配制qpcr反应体系，依据反应孔的数量等比例放大，混匀后，按设计好的排版顺序将反应预混液加入对应反应孔中，19μl/孔，3复孔。按设计好的反应板加入对应的待测cdna样本、纯水无模板阴性对照1μl/孔，3复孔，若液体挂壁，瞬时离心将液体离下。
114.qpcr扩增程序
115.按设计好的反应板排版。设置qpcr反应扩增程序。qpcr扩增程序如下：染料选择sybr green，扩增体积为20μl，热盖温度105℃。
116.数据分析
117.从9600plus系统中导出qpcr数据，选定定量结果栏查看ct值，判定ct值有无效，判定方法ct值》15，ct值《35。根据导出的ct值数据，利用2
–
δδct法计算相对定量结果。δct、δδct及相互计算由office excel 365(美国microsoft公司)软件计算得出。
118.结果
119.rna提取及反转录浓度数据。
120.rna质检结果
121.经电泳检测(如图1)，rna浓度和完整度均较好。可用于后续试验。
122.荧光定量pcr结果。
123.相对定量结果(参考图1)。
124.相对定量结果显示，与对照组相比较，成骨分化基因alpp表达倍数为3.70倍，表达量显著上调，指示hmscs分化为骨细胞。结果与染色法一致。
125.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组，其特征在于：包括正向扩增引物、反向扩增引物和内参基因gapdh的引物序列；引物序列为：seq id为no:1，目标基因为alpp，参考序列为nm_000237.3，序列(5
’→3’
)为f:caaaccgagacacaagcactcccac，片段长度为151；seq id为no:2，目标基因为alpp，参考序列为nm_000237.3，序列(5
’→3’
)为r:agagtgacgggtccgtcacgttgtt，片段长度为151；seq id为no:3，目标基因为gapdh，参考序列为nm_002046.7，序列(5
’→3’
)为f:gccatcactgccacccagaagac，片段长度为179；seq id为no:4，目标基因为gapdh，参考序列为nm_002046.7，序列(5
’→3’
)为r:acgttggcagtggggacacggaa，片段长度为179。2.根据权利要求1所述的用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组，其特征在于：所述正向扩增引物包括其核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组，其特征在于：所述pcr反应包括pcr反应液，所述pcr反应液包括dntp、荧光染料和taq聚合酶。4.根据权利要求1所述的用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组，其特征在于：所述引物组包括实验方法，具体实验步骤为：s1.人源间充质干细胞的培养及成骨分化诱导培养人源间充质干细胞至80-90％融合，分别设置成骨对照组和实验组，并选用相应培养基进行培养、染色鉴定诱导结果；s2.待检hmscs样本的总rna提取待培养及鉴定结束，采用rnaprep pure培养细胞/细菌总rna提取试剂盒相关提取步骤进行总rna提取；s3.rna逆转录根据相关操作规范，使用上述所提rna进行反转录；s4.real-time pcr反应使用成骨细胞分化相关基因alpp的引物片段结合superreal premix plus(sybr green)试剂盒方法进行混合体系配置、加样、设置并运行扩增程序；s5.结果分析根据荧光定量pcr反应数据，计算相对定量结果对hmscs进行成骨诱导分化鉴定。5.根据权利要求1所述的用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组，其特征在于：包括所述引物在荧光定量pcr检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的分化潜能的试剂盒中的应用。

技术总结
本发明提供用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组，涉及生物医药技术领域。该用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的ALPP基因的引物组，包括正向扩增引物、反向扩增引物和内参基因GAPDH的引物序列。本发明提供用于定量检测干细胞体外诱导分化成骨细胞的引物组，本发明提供的实时荧光定量PCR引物灵敏度高、特异性强，可快速对hMSCs成骨分化后细胞特定基因表达进行相对定量检测，对成骨诱导分化能力的评价提供了新依据；对建立hMSCs生物学有效性质量评价技术体系具有重要意义，为补充和完善hMSCs质量评价技术体系和后续对间充质干细胞分化能力的质量评价建立必要的基础，进一步将hMSCs更好地应用于临床细胞治疗和组织修复与再生医学治疗。细胞治疗和组织修复与再生医学治疗。细胞治疗和组织修复与再生医学治疗。


技术研发人员：陈曦 张瑞丽 钱云 莫春红 李春春 闫姗姗 李兵 杨瑜 姜小锋
受保护的技术使用者：云南舜喜再生医学工程有限公司
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/9/23