一种与花生黄曲霉产毒抗性主效位点qAFTB06紧密连锁的分子标记及其应用

一种与花生黄曲霉产毒抗性主效位点qaftb06紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种与花生黄曲霉产毒抗性主效位点qaftb06紧密连锁的分子标记及其应用。


背景技术：

2.花生(arachis hypogaea l.)是我国重要的油料作物和经济作物，在油料供给、增加农民收入等方面发挥了重要作用。黄曲霉毒素(aflatoxin)是黄曲霉菌(aspergillus flavus)和寄生曲霉菌(a.parasiticus)的次级代谢产物，是世界卫生组织认定的超强剧毒性致癌物质，可引起人和动物中毒，严重影响人体的生长发育。当前，黄曲霉毒素污染导致的食品安全问题尤为突出，已成为种植、收获、储运、加工过程中普遍存在的质量安全隐患，对消费者健康和花生产业发展威胁很大。培育和种植抗黄曲霉花生品种是控制黄曲霉毒素污染最为经济有效的方法。
3.黄曲霉毒素含量是个复杂的数量性状，容易受到环境影响。目前通过室内人工接种检测方法，已筛选到一批优异的黄曲霉抗性种质资源。但是检测方法费时费力，过程复杂，需要经过人工接种、共培养、提取毒素等环节，还需要高效液相色谱进行检测，检测效率较低。随着分子遗传学的快速发展，利用全基因组高通量测序技术，结合表型数据进行连锁分析，可以在基因组上定位到调控目标性状的主效qtl位点。通过开发与主效位点紧密连锁的标记，进行黄曲霉产毒抗性分子标记辅助选择育种，有效地提高目标性状的育种效率。然而，花生黄曲霉产毒抗性相关qtl报道较少，限制了分子标记辅助培育高抗黄曲霉产毒的品种。


技术实现要素：

4.本发明提供一种与花生黄曲霉产毒抗性主效位点qaftb06紧密连锁的分子标记及其应用，用于高抗黄曲霉产毒花生材料的分子标记辅助选择。
5.本发明提供一种与花生黄曲霉产毒抗性主效位点qaftb06紧密连锁的分子标记，所述分子标记为indelaftb06；
6.分子标记indelaftb06与qtl位点qaftb06连锁，所述分子标记indelaftb06能够通过如seq id no.1-2所示的引物对扩增得到。本发明在花生b06染色体9.24mb-13.31mb区间新发现了一个花生黄曲霉产毒抗性主效位点qaftb06，以及开发了一个紧密连锁的分子标记indelaftb06。本发明提供了一个花生黄曲霉产毒抗性主效稳定的qtl位点qaftb06及其连锁的标记。
7.本发明提供用于扩增所述分子标记的引物。
8.根据所述引物，包括如seq id no.1-2所示的序列。
9.本发明提供含有所述引物的试剂或试剂盒。
10.本发明提供所述分子标记或所述引物或所述试剂或试剂盒的以下任一应用：
11.(1)在鉴定花生抗黄曲霉性状表型中的应用；
12.(2)在花生抗黄曲霉基因分型中的应用；
13.(3)在鉴定花生黄曲霉毒素抗性高低中的应用。
14.优选的，所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素b1和/或黄曲霉毒素b2。
15.本发明提供所述的分子标记或所述的引物或所述的试剂或试剂盒的以下任一应用：
16.(1)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
17.(2)在筛选或创制花生抗黄曲霉性状不同的花生中的应用。
18.本发明提供所述的分子标记或所述的引物或所述的试剂或试剂盒在花生抗黄曲霉性状早期预测中的应用。
19.本发明提供鉴定花生抗黄曲霉性状的方法，包括：
20.(1)提取待鉴定花生的dna；
21.(2)以dna为模板，利用seq id no.1-2所示引物进行pcr扩增；
22.(3)通过判断待鉴定花生的基因型，判断抗黄曲霉能力的强弱。
23.优选的，若扩增产物与抗黄曲霉能力强的母本或父本的基因型一致，则判断待鉴定花生具有相对较强的抗黄曲霉能力；若否，则待鉴定花生抗黄曲霉能力相对较弱。
24.优选的，通过比较扩增产物与双亲的带型关系，判断待鉴定花生的基因型。
25.根据所述鉴定花生抗黄曲霉性状的方法，所述待鉴定花生的母本为中花10号，父本为icg12625。
26.根据所述鉴定花生抗黄曲霉性状的方法，若待鉴定花生扩增出与母本中花10号相同的基因型，记为aa；
27.若待鉴定花生扩增出与父本icg12625相同的基因型，记为aa。
28.本发明获得的与花生黄曲霉产毒抗性主效位点qaftb06连锁标记能够在花生育种中辅助选择高抗黄曲霉产毒的花生材料，有利于推动高抗黄曲霉品种的选育，提高育种效率。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1是本发明实施例1黄曲霉毒素b1和b2含量qtl展示。
31.图2是本发明实施例1不同等位基因型花生资源黄曲霉毒素b1和b2含量差异。
具体实施方式
32.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例1
34.以栽培种花生中花10号为母本，高抗黄曲霉产毒的种质资源icg12625为父本进行杂交，通过单粒传种法构建了一个重组自交系(ril)群体，包含有140个家系。
35.利用基因组重测序技术，以已发表的栽培种花生tifrunner基因组信息为参考，构建了一个包含424897个标记、覆盖1469.6cm遗传距离的遗传连锁图。
36.该群体2018-2020年种植于中国农业科学院油料作物研究所武昌试验基地。采用完全随机区组实验设计两次重复。每次重复每个家系种植1行15个单株，行距30厘米，株距10厘米。采取标准的田间管理方式，收获生长正常的10个单株成熟的荚果。荚果晾晒后，控制种子含水量在5％-8％之间。
37.每个家系挑选80粒饱满成熟无病斑的种子人工接种黄曲霉菌株af2202，放置于人工气候箱中培养7天，之后将花生种子烘干磨碎，使用55％甲醇溶液提取黄曲霉毒素，采用hplc的方法检测花生籽仁中黄曲霉毒素b1和b2的含量。利用windows qtl cartographer 2.5软件的复合区间作图法进行黄曲霉毒素含量的连锁分析。
38.通过连锁分析，在三个环境下检测到b06染色体上调控黄曲霉毒素b1含量的qtl有5个，lod值为4.76-5.87，遗传变异解释率为12.16％-14.35％，其中在qafb1.1和qafb1.2能够重复检测到，置信区间为23.3-25.9cm，区间两侧变异位点分别为c16b033和c16b039。b06染色体上调控黄曲霉毒素b2含量的qtl有4个，lod值为3.93-6.14，遗传变异解释率为9.71％-14.31％，其中qafb2.1和qafb2.3能够重复检测到，置信区间为23.3-26.3cm，区间两侧变异位点分别为c16b033和c16b040。区间c16b033-c16b040在多环境下重复检测到同时调控黄曲霉毒素b1和b2的含量，为调控黄曲霉毒素含量的主效位点，命名为qaftb06(图1)。参考基因组的信息，该区间的物理位置为b06染色体上9.24mb-13.31mb，区间大小约为4mb，是一个新的调控花生产毒抗性的主效位点。
39.根据连锁分析的结果，在b06染色体9.5mb的位置设计了一对indel引物，indelaftb06-f序列为cttttactcaattggcaggaacttc(seq id no.1)，indelaftb06-r序列为ggaagttcaacaaacccttttgaac(seq id no.2)。该引物扩增的片段与目标qtl紧密连锁。利用该标记对52份花生种质资源材料进行pcr扩增，扩增产物通过page胶进行检测。
40.其中37份种质资源扩增出与母本中花10号相同的带型，记为aa；15份种质资源扩增出与父本icg12625相同的带型，记为aa。这52份种质资源已完成了2019-2021年三个环境下的黄曲霉毒素检测(表1)。
41.经过统计分析，等位基因型为aa的资源材料在三个环境下种植，接种后检测黄曲霉毒素b1含量平均值分别为215.17μg/g、144.42μg/g、234.69μg/g，黄曲霉毒素b2含量平均值分别为19.05μg/g、14.71μg/g、29.33μg/g。等位基因型为aa的资源材料在三个环境下种植，接种后检测黄曲霉毒素b1含量平均值分别为112.19μg/g、36.58μg/g、106.89μg/g，黄曲霉毒素b2含量平均值分别为7.32μg/g、3.07μg/g、16.37μg/g。独立样本t检验结果表明，两个等位基因型材料的黄曲霉毒素b1和b2含量均呈极显著差异。说明本发明的分子标记indelaftb06可以有效筛选高抗黄曲霉产毒的花生材料。
42.表1 52份种质资源的等位基因型和黄曲霉毒素含量
43.[0044][0045]
[0046]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种与花生黄曲霉产毒抗性主效位点qaftb06紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为indelaftb06；分子标记indelaftb06与qtl位点qaftb06连锁，所述分子标记indelaftb06能够通过如seq id no.1-2所示的引物对扩增得到。2.用于扩增权利要求1所述分子标记的引物。3.根据权利要求2所述引物，其特征在于，包括如seq id no.1-2所示的序列。4.含有权利要求2或3所述的引物的试剂或试剂盒。5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物或权利要求4所述试剂或试剂盒的以下任一应用：(1)在鉴定花生抗黄曲霉性状表型中的应用；(2)在花生抗黄曲霉基因分型中的应用；(3)在鉴定花生黄曲霉毒素抗性高低中的应用；优选的，所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素b1和/或黄曲霉毒素b2。6.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物或权利要求4所述的试剂或试剂盒的以下任一应用：(1)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；(2)在筛选或创制花生抗黄曲霉性状不同的花生中的应用。7.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物或权利要求4所述的试剂或试剂盒在花生抗黄曲霉性状早期预测中的应用。8.鉴定花生抗黄曲霉性状的方法，其特征在于，包括：(1)提取待鉴定花生的dna；(2)以dna为模板，利用seq id no.1-2所示引物进行pcr扩增；(3)通过判断待鉴定花生的基因型，判断抗黄曲霉能力的强弱；优选的，若扩增产物与抗黄曲霉能力强的母本或父本的基因型一致，则判断待鉴定花生具有相对较强的抗黄曲霉能力；若否，则待鉴定花生抗黄曲霉能力相对较弱。9.根据权利要求8所述鉴定花生抗黄曲霉性状的方法，其特征在于，所述待鉴定花生的母本为中花10号，父本为icg12625。10.根据权利要求9所述鉴定花生抗黄曲霉性状的方法，其特征在于，若待鉴定花生扩增出与母本中花10号相同的基因型，记为aa；若待鉴定花生扩增出与父本icg12625相同的基因型，记为aa。

技术总结
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种与花生黄曲霉产毒抗性主效位点qAFTB06紧密连锁的分子标记及其应用，本发明获得的与花生黄曲霉产毒抗性主效位点qAFTB06连锁标记能够在花生育种中辅助选择高抗黄曲霉产毒的花生材料，有利于推动高抗黄曲霉品种的选育，提高育种效率。育种效率。育种效率。


技术研发人员：廖伯寿 黄莉 雷永 喻博伦 姜慧芳 罗怀勇 周小静 刘念 陈伟刚
受保护的技术使用者：中国农业科学院油料作物研究所
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/9/23