用于抗草甘膦除草剂基因的叶绿体转运肽及其应用

1.本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种用于抗草甘膦除草剂基因的叶绿体转运肽；还涉及含有该叶绿体转运肽的融合基因和融合蛋白，以及它们的用途。


背景技术：

2.草甘膦是美国孟山都公司生产的除草剂农达(roundup)的主要活性成分，具有高效、广谱、低毒、易于被微生物分解等优点。草甘膦作为一种内吸传导型除草剂，喷洒于植物茎叶后，即可被植物吸收，并可迅速传导到整个植株及其根部，从而消灭杂草。然而草甘膦作为一种非选择性除草剂，在杀灭杂草的同时，对农作物同样具有灭生性，因而其使用范围和使用时间受到很大限制。
3.5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)是植物体内莽草酸途径的关键酶，同时是草甘膦的作用靶点，通过导入对草甘膦不敏感的epsps基因或在转基因植物中过表达epsps基因可以有效地提高植株的草甘膦耐受性。随着抗草甘膦epsps基因的不断发现，通过转基因技术将抗草甘膦epsps基因转化到作物中从而获得抗草甘膦除草剂的作物，已成为解决草甘膦除草剂非选择性问题的有效手段。目前已经应用于棉花中的抗草甘膦除草剂基因主要有美国孟山都公司的cp4-epsps基因和中国农业科学院生物技术研究所的gr79-epsps基因(zl2014102047036)。
4.epsps在植物细胞中定位于叶绿体，因此，除了epsps抗除草剂基因本身之外，还需要具有高效率靶向作用的叶绿体转运肽(chloroplast transpit peptide，简称ctp，亦称叶绿体导肽或前导肽等)，进一步将epsps酶转运至叶绿体内发挥作用。故叶绿体转运肽对epsps在叶绿体中能否有效发挥作用至关重要。
5.目前商业化的抗草甘膦除草剂转基因棉花(美国孟山都公司)主要是利用来源于拟南芥epsps基因的叶绿体转运肽atctp和来源于农杆菌的cp4epsps基因融合并将其导入棉花获得。由于该叶绿体转运肽atctp来源于拟南芥，属于异源基因，在棉花中表达后转运功能低于自身内部叶绿体转运肽的转运效率。因此，如果利用棉花自身的叶绿体转运肽和抗除草剂基因融合并导入棉花，可以大大提高将抗草甘膦除草剂epsps蛋白转运至棉花叶绿体中的效率，从而提高转基因棉花对草甘膦除草剂的抗性。
6.目前，尚未发现有关用于转运抗草甘膦除草剂蛋白的棉花叶绿体转运肽的报道。


技术实现要素：

7.本发明目的在于提供一种叶绿体转运肽。
8.本发明另一目的在于提供编码上述叶绿体转运肽的基因。
9.本发明第三目的在于提供含有上述叶绿体转运肽基因的融合基因。
10.本发明第四目的在于提供上述融合基因编码的融合蛋白。
11.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
12.一种叶绿体转运肽，所述叶绿体转运肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。
13.本发明还提供编码上述叶绿体转运肽的基因，命名为：ghctp1，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
14.本发明还提供了上述叶绿体转运肽或基因在转运抗草甘膦除草剂蛋白上的应用。
15.上述应用中所述的抗草甘膦除草剂蛋白是指cp4 epsps蛋白或gr79epsps蛋白等。
16.本发明还提供了上述叶绿体转运肽或基因在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。
17.所述的植物是指棉花、油菜或大豆等。
18.所述的棉花是指陆地棉(gossypium hirsutum linn.)或海岛棉(gossypium barbadense linn.),如r15、wc、su12等棉花品系。
19.本发明还提供了含有上述基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组细菌等。
20.本发明还提供了上述表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组细菌等在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。
21.所述的植物是指棉花、油菜或大豆等。
22.所述的棉花是指陆地棉(gossypium hirsutum linn.)或海岛棉(gossypium barbadense linn.),如r15、wc、su12等棉花品系。
23.本发明还提供一种融合基因，所述的融合基因由上述叶绿体转运肽基因和抗草甘膦除草剂基因组成；所述叶绿体转运肽基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
24.上述融合基因中所述的抗草甘膦除草剂基因是指gr79 epsps基因或cp4 epsps基因等。
25.所述的gr79 epsps基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
26.所述的融合基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。
27.本发明还提供了上述融合基因编码的融合蛋白，所述的融合蛋白由上述叶绿体转运肽和抗草甘膦除草剂蛋白组成。
28.上述融合蛋白中所述的叶绿体转运肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。
29.上述融合蛋白中所述的抗草甘膦除草剂蛋白是指gr79 epsps蛋白或cp4 epsps蛋白等。
30.所述gr79 epsps蛋白的氨基酸序列如seq id no.7所示。
31.所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.8所示。
32.上述融合基因或融合蛋白在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。
33.所述的植物是指棉花、油菜或大豆等。
34.所述的棉花是指陆地棉(gossypium hirsutum linn.)和海岛棉(gossypium barbadense linn.),如r15、wc、su12等棉花品系。
35.本发明还提供含有上述融合基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组细菌等。
36.所述的表达盒由包括camv 35s启动子、nos终止子和上述融合基因。
37.所述的表达载体是指将上述表达盒连接于pbi121载体上即可获得抗除草剂植物表达载体pbi121-ghctp1-gr79 epsps。
38.上述表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组细菌等在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。
39.所述的植物是指棉花、油菜或大豆等。
40.所述的棉花是指陆地棉(gossypium hirsutum linn.)和海岛棉(gossypium barbadense linn.)；如r15、wc或su12等棉花品系。
41.本发明还提供了一种培育耐草甘膦除草剂棉花品种的培育方法，通过转基因方法将上述含有叶绿体转运肽和gr79 epsps的融合基因导入棉花，然后筛选对草甘膦除草剂具有耐性的后代。
42.本发明还提供了一种提高棉花耐草甘膦除草剂能力的方法，包括通过转基因方法将含有叶绿体转运肽和gr79 epsps融合基因的植物表达载体导入棉花，筛选耐草甘膦除草剂的转基因后代材料。
43.上述方法所述的植物表达载体中叶绿体转运肽的核苷酸序列如seq id no.2所示。
44.本发明还提供一种利用上述叶绿体转运肽培育抗草甘膦除草剂的棉花品种的方法，包括如下步骤：
45.(1)叶绿体转运肽序列人工合成：根据seq id no.2所示人工合成ghctp1基因的核苷酸序列；然后在seq id no.2所示序列的5’端和3’端分别添加bamhi酶切位点和pst i酶切位点，分别获得seq id no.3所示的正义链和seq id no.4所示的反义链；将seq id no.3所示的正义链和seq id no.4所示的反义链在水浴锅中退火形成获得含有粘性末端的叶绿体转运肽双链dna片段；
46.(2)植物表达载体构建：利用bamh i和pst i双酶切pbi121植物表达载体；通过t4 dna连接酶将步骤(1)中的叶绿体转运肽双链dna片段(ghctp1序列)插入至pbi121植物表达载体的camv 35s启动子和t-nos终止子之间，获得pbi121-ghctp1载体；然后利用pst i和xho i双酶切将gr79 epsps基因插入至pbi121-ghctp1载体中的ghctp1和t-nos终止子之间，获得抗草甘膦除草剂的植物表达载体，命名为：pbi121-ghctp1-gr79 epsps；
47.(3)转基因抗除草剂棉花创制：将步骤(2)所得的植物表达载体导入农杆菌，然后利用农杆菌介导的棉花遗传转化方法将植物表达载体导入棉花，获得含有ghctp1和gr79 epsps融合基因的转基因棉花；
48.(4)对步骤(3)中所得的转基因植株进行分子鉴定和草甘膦除草剂抗性鉴定，选择耐草甘膦除草剂的棉花植株。
49.本发明还提供了一种耐除草剂棉花品种的育种方法，包括以上述方法获得的耐草甘膦除草剂转基因棉花为亲本之一，通过杂交或者回交的方法，在后代中选择耐除草剂能力强的植株，连续选择4～5代或回交4～5代即可获得耐草甘膦除草剂棉花品种。
50.与现有技术相比，本发明具有的优点和有益技术效果：本发明叶绿体转运肽ghctp1转运效率高，并且可以与任何一种除草剂epsps基因融合表达，增强棉花等植物对草甘膦除草剂的耐受性。本发明对棉花等植物生产过程中降低杂草危害、减少人工除草投入、降低生产成本和提高产量具有重要意义。
附图说明
51.图1.pbi121-ghctp1-gr79 epsps表达载体示意图。
52.图2.转基因棉花t0代植株pcr鉴定ghctp1-gr79 epsps融合基因电泳图谱；其中m为dna标准分子量；
“‑”
为阴性对照；1～7分别为转基因单株材料g1、g2、g5、g6、g7、g9和g10。
53.图3.转基因棉花植株的草甘膦除草剂耐受能力鉴定对比照片；其中1为野生型材料wc；2为转基因材料g2的t1代的一个单株。
具体实施方式
54.如无特殊说明，以下实施例中所使用的实验方法均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
55.本发明叶绿体转运肽的发现过程：植物epsps酶是植物芳香族氨基酸合成的关键蛋白，其通过自身的叶绿体转运肽转运至叶绿体内。因此，通过棉花epsps基因有可能分离来源于该基因的叶绿体转运肽。本发明人参考陆地棉tm-1基因组序列中的epsps基因设计引物，以陆地棉品系su12叶片cdna为模板进行pcr扩增，获得su12棉花品系中epsps基因5’端cdna序列，将该序列编码的氨基酸序列在signalip-6.0软件进行预测，结果发现有一个70个氨基酸组成的信号肽，同时参考拟南芥atepsps基因的ctp序列，将棉花epsps基因叶绿体转运肽的蛋白序列确定为73个氨基酸(见序列表seq id no.1)；其编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，并将该基因命名为：ghctp1。
56.实施例1含有叶绿体转运肽ghctp1和gr79 epsps基因的表达载体的构建
57.按照如下方法进行：
58.(1)叶绿体转运肽序列人工合成：根据seq id no.2所示人工合成ghctp1基因的核苷酸序列；然后在seq id no.2所示序列的5’端和3’端分别添加bamh i酶切位点和pst i酶切位点，分别获得seq id no.3所示的正义链和seq id no.4所示的反义链；
59.(2)根据seq id no.3和seq id no.4所示的核苷酸序列，由生物工程(上海)股份有限公司合成单链dna，然后在水浴锅中退火形成双链dna片段。退火方法如下：将seq id no.3和seq id no.4合成产物利用超纯水溶解至30μm，各取10μl放置于一个1.5ml离心管内充分混匀，随即放入98℃水浴锅内加热2min，然后自然冷却至室温，最后获得含有粘性末端的叶绿体转运肽双链dna片段。
60.(3)利用bamh i和pst i双酶切pbi121植物表达载体，将步骤(2)所得的叶绿体转运肽双链dna片段插入至pbi121植物表达载体camv 35s启动子和t-nos终止子之间，获得pbi121-ghctp1载体。其反应体系为：叶绿体转运肽双链dna片段1μl(5ng)，双酶切的pbi121载体1μl(10ng)，t4 dna连接酶(neb)1μl，t4 dna连接酶buffer1μl，ddh2o 6μl。16℃连接过夜之后将连接产物转化大肠杆菌，筛选获得正确pbi121-ghctp1载体。
61.(3)利用pst i和xhoi双酶切pbi121-ghctp1载体和gr79 epsps基因(zl2014102047036，序列见seq id no.5所示)，将gr79 epsps基因插入至pbi121-ghctp1植物表达载体的叶绿体转运肽ghctp1和t-nos终止子之间，获得含有ghctp1和gr79 epsps融合基因(见seq id no.6)的植物表达载体(见图1)，将其命名为：pbi121-ghctp1-gr79 epsps。其中反应体系为：gr79 epsps基因双链dna片段1μl(5ng)，双酶切的pbi121-ghctp1载体1μl(10ng)，t4 dna连接酶(neb)1μl，t4 dna连接酶buffer1μl，ddh2o 6μl。16℃连接过夜之后将连接产物转化大肠杆菌，测序筛选获得正确pbi121-ghctp1-gr79 epsps表达载体。
62.实施例2利用本发明含有ghctp1的融合基因获得耐草甘膦除草剂转基因棉花试验
63.按照如下方法进行：
64.(1)植物表达载体pbi121-ghctp1-gr79 epsps转化农杆菌
65.将实施例1中所得的pbi121-ghctp1-gr79 epsps表达载体2～5μg与100μl农杆菌感受态细胞gv3101混匀，置于冰上5min；然后将混合液加入2mm电击杯，2500v电击，电击后迅速加入800μl lb液体培养基并转移至1.5ml离心管内，在28℃、180rpm条件下活化培养5h。取出100ul菌液涂布于含有卡那霉素和利福平(浓度均为50μg/ml)的lb固体培养基平板上，在28℃培养48h。随机挑取5个抗性克隆子，送交生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证，选取表达载体序列正确的一个克隆子，保存备用。
66.(2)农杆菌介导棉花遗传转化以及转基因植株的获得
67.以陆地棉品系wc(山西省农业科学院棉花研究所提供)为受体，利用步骤(1)获得的农杆菌侵染棉花下胚轴，之后通过组织培养获得转基因植株，具体步骤如下：
68.(a)无菌苗准备：用70％乙醇表面消毒种子30s，利用30％ h2o2浸泡消毒2h，然后用无菌蒸馏水冲洗三次，去掉种子表面残留的h2o2。将消毒后的种子在的无菌水中28℃浸泡过夜，待种子萌动露白后去除种皮，播种于1/2murashige&skoog(ms)培养基上。播种后的种子在28℃、黑暗条件下培养4天，然后在16小时光照/8小时黑暗条件下培养2天左右，切下幼苗下胚轴并分割为0.5cm长度，用于愈伤组织诱导的外植体。
69.(b)遗传转化及再生植株获得：将含有pbi121-ghctp1-gr79 epsps基因表达载体的农杆菌接种于100ml的lb液体培养基(含有50mg/l的卡那霉素和利福平)，在28℃、250rpm的条件下培养8～10h。接着在4000rpm转速离心10分钟，收集培养好的农杆菌细胞，利用ms液体培养基重新悬浮农杆菌细胞至od
600
为0.4，将步骤(a)分割好的外植体在重悬液中浸泡30分钟。随后，感染的外植体在无菌滤纸上干燥，并转移到共培养培养基(含有0.05mg/l kt、2.5mg/l 2,4-d的msb5固体培养基)，在24℃、避光条件下共培养2天。将侵染后的外植体转移至cim愈伤诱导培养基(含有100mg/l卡那霉素、500mg/l头孢霉素、0.05mg/l kt、2.5mg/l 2,4-d的msb5固体培养基)，在28℃、16小时光照/8小时黑暗条件下培养2～3个月诱导愈伤细胞。
70.选择生长活跃的愈伤细胞，转移到eim胚胎诱导培养基(含有100mg/l卡那霉素、500mg/l头孢霉素的msb5固体培养基)，在28℃、16小时光照/8小时黑暗条件下培养培养2～3月。之后将愈伤细胞中绿色健康愈伤组织转移到不含卡那霉素的eim上，诱导胚胎发育形成幼芽。挑选外观发育正常的幼芽，转移至含有200mg/l iaa的ms培养基中，在28℃、16小时光照/8小时黑暗条件下培养诱导生根，最终发育成为转基因再生植株。
71.(3)转基因植株pcr鉴定
72.将获得的转基因植株移栽于大田，分别提取每个植株的基因组dna，然后以根据ghctp1和gr79 epsps的融合基因序列设计的特异引物ghctp1-gr79-fp和ghctp1-gr79-rp为引物进行pcr扩增；所述的引物为：
73.ghctp1-gr79-fp：5
’‑
ggatccatggcaacgcagtttggc-3’(seq id no.9)；
74.ghctp1-gr79-rp：5
’‑
gttgcttgttggggtgaccagggc-3’(seq id no.10)。
75.结果(见图2)pcr产物大小为309bp。最终获得了7个阳性t0代植株，将其分别命名为：g1、g2、g5、g6、g7、g9和g10。
76.实施例3本发明转基因棉花耐草甘膦除草剂能力鉴定
77.按照如下方法进行：
78.(1)将实施例2中所得的7个阳性t0代植株移栽至大田培养，同时喷施2倍于生产浓度(4mg/l)农达牌(roundup)草甘膦除草剂，最终在命名为g2的t0代植株中获得一个生长没有受到抑制、产量和对照没有差异的单株，收获得g2的t1代棉花种子。
79.(2)将g2的t1代棉花种子播种于营养钵中培养幼苗，共计获得50株t1代幼苗。待棉花幼苗长至3片真叶时，喷施农达牌(roundup)草甘膦除草剂，所使用的草甘膦除草剂浓度约为2mg/l。喷施5天后观察幼苗表型。
80.结果(见图3)来源于g2的50个t1代转基因植株均生长正常，而野生型受体wc植株干枯死亡。说明本发明棉花叶绿体转运肽ghctp1的转运效率高，可高效率地将抗草甘膦除草剂gr79 epsps蛋白转运至叶绿体内，所得转基因植株抗草甘膦除草剂能力强；同时说明本发明叶绿体转运肽ghctp1转运的抗草甘膦除草剂gr79 epsps蛋白可在叶绿体内高效表达，其获得的转基因植株抗草甘膦除草剂能力强。说明通过转基因技术培育耐除草剂新品种具有巨大的潜在应用价值。

技术特征：
1.一种叶绿体转运肽，其特征在于，所述叶绿体转运肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.编码权利要求1所述叶绿体转运肽的基因，命名为：ghctp1，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.权利要求1所述的叶绿体转运肽或权利要求2所述的基因在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。4.含有权利要求2所述基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组细菌等。5.权利要求4所述的表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组细菌在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。6.一种融合基因，其特征在于，所述的融合基因由权利要求2所述的叶绿体转运肽基因和抗草甘膦除草剂基因组成；所述的叶绿体转运肽基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述的抗草甘膦除草剂基因是指gr79epsps基因或cp4 epsps基因等。7.根据权利要求6所述的融合基因，其特征在于，所述的融合基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。8.权利要求6所述融合基因在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。9.根据权利要求3、5或8所述应用，其特征在于，所述的植物是指棉花、油菜或大豆等。10.一种利用权利要求1所述的叶绿体转运肽培育抗草甘膦除草剂的棉花品种的方法，包括如下步骤：(1)叶绿体转运肽序列人工合成：根据seq id no.2所示人工合成ghctp1基因的核苷酸序列；然后在seq id no.2所示序列的5’端和3’端分别添加bamh i酶切位点和pst i酶切位点，分别获得seq id no.3所示的正义链和seq id no.4所示的反义链；将seq id no.3所示的正义链和seq id no.4所示的反义链在水浴锅中退火形成获得含有粘性末端的叶绿体转运肽双链dna片段；(2)植物表达载体构建：利用bamh i和pst i双酶切pbi121植物表达载体；通过t4 dna连接酶将步骤(1)中的叶绿体转运肽双链dna片段(ghctp1序列)插入至pbi121植物表达载体的camv 35s启动子和t-nos终止子之间，获得pbi121-ghctp1载体；然后利用pst i和xho i双酶切将gr79 epsps基因插入至pbi121-ghctp1载体中的ghctp1和t-nos终止子之间，获得抗草甘膦除草剂的植物表达载体，命名为：pbi121-ghctp1-gr79 epsps；(3)转基因抗除草剂棉花创制：将步骤(2)所得的植物表达载体导入农杆菌，然后利用农杆菌介导的棉花遗传转化方法将植物表达载体导入棉花，获得含有ghctp1和gr79 epsps融合基因的转基因棉花；(4)对步骤(3)中所得的转基因植株进行分子鉴定和草甘膦除草剂抗性鉴定，选择耐草甘膦除草剂的棉花植株。

技术总结
本发明属于植物生物技术领域，具体公开了一种棉花叶绿体转运肽及其编码基因GhCTP1，以及它们在培育抗草甘膦除草剂植物上的用途。本发明还公开了由GhCTP1和抗草甘膦除草剂基因组成的融合基因，以及其编码的融合蛋白。本发明叶绿体转运肽GhCTP1转运效率高，并且可以与任何一种除草剂EPSPS基因融合表达，增强棉花等植物对草甘膦除草剂的耐受性。本发明对棉花等植物生产过程中降低杂草危害、减少人工除草投入、降低生产成本和提高产量具有重要意义。降低生产成本和提高产量具有重要意义。


技术研发人员：孟志刚 梁成真
受保护的技术使用者：中国农业科学院生物技术研究所
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/9/23