鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白重组载体及其构建方法和应用

鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白重组载体及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白重组载体及其构建方法和应用。


背景技术：

2.传染性法氏囊(ibd)是一类严重危害幼龄鸡的急性、高度接触性和免疫抑制性疾病。传染性法氏囊病病毒能感染腔上囊内的前b淋巴细胞，破坏b淋巴细胞从而导致体液免疫应答，造成免疫抑制和疫苗免疫失败。
3.传染性法氏囊病首先在美国特拉华州甘布罗镇爆发，此后该病在全球扩散并出现变异毒株，导致鸡群极高的死亡率，直到现在传染性法氏囊病仍威胁着全球养禽业。在养禽业为了有效防控传染性法氏囊病的传播和扩散，已经有不同类型的免疫接种方案广泛应用。目前养禽业接种的疫苗多为弱毒疫苗或者灭活疫苗，能有效诱导动物产生体液免疫，其中传染性法氏囊病病毒vp2蛋白能够诱导产生具有保护性的中和抗体。因此用vp2蛋白包被的elisa试剂盒被广泛应用于鸡场免疫效果检测中。
4.目前市面上有多种品牌的传染性法氏囊病elisa抗体检测试剂盒，国外较为知名的品牌有idexx，国产也有很多，但是都是原核表达蛋白包被。现有技术利用原核表达ibdv vp2蛋白检测血清中抗体。缺点是原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。而且表达出来的蛋白没有经过修饰，不一定具有天然活性。由于细菌培养过程中会产生内毒素，原核表达系统表达出来的蛋白需要经过去内毒素处理，否则会产生毒性，也可能影响抗原抗体的识别和结合反应。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提出鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白重组载体及其构建方法和应用，具有良好的抗衰老的效果。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.本发明提供一种带酶切位点的特异性引物扩增vp2基因，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明提供一种重组pfastbac-vp2质粒的制备方法，从ibdv病毒中提取rna，反转录为cdna后，用上述带酶切位点的特异性引物扩增vp2基因，并通过双酶切连接到带有strepⅱ标签的pfastbac载体上，制得重组pfastbac-vp2质粒。
9.本发明提供一种上述的方法制得的重组pfastbac-vp2质粒。
10.本发明提供一种穿梭载体bacmid的制备方法，将上述重组pfastbac-vp2质粒转化至感受态细胞dh10bac中，在三抗固体lb培养基中涂板，20-30小时后通过蓝白斑筛选获得重组bacmind。
11.作为本发明的进一步改进，所述三抗固体lb培养基包括8-12μg/ml四环素、5-10μ
g/ml庆大霉素、40-60μg/ml卡那霉素、30-50μg/ml iptg和90-110μg/ml xgal。
12.本发明提供一种上述的制备方法制得的穿梭载体bacmid。
13.本发明提供一种真核表达vp2蛋白的制备方法，将上述穿梭载体bacmid接种到三抗lb液体培养基中培养12-20小时，收集菌体提取bacmind，将bacmid转染到sf9细胞中70-75小时收集细胞上清和细胞，反复冻融2-3次，离心，收集上清病毒液pⅰ，将病毒传代培养至pⅱ后，用pⅱ二代毒接种至sf9细胞中悬浮培养大量真核表达vp2蛋白。
14.本发明提供一种上述的制备方法制得的真核表达vp2蛋白。
15.本发明提供一种间接elisa检测方法，包括以下步骤：
16.(1)抗原包被：用ph＝2-4的包被液稀释抗原，包被抗原浓度稀释为3-5μg/ml，加入96孔酶标板中，每孔90-110μl，3-5℃包被10-14小时；
17.(2)洗涤：用pbst洗涤酶标孔，每孔270-320μl，拍干，洗涤5-7次；
18.(3)封闭：酶标孔加5％脱脂乳，每孔加270-320μl，36-38℃封闭2-4h；
19.(4)洗涤：步骤同(2)；
20.(5)孵育血清：用0.8-1.2％ bsa以1：380-420比例稀释血清，加入酶标孔中，每孔加90-110μl，36-38℃孵育1-2h；
21.(6)洗涤：步骤同(2)；
22.(7)酶标二抗反应：用0.8-1.2％ bsa以1：7000-9000比例稀释hrp标记的二抗，加入酶标孔中，每孔加90-110μl，36-38℃孵育40-50min；
23.(8)洗涤：步骤同(2)；
24.(9)显色：将tmb显色液加入酶标孔中，每孔90-110μl；
25.(10)终止：室温显色10-15min后，立即加入终止液终止反应，每孔45-55μl；
26.(11)读数：提前打开酶标仪，设置好参数读取od
450nm
值；
27.(12)判定：根据标准阴性血清od
450nm
值计算阴阳临界值，根据结果判断。
28.作为本发明的进一步改进，所述阴阳临界值＝阴性样品od
450nm
平均值+3
×
标准差，判定方法为：大于阴阳临界值判定为阳性血清。
29.本发明具有如下有益效果：vp2是ibdv的主要结构蛋白和诱导宿主产生中和抗体的保护性抗原。本技术利用真核表达ibdv的vp2蛋白作为包被抗原，经过一系列条件优化建立了检测ibdv血清抗体的间接elisa方法。elisa方法具有操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高、结果易判、可重复和高通量检测等优点。本技术利用真核表达系统可以诱导高效表达，对表达的蛋白进行正确折叠，并进行复杂的蛋白糖基化和磷酸化修饰，蛋白活性接近于天然蛋白，在蛋白经过翻译后可对蛋白进行正确修饰，使表达出来的蛋白更具天然活性而不是被降解或者是形成包涵体。昆虫杆状病毒蛋白表达系统产生的融合蛋白则没有内毒素可省略去内毒素步骤。本发明可用于鸡群ibdv抗体水平检测，判断ibd疫苗的免疫效果从而制定科学免疫程序，掌握鸡群疫情动态情况。
30.本发明采用的昆虫杆状病毒表达系统主要表达vp2蛋白在上清中，杂蛋白极少，通过超滤浓缩置换后几乎检测不到杂蛋白，可根据生产要求简化蛋白纯化步骤节省成本。此外，昆虫杆状病毒表达系统中的蛋白不感染畜禽，因此不用担心因为昆虫杆状病毒表达系统中的蛋白与鸡体内的抗体产生交叉反应从而导致假阳性。本发明建立的elisa方法具有良好的特异性，能提高检测结果准确率。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1为pcr鉴定pfastbac-vp2-strepⅱ图，其中，1-m:分子量标准；1-1：pfastbac-vp2-strepⅱ；1-2：阴性对照。
33.图2为pcr鉴定重组bacmid vp2图；其中，2-m:分子量标准；2-1：阴性对照；2-2重组bacmid-vp2；2-3：bacmid野生型。
34.图3为wb检测sf9细胞上清中的vp2图；其中，3-m:分子量标准；3-1：pⅰ代上清；3-2：pⅱ代上清；3-3：pⅲ代上清；3-4：表达蛋白后收获细胞上清液；3-5：对照sf9细胞上清。
35.图4sds-page检测vp2纯化效果图，其中，4-m:分子量标准；4-1：表达蛋白收获sf9细胞上清；4-2：蛋白纯化流穿液；4-3至4-7：杂蛋白洗脱液；4-8至4-13：vp2蛋白洗脱液；4-14：对照sf9细胞上清液。
36.图5为western blot验证血清vp2抗体图，其中vp2:从sf9上清中纯化的vp2蛋白；c：bacmid空载转染sf9上清对照。
具体实施方式
37.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.试剂配置如下：
39.包被缓冲液(ph3.0 0.05m柠檬酸盐缓冲液):
40.表1
41.试剂用量一水柠檬酸19.53g柠檬酸钠2.058g蒸馏水1000ml
42.洗涤缓冲液(ph7.4 pbst)表2
43.试剂用量kh2po40.2gna2hpo4
·
12h2o2.9gnacl8.0gkcl0.2gtween-200.5ml蒸馏水1000ml
44.封闭液(5％脱脂乳)
45.表3
46.试剂用量脱脂奶粉5g洗涤缓冲液100ml
47.样品(抗体)稀释液(1％bsa)表4
48.试剂用量牛血清白蛋白1g洗涤缓冲液100ml
49.终止液(2m h2so4)的配置方法
50.表5
51.试剂用量浓硫酸22ml水178ml
52.将禽传染性法氏囊病病毒vp2基因克隆构建到昆虫杆状病毒穿梭载体上，在昆虫卵巢细胞(sf9)中表达vp2蛋白，并通过亲和层析技术纯化vp2蛋白。用纯化后的vp2蛋白为包被抗原，摸索优化最佳抗原包被浓度、包被条件、血清稀释度和孵育条件、封闭条件、二抗稀释度和孵育条件、洗涤次数、稀释液的选择等。建立一个灵敏准确的elisa检测vp2抗体方法。
53.具体技术方案：
54.1、传染性法氏囊病病毒vp2蛋白真核表达和纯化：根据ncbi上的传染性法氏囊病病毒lx株vp2基因序列(genbank:jn100111.1)设计带限制性内切酶位ecorⅰ和aatⅱ的特异性引物，上游引物：5
’‑
cggatg gaattc aaatgacaaacct-3’(ecorⅰ)，下游引物：5
’‑
gtctgg gacgtc ccttatggcccg-3’(aatⅱ)以感染过ibdv病毒的df-1细胞裂解液提取的cdna为模板pcr扩增vp2基因的开放阅读框(orf)，长度为1356bp，将该基因37℃双酶切2小时后回收酶切产物，再连接到pfastbac载体中，该载体酶切位点后插入strepⅱ标签，确保插入vp2基因c端连接有strepⅱ标签(图1)，以便于蛋白纯化。后将重组pfastbac载体转化至大肠杆菌dh10bac中，通过蓝白斑筛选鉴定挑取阳性菌落，通过通用引物m13用pcr方法鉴定阳性菌落(图2)，将阳性菌接种至含三种抗生素的细菌培养基(含卡那霉素、四环菌素和庆大霉素的lb培养基)中培养，从细菌中提取穿梭载体bacmid，将bacmid转染至sf9细胞中96小时收取病毒。通过蛋白质免疫印迹(wb)实验验证传染性法氏囊病病毒vp2是否表达(图3)，然后将病毒在sf9细胞中传代繁殖，用第二代病毒或第三代病毒大量表达蛋白，利用strepⅱ标签使用亲和层析纯化方法将蛋白纯化，得到纯化的vp2蛋白(图4)。
55.2、间接elisa检测vp2抗体方法的建立：按照常规间接elisa方法进行操作，每优化一个条件时需固定其他反应条件不变。当条件1的最优状态已确定，在优化条件2时，条件1的维持最优状态不变，其他条件仍固定，以此类推，直到所有的条件优化完毕。每完成一次条件优化，需对得到的数据进行处理，综合考虑p/n值(p/n值＝阳性对照od
450
均值/阴性对照od
450
均值，通常以p/n值最大，且p值接近1，n值较小作为最佳反应条件的判定依据)确定最佳反应条件。
56.2.1、抗原包被浓度和血清稀释度优化：用包被液(ph9.6的0.05m磷酸盐缓冲液)将
vp2蛋白抗原稀释成0.5，1，2，4和8μg/ml，每孔100μl，4℃包被12小时，用pbst洗涤3遍(后续洗涤方法都如此)，每孔加5％脱脂乳(pbst稀释)，300μl/孔，4℃封闭12小时后洗涤，阴性血清和阳性血清分别用pbs作1：25，1：50，1：100，1：200，1：400，1：800和1：1600稀释，以棋盘法布局加样，每孔100μl，37℃孵育1小时后洗涤。用pbs以1：4000稀释hrp(辣根过氧化物酶)标记兔抗鸡igy抗体，每孔100μl，37℃孵育1小时后洗涤，加入显色液tmb室温显色10分钟后用2m h2so4终止，每孔100μl。在酶标仪上读取od
450
吸光值，根据判定条件确定最佳包被浓度和匹配的血清稀释度。
57.表6最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定
[0058][0059]
表7最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定
[0060][0061]
2.2、包被液的优化：分别以0.05m甘氨酸-盐酸(ph2.8)、0.05m柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph3.0)、0.05m柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph4.0)、0.05m柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph5.0)、0.05m磷酸盐缓冲液(ph6.0)、0.05m磷酸盐缓冲液(ph7.0)、0.05m磷酸盐缓冲液
(ph8.0)、0.05m碳酸盐缓冲液(ph9.6)和0.05m碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液(ph10.0)为包被液，其他反应条件不变，在酶标仪上读取od
450
吸光值，根据判定条件确定最佳包被液。
[0062]
表8最佳包被液的确定
[0063][0064]
2.3、包被条件优化：分别以4℃包被12小时、室温包被12小时和37℃包被2小时的包被条件包被抗原，采用已优化的最佳反应条件，在酶标仪上读取od
450
吸光值，根据判定条件确定最佳包被液。
[0065]
表9最佳包被条件的确定
[0066][0067]
2.4、封闭液优化：采用已优化的最佳反应条件，分别以1％酪蛋白、1％明胶、2％bsa、5％脱脂乳和5％脱脂乳+1％酪蛋白作为封闭液，在37℃的条件下封闭2小时，在酶标仪上读取od
450
吸光值，根据判定条件确定最佳封闭液。
[0068]
表10最佳封闭液的确定
[0069][0070]
2.5、封闭条件优化：采用已优化的最佳反应条件，分别以4℃封闭12小时、37℃封闭1小时、37℃封闭2小时和37℃封闭3小时为封闭条件，在酶标仪上读取od
450
吸光值，根据判定条件确定最佳封闭条件。
[0071]
表11最佳封闭条件的确定
[0072][0073][0074]
2.6、血清孵育时间优化：采用已优化的最佳反应条件，分别将血清在37℃条件下孵育0.5h、1h、1.5h和2h，在酶标仪上读取od450吸光值，根据判定条件确定最佳血清孵育时间条件。
[0075]
表12最佳封闭条件的确定
[0076][0077]
2.7、hrp标记二抗稀释度和孵育条件优化：采用已优化的最佳反应条件，分别用pbs以1：2000、1：4000、1：8000和1：16000的稀释度稀释hrp标记二抗(2mg/ml兔抗鸡igy抗体)，以棋盘法设置孵育时间分别为37℃30分钟、45分钟和60分钟。在酶标仪上读取od
450
吸光值，根据判定条件确定最二抗稀释度和孵育条件。
[0078]
表13最佳二抗稀释度和孵育条件的确定
[0079][0080]
2.8、血清和二抗稀释液优化：采用已优化的最佳反应条件，分别用5％脱脂乳、2.5％脱脂乳、1.25％脱脂乳、pbs和1％bsa稀释血清和二抗，在酶标仪上读取od
450
吸光值，根据判定条件确定最佳稀释液。
[0081]
表14最佳稀释液的确定
[0082][0083][0084]
2.9、洗涤次数优化：采用以优化的最佳反应条件，分别以3、4、6、8次洗涤方法完成每一步中间的洗涤步骤，在酶标仪上读取od
450
吸光值，根据判定条件确定最佳洗涤次数。
[0085]
表15最佳洗涤次数的确定
[0086][0087]
2.10、最终确定的间接elisa检测方法的最优条件操作方法
[0088]
(1)抗原包被：用ph3.0的包被液稀释抗原，包被抗原浓度稀释为4μg/ml，加入96孔酶标板中，每孔100μl，4℃包被12小时。
[0089]
(2)洗涤：用pbst洗涤酶标孔，每孔300μl，拍干，洗涤6次。
[0090]
(3)封闭：酶标孔加5％脱脂乳，每孔加300μl，37℃封闭3小时。
[0091]
(4)洗涤：步骤同(2)。
[0092]
(5)孵育血清：用1％bsa以1：400比例稀释血清，加入酶标孔中，每孔加100μl，37℃孵育1.5小时。
[0093]
(6)洗涤：步骤同(2)。
[0094]
(7)酶标二抗反应：用1％bsa以1：8000比例稀释hrp标记的二抗，加入酶标孔中，每孔加100μl，37℃孵育45分钟。
[0095]
(8)洗涤：步骤同(2)。
[0096]
(9)显色：将tmb显色液加入酶标孔中，每孔100μl。
[0097]
(10)终止：室温显色12分钟后，立即加入终止液终止反应，每孔50μl。
[0098]
(11)读数：提前5分钟打开酶标仪，设置好参数读取od
450nm
值。
[0099]
3、特异性：用已优化的vp2抗体间接elisa检测方法检测由spf鸡感染病原制备的单一病原感染血清，包括鸡传染性支气管炎(ib)、鸡新城疫(nd)、禽流感(ai)、鸡传染性贫血病(cia)和鸡白痢(pd)，设置spf鸡阴性血清和鸡传染性法氏囊病阳性血清作为对照。根据样品od
450
平均值与阴性临界值比对判定阴阳性，以检测本检验方法的特异性。
[0100]
表16自建传染性法氏囊病病毒vp2抗体elisa方法检测其它禽病阳性血清
[0101][0102][0103]
阴阳临界值＝阴性样品od
450nm
平均值+3
×
sd(标准差)＝0.1075，根据阴阳临界值判断，大于0.1075为传染性法氏囊病vp2抗体阳性，本elisa方法检测其他病原血清都为阴性，证明该方法特异性良好。
[0104]
4、批内重复性：随机抽取3条酶标反应条，用已优化的vp2抗体间接elisa检测方法检测同一份阳性血清或阴性血清，分别计算阳性样品和阴性样品各个孔间的标准差和变异系数。
[0105]
表17自建传染性法氏囊病病毒vp2抗体elisa方法批内重复性
[0106][0107]
从表中可知，阴性和阳性样品变异系数都小于10％，说明本方法重复性良好。
[0108]
5、批间重复性：利用已优化的vp2抗体间接elisa检测方法连续三天分别对同一份阴性血清(n)和阳性血清(p)平行测定8次，计算每天样本od
450nm
的平均值，标准差和变异系数，以确定建立的间接elisa方法稳定性是否良好。
[0109]
表18自建传染性法氏囊病病毒vp2抗体elisa方法批间重复性
[0110][0111]
从表中数据可知，连续三天测定的阴性样品和阳性样品的变异系数都小于10％，
说明建立的间接elisa方法重复性良好。
[0112]
5、符合性：利用建立的间接elisa检测来自北京某鸡场的份血清样本，同时利用美国idexx公司的ibdv vp2抗体检测试剂盒对同批样品进行检测，对比两者检测结果。
[0113]
表19自建传染性法氏囊病病毒vp2抗体elisa方法与idexx试剂盒检测符合率
[0114][0115][0116]
对于两种检测方法结果不一致的5份血清样品用非变性western blot进一步进行验证，结果见图5。根据结果可知，五份idexx试剂盒检测为阴性，本文建立方法检测为阳性的血清中，有一份是阳性，与本文建立检测方法检测结果一致。四份血清为阴性，与idexx试剂盒检测结果一致。本文建立的检测方法与idexx试剂盒检测能力接近，可用于临床检测。
[0117]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种带酶切位点的特异性引物扩增vp2基因，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。2.一种重组pfastbac-vp2质粒的制备方法，其特征在于，从ibdv病毒中提取rna，反转录为cdna后，用权利要求1所述带酶切位点的特异性引物扩增vp2基因，并通过双酶切连接到带有strepⅱ标签的pfastbac载体上，制得重组pfastbac-vp2质粒。3.如权利要求2所述的方法制得的重组pfastbac-vp2质粒。4.一种穿梭载体bacmid的制备方法，其特征在于，将权利要求3所述重组pfastbac-vp2质粒转化至感受态细胞dh10bac中，在三抗固体lb培养基中涂板，20-30小时后通过蓝白斑筛选获得重组bacmind。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述三抗固体lb培养基包括8-12μg/ml四环素、5-10μg/ml庆大霉素、40-60μg/ml卡那霉素、30-50μg/ml iptg和90-110μg/ml xgal。6.一种如权利要求4或5所述的制备方法制得的穿梭载体bacmid。7.一种真核表达vp2蛋白的制备方法，其特征在于，将权利要求6中的穿梭载体bacmid接种到三抗lb液体培养基中培养12-20小时，收集菌体提取bacmind，将bacmid转染到sf9细胞中70-75小时收集细胞上清和细胞，反复冻融2-3次，离心，收集上清病毒液pⅰ，将病毒传代培养至pⅱ后，用pⅱ二代毒接种至sf9细胞中悬浮培养大量真核表达vp2蛋白。8.一种如权利要求7所述的制备方法制得的真核表达vp2蛋白。9.一种间接elisa检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)抗原包被：用ph＝2-4的包被液稀释抗原，包被抗原浓度稀释为3-5μg/ml，加入96孔酶标板中，每孔90-110μl，3-5℃包被10-14小时；(2)洗涤：用pbst洗涤酶标孔，每孔270-320μl，拍干，洗涤5-7次；(3)封闭：酶标孔加5％脱脂乳，每孔加270-320μl，36-38℃封闭2-4h；(4)洗涤：步骤同(2)；(5)孵育血清：用0.8-1.2％bsa以1：380-420比例稀释血清，加入酶标孔中，每孔加90-110μl，36-38℃孵育1-2h；(6)洗涤：步骤同(2)；(7)酶标二抗反应：用0.8-1.2％bsa以1：7000-9000比例稀释hrp标记的二抗，加入酶标孔中，每孔加90-110μl，36-38℃孵育40-50min；(8)洗涤：步骤同(2)；(9)显色：将tmb显色液加入酶标孔中，每孔90-110μl；(10)终止：室温显色10-15min后，立即加入终止液终止反应，每孔45-55μl；(11)读数：提前打开酶标仪，设置好参数读取od
450nm
值；(12)判定：根据标准阴性血清od
450nm
值计算阴阳临界值，根据结果判断。10.根据权利要求9所述间接elisa检测方法，其特征在于，所述阴阳临界值＝阴性样品od
450nm
平均值+3
×
标准差，判定方法为：大于阴阳临界值判定为阳性血清。

技术总结
本发明提出了鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白重组载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。从IBDV病毒中提取RNA，反转录为cDNA后，用带酶切位点的特异性引物扩增vp2基因，并通过双酶切连接到带有StrepⅡ标签的pFastbac载体上，制得重组pFastbac-vp2质粒，转化至感受态细胞DH10Bac中，涂板，通过蓝白斑筛选获得重组Bacmind，培养，收集菌体提取，转染到SF9细胞中收集细胞上清和细胞，反复冻融，离心，收集上清病毒液PⅠ，将病毒传代培养至PⅡ后，用PⅡ二代毒接种至SF9细胞中悬浮培养真核表达VP2蛋白。本发明建立的法具有良好的特异性，能提高检测结果准确率。高检测结果准确率。高检测结果准确率。


技术研发人员：郑世军 王永强 王红暖 高丽 李晓齐 曹红
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/9/23