能够抑制多种植物的病原菌并对多种作物有促生作用的假单胞菌及筛选方法和应用

1.本发明涉及一种能够抑制多种植物的病原菌并对多种作物有促生作用的假单胞菌及筛选方法和应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.随着现代化农业可持续发展战略的要求，生物防治手段不仅迎合了此战略目标，且能够有效推动农业行业的发展，目前生物防治在土传病害控制方面已经受到广泛的重视，根腐、枯萎、黑胫是常见的土传病害，多种镰刀菌、立枯丝核菌、疫霉等是造成多种作物根腐病、枯萎病、立枯病、黑胫病等病害的主要病原。在控制病害发生、挽回作物产量及品质损失的同时，生防菌对作物生长的促进作用也受到了广泛关注。利用生防菌来替代化学农药及化肥的使用逐渐成为现代农业技术的研究热点。促进作物生产控制病害发生的生防菌可通过解磷、解钾和固氮、产生吲哚乙酸iaa等植物生长激素等方式促进植物的生长和发育。近年来，关于对多种作物均有促进生长作用且产生iaa细菌的研究鲜有报道，因此筛选能够产生iaa并促进作物生长的菌株具有重要的理论和实践意义。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种能够抑制多种植物的病原菌并对多种作物有促生作用的假单胞菌及筛选方法和应用。该假单胞菌能够抑制多种植物病原真菌生长的同时，还能促进丹参、山药、白术、金银花、小麦及花生的产量的提高。
4.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
5.一种能够抑制植物病原菌并有促生作用的假单胞菌，所述假单胞菌为假单胞菌a34-9(pseudomonas sp.a34-9)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m2022397，保藏日期：2022年04月08日，保藏地址：中国武汉武汉大学。
6.所述植物病原菌包括：镰刀菌、立枯丝核菌、疫霉。
7.所述镰刀菌包括：亚洲镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、层出镰刀菌、腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌。
8.抑制植物病原菌并有促生作用的植物包括：丹参、山药、白术、金银花、小麦、花生。
9.所述的假单胞菌的筛选方法，采集内蒙古阿尔山上种植烟草的根际土壤，将土壤加入无菌水中充分振荡获得土壤悬浮液，然后将土壤悬浮液进行倍比稀释，取稀释液涂布于kb固体培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养36h，至菌落长出后分离纯化，并筛选出菌株。
10.所述的假单胞菌应用于促生植物时的发酵液的制备方法，包括下述步骤：将假单胞菌a34-9接种于kb培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养16h，制备种子菌；将种子菌以3％(v/v)的接种量接种于kb培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液；发酵液中假单胞菌活菌浓度为109～10
10
cfu/ml。
11.kb培养基包括：蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氢二钾1.5g，七水合硫酸镁1.5g，琼脂0g或20g，添加蒸馏水定容至1000ml，混匀后分装于三角瓶中，于121℃灭菌30min。
12.所述的假单胞菌在抑制植物病原菌方面的应用。
13.所述的假单胞菌在植物促生方面的应用。
14.所述的假单胞菌在防治作物土传根部病害方面的应用。
15.本发明有益效果：
16.本发明通过平板对峙抑菌、防病和大田促生实验，首次从阿尔山上的土壤中筛选出能够同时防治多种土传真菌病害并提高作物产量的生防菌p34-9，经鉴定该菌株为假单胞菌a34-9(pseudomonas sp.a34-9)。试验表明，本发明的假单胞菌对多种镰刀菌、疫霉、立枯丝核菌均具有抑制作用，其中对腐皮镰刀菌的防效为59.69％、疫霉的防效为75％。
17.本发明假单胞菌可生物防治由多种镰刀菌(尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、层生镰刀菌、假禾谷镰刀菌、禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌)、丝核菌、疫霉等植物病原真菌引起的土传病害，并能提高丹参、山药、白术、金银花、小麦及花生等作物的产量。
18.本发明筛选的假单胞菌使用效果较好，使用后不会产生抗药性、农药残留、环境污染等化学农药常见问题，对人畜健康、环境友好，符合人们对生态农业的需求。
附图说明
19.图1为实施例6中菌株a34-9在大田应用中丹参根茎的促生对比。
20.图中，ck：对照处理，3：菌株a34-9处理。
21.图2为实施例8中菌株a34-9在大田应用中山药根茎促生对比。
22.图3为实施例12中菌株a34-9对花生田间长势的影响。
具体实施方式
23.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
24.实验材料：
25.kb培养基：蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氢二钾1.5g，七水合硫酸镁1.5g，琼脂20g(仅做固体培养基时添加)，添加蒸馏水定容至1000ml，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min。
26.pda培养基：马铃薯200g(切成边长约1cm的小块，放入800ml蒸馏水煮沸15min，双层纱布过滤后留取滤液)，葡萄糖20g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌30min。
27.本发明所用病原菌及其它原料、试剂均由市场购得。
28.实施例1、生防菌的分离
29.在内蒙古阿尔山上采集种植烟草的根际土壤，称取1g土壤，加入10ml无菌水中充分振荡获得土壤悬浮液，然后将土壤悬浮液摇匀后进行倍比稀释，取0.1ml稀释液涂布于kb固体培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养36h，至菌落长出，挑取大小、颜色或形态不同的菌落在kb固体培养基表面划线分离纯化，获得1株菌株，并命名为p34-9。
30.实施例2、生防菌对多种真菌病原的抑制
31.利用平板对峙方法筛选生防菌：将多种真菌病原(具体见表1)分别接种在pda培养基上，分别于28℃条件下培养5～10d，用灭过菌的打孔器将病原菌菌落打成直径为5mm的圆
形菌丝块。将病原菌菌块与分离菌株(p34-9)接入pda培养基上，病原菌菌块与分离菌株相距20mm，同时设置单独接种病原菌菌块作为对照。每处理3次重复，待对照真菌长满平板后检查对峙培养结果，结果见表1，p34-9对多株病原菌均有一定的抑菌率(表1)。
32.表1阿尔山土壤分离的1株菌株对多种真菌病原的抑菌结果
[0033][0034]
分离菌株发酵滤液抑菌活性测定：取培养24h的菌株p34-9，接入100ml kb培养液，于28℃、180rpm摇瓶发酵2d，离心后留滤液，用微孔滤膜过滤2次(4℃保存)，然后配制含滤液300ml/l的pda平板，在每板中央接入5mm病原菌菌块1个，于28℃恒温培养，5d后观察结果。
[0035]
结果表明，菌株p34-9对疫霉、腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌均有较好的抑制效果。
[0036]
实施例3、生防菌鉴定
[0037]
菌株形态及生理生化：菌株p34-9革兰氏染色阴性，在kb培养基上，28℃培养48h的菌落形态圆形凸起，表面光滑湿润，乳白色至微黄色、半透明，挑起菌落粘稠，培养基上有可扩散的荧光颜料(仅紫外uv2上可见)。5℃能够生长，41℃不能生长。精氨酸二水解酶、氧化酶和明胶液化呈阳性，硝酸盐还原和反硝化试验、甲基红和vp试验均为阴性，不能水解淀粉。
[0038]
测序：对菌株p34-9进行基因组测序，鉴定结果表明核酸序列与荧光假单胞(pseudomonas fluorescens strain atcc13525)、假单胞ru47(p.sp.ru47)也有较高得分，根据ani分析结果表明该菌与假单胞ru47(p.sp.ru47)相似度最高91％，故综合鉴定该菌株为假单胞菌(pseudomonas sp.a34-9)a34-9。对a34-9进行基因测序，其genbank登录号为cp119967。
[0039]
假单胞菌a34-9(pseudomonas sp.a34-9)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m 2022397，保藏日期：2022年04月08日，保藏地址：中国武汉武汉大学。
[0040]
实施例4、生防菌对烟叶过敏性试验
[0041]
将在28℃条件下，培养24h的假单胞菌a34-9，用10mm mgso4配成107～108cfu/ml(od
600
在0.3～0.5)的菌液，对普通烟叶进行注射接种，在24℃，60％-80％的高湿度条件下，24-48h后出现过敏性坏死枯斑的为阳性反应，3d后出现较透明黄斑的为阴性反应，以10mm mgso4注射接种为阴性对照，以107～108cfu/ml烟草野火病病原菌注射接种为阳性对照。
[0042]
结果发现，假单胞菌a34-9过敏性试验为阴性反应，因此假单胞菌a34-9无致病性，可作为潜在生防菌。
[0043]
实施例5、生防菌对丹参的盆栽促生试验
[0044]
假单胞菌a34-9发酵液的制备方法为：将假单胞菌a34-9接种于kb培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养16h制备种子菌，种子菌以3％(v/v)的接种量接种于kb培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液；发酵液中假单胞菌活菌浓度为109～10
10
cfu/ml。
[0045]
使用时，用无菌水10倍稀释发酵液，稀释液活菌浓度为108～109cfu/ml。
[0046]
选取长势一致的3-4片真叶丹参苗移栽于装有灭菌土与基质的体积比3:1的花盆中，每盆1株。采用灌根法接种假单胞菌a34-9：移栽缓苗3-5d，用少量清水湿润土壤，后用移液枪头将假单胞菌a34-9发酵液(108cfu/ml)灌入植株根际，10ml/株，之后7d灌根1次，共灌根2次；对照组以同样方法接入等量kb培养基(ck)。接种生防菌后，每3天浇一次水，置于25℃温室中培养，培养30d后调查丹参种苗生长情况。
[0047]
结果表明，假单胞菌a34-9对丹参生长有良好促进作用，可以有效增加丹参根鲜重(表2)。
[0048]
表2假单胞菌a34-9对盆栽的丹参苗促生作用
[0049]
处理主根数(根)侧根数(根)根重量(克)根鲜重增产率(％)a34-914.132.3135.09ck14.101.71-[0050]
实施例6、生防菌对丹参的大田促生试验
[0051]
假单胞菌a34-9发酵液的制备方法同实施例5。
[0052]
在长势一致一年生丹参大田，在六月底至7月底丹参根部旺盛生长时期施用生防菌假单胞菌a34-9发酵液。采用茎基部喷淋法接种生防菌，每亩地施用3升假单胞菌a34-9发酵液(活菌浓度为2
×
109cfu/升)，重复接种2次，间隔为30d，对照组采用同样方法接入等量kb培养基(ck)。大田栽培条件、水肥管理一致，均不再使用任何化学农药。待丹参收获期，将植株小心整株挖出，洗去根部泥土，测量并记载处理与对照区域丹参跟条数、产量等数据。
[0053]
结果表明，假单胞菌a34-9能够促进丹参根长、主根跟粗、丹参产量，说明假单胞菌a34-9具有良好的促生作用(图1、表3)。
[0054]
表3假单胞菌a34-9对大田丹参的促生作用
[0055][0056]
实施例7、生防菌对山药茎段生根、发芽促生试验
[0057]
假单胞菌a34-9发酵液的制备方法同实施例5。
[0058]
均匀选取8cm左右的山药茎段，进行生防菌假单胞菌a34-9山药茎段出芽促生试验。采用浸泡法：将山药茎段浸泡在假单胞菌a34-9发酵液(活菌浓度为2
×
108cfu/升)，浸泡后自然晾干，移栽至温室沙床进行出芽培养，以浸泡kb培养基为对照，并设置清水对照(清水浸泡)及空白对照(不作任何处理)，进行生根出芽试验。
[0059]
结果表明，山药茎段浸泡假单胞菌a34-9，处理2小时，能明显的促进山药须根长度、须根数量，促进地上茎的生长，提高山药茎段的发芽率(表4)。从表4可看出用假单胞菌a34-9浸泡处理山药茎段，可有效提高山药茎段发芽率，提高须根长度和地上茎的长度。
[0060]
表4假单胞菌a34-9对山药茎段的生根、发芽作用
[0061][0062]
实施例8、生防菌对山药的大田促生试验
[0063]
假单胞菌a34-9发酵液的制备方法同实施例5。
[0064]
在长势一致的山药大田，在六月底至7月底山药地下茎旺盛生长时期施用生防菌假单胞菌a34-9发酵液。采用茎基部喷淋法接种生防菌，每亩地施用2-3升假单胞菌a34-9发酵液(活菌浓度为2
×
109cfu/升)，重复接种2次，间隔为30d，对照组采用同样方法接入等量kb培养基(ck)。大田栽培条件、水肥管理一致，均不使用任何化学农药。待山药地下茎收获期，将植株小心整株挖出，洗去根部泥土，测量并记载处理与对照区域山药地下茎长度、小区产量。
[0065]
结果表明，假单胞菌a34-9能够促进山药地下茎长度、单株产量(图2、表5)。
[0066]
表5假单胞菌a34-9对大田山药的促生作用
[0067][0068]
实施例9、生防菌对白术的大田促生试验
[0069]
假单胞菌a34-9发酵液的制备方法同实施例5。
[0070]
在长势一致的白术大田，于六月底至7月底白术地下根状茎旺盛生长时期施用生防菌假单胞菌a34-9发酵液。采用茎基部喷淋法接种生防菌，每亩地分别施用1升、2升、3升假单胞菌a34-9发酵液(活菌浓度为2
×
109cfu/升)，重复接种2次，间隔为30d，对照组采用同样方法接入等量kb培养基(ck)。大田栽培条件、水肥管理一致，均不再使用任何化学农药。待白术地下茎收获期，将植株小心整株挖出，洗去根部泥土，小区测量并记载处理与对照区域地下茎长度。
[0071]
结果表明，假单胞菌a34-9对白术地下根状茎有明显促进作用(表6)。用假单胞菌a34-9菌剂1升-2升/亩可以有效提高白术株高、小区成苗数，增加小区产量30％以上。
[0072]
表6假单胞菌a34-9对大田白术促生作用
[0073][0074]
实施例10、生防菌对金银花的大田促生试验
[0075]
假单胞菌a34-9发酵液的制备方法同实施例5。
[0076]
在长势一致的金银花大田，初春金银花花芽萌动期及茎叶快速生长期施用生防菌假单胞菌a34-9发酵液。采用灌根或喷淋法接种生防菌，每亩地分别施用2升、3升、5升假单胞菌a34-9发酵液(活菌浓度为2
×
109cfu/升)，重复接种2次，间隔为30d，对照组采用同样方法接入5升kb培养基(ck)。大田栽培条件、水肥管理一致，均不再使用任何化学农药。待金银花(四季花)头茬花收获期，进行小区测产。
[0077]
结果表明，使用假单胞菌a34-9菌剂1升-5升/亩能够有效促进金银花头茬花花蕾长度、百针重、累积头茬花产量(表7)。
[0078]
表7假单胞菌a34-9对金银花的促生作用
[0079][0080]
实施例11、生防菌对小麦的增产试验
[0081]
假单胞菌a34-9发酵液的制备方法同实施例5。
[0082]
在长势一致的小麦大田，在小麦一叶一心期施用生防菌假单胞菌a34-9发酵液。采用喷淋法接种生防菌，每亩地分别施用1升、1.5升假单胞菌a34-9发酵液(活菌浓度为2
×
109cfu/升)，接种1次，对照组采用同样方法接入1.5升kb培养基(ck)。大田栽培条件、水肥管理一致，均不再使用任何化学农药。待小麦收获期，进行小区测产。
[0083]
结果表明，假单胞菌a34-9能够促进小麦分蘖、增加小麦茎粗、增加小麦产量，对小麦生长和产量有明显促进作用(表8)。
[0084]
表8假单胞菌a34-9对小麦的促生作用
[0085]
项目a34-91l/亩a34-91.5l/亩ck株高(cm)34.1234.3234.02分蘖数3.363.253.05茎粗(mm)3.463.192.95颗粒数/穗37.0044.3336.87小区产量(g/0.25m2)254.30257.50202.33
[0086]
实施例12、生防菌对花生的增产试验
[0087]
假单胞菌a34-9发酵液的制备方法同实施例5。
[0088]
在长势一致的花生大田，在6月下旬苗期至开花下针期施用生防菌假单胞菌a34-9发酵液。采用喷淋法接种生防菌，每亩地施用2升假单胞菌a34-9发酵液(活菌浓度为2
×
109cfu/升)，接种1次，对照组采用同样方法接入2升kb培养基(ck)。大田栽培条件、水肥管理一致，均不再使用任何化学农药。
[0089]
在花生饱果成熟期分别测量株高、样方内花生植株数、第一对分支长度、15cm内分节数、未结果下针率、饱果率、分支数，并在花生收获期调查10株花生果荚鲜重、测定未结果下针率，及根腐病发生情况，晾干后测定百荚重、百仁重。
[0090]
从表9可看出，假单胞菌a34-9能够有效增加单位面积内花生植株数量、降低株高和第一对分支长度，增加15cm内分节数，从理论上能有效提高花生结实率。同时降低未结果下针率，在最终收获期测产发现，假单胞菌a34-9可以有效提高百仁重及百荚重量，有效提高花生产量(表9)。从图3可以看出，采用菌株a34-9的花生田间长势明显优于对照组。
[0091]
表9假单胞菌a34-9对花生的促生作用
[0092]
项目cka34-9平均株高(cm)46.8942.83样方内平均株数(株/0.8m2)24.431第一对分支长度(cm)50.7046.6915cm分节数3.774未结果下针率(％)16.1512.61饱果率(％)30.2630.54分支数8.78.710株花生果荚鲜重产量(克)283.63347.50增产率(％)022.52折干率58.2158.96未结果下针率(％)18.1514.00饱果率(％)42.5544.42百荚重127.35130.47百仁重56.5158.97根腐病防效(％)052.87
[0093]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的可能修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种能够抑制植物病原菌并有促生作用的假单胞菌，其特征在于，所述假单胞菌为假单胞菌a34-9(pseudomonas sp.a34-9)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m 2022397，保藏日期：2022年04月08日。2.如权利要求1所述的假单胞菌，其特征在于，所述植物病原菌包括：镰刀菌、立枯丝核菌、疫霉。3.如权利要求2所述的假单胞菌，其特征在于，所述镰刀菌包括：亚洲镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、层出镰刀菌、腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌。4.如权利要求1所述的假单胞菌，其特征在于，抑制植物病原菌并有促生作用的植物包括：丹参、山药、白术、金银花、小麦、花生。5.一种如权利要求1所述的假单胞菌的筛选方法，其特征在于，采集内蒙古阿尔山上种植烟草的根际土壤，将土壤加入无菌水中充分振荡获得土壤悬浮液，然后将土壤悬浮液进行倍比稀释，取稀释液涂布于kb固体培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养36h，至菌落长出后分离纯化，并筛选出菌株。6.一种权利要求1所述的假单胞菌应用于促生植物时的发酵液的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：将假单胞菌a34-9接种于kb培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养16h，制备种子菌；将种子菌以3％(v/v)的接种量接种于kb培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液；发酵液中假单胞菌活菌浓度为109～10
10
cfu/ml。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，kb培养基包括：蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氢二钾1.5g，七水合硫酸镁1.5g，琼脂0g或20g，添加蒸馏水定容至1000ml，混匀后分装于三角瓶中，于121℃灭菌30min。8.一种如权利要求1所述的假单胞菌在抑制植物病原菌方面的应用。9.一种如权利要求1所述的假单胞菌在植物促生方面的应用。10.一种如权利要求1所述的假单胞菌在防治作物土传根部病害方面的应用。

技术总结
本发明提供一种能够抑制多种植物的病原菌并对多种作物有促生作用的假单胞菌及筛选方法和应用。所述假单胞菌为假单胞菌A34-9(Pseudomonas sp.A34-9)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2022397，保藏日期：2022年04月08日。该假单胞菌对多种镰刀菌、疫霉、立枯丝核菌均具有抑制作用，其中对腐皮镰刀菌的防效为59.69％、疫霉的防效为75％。该假单胞菌能够抑制多种植物病原真菌生长的同时，还能促进丹参、山药、白术、金银花、小麦及花生的产量的提高。麦及花生的产量的提高。麦及花生的产量的提高。


技术研发人员：文艺 鲁传涛 高素霞 秦艳红 刘玉霞 王飞 戚文平 高飞 李绍建 崔江宽 杨瑾 李雪梦
受保护的技术使用者：河南省农业科学院植物保护研究所
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/9/23