一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法及其应用与流程

1.本发明属于医药与食品检测技术领域，具体涉及一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法及其应用。


背景技术：

2.核桃具有包括抗氧化、抗炎、预防癌症和心血管疾病的多种生物活性。核桃蛋白质因其含有所有必需氨基酸被认为是优质蛋白质。然而，核桃蛋白质较差的溶解度限制了它们在功能性食品中的应用。与完整核桃蛋白相比，核桃蛋白的水解产物和/或核桃肽具有更好的水溶性和功能特性，例如具有低粘度、良好的发泡和乳化特性，同时还具有各种生物活性，例如抗氧化、抗肿瘤、抗高血压、抗病毒、抑制乙酰胆碱酯酶、免疫调节、保护心血管和神经等作用。所以核桃肽是一种很有前途的功能性食品成分来源。目前衍生自核桃蛋白的有效肽段氨基酸序列已有报道，并在脱脂核桃粉水解产物中发现了可能是核桃粉水解产物改善学习和记忆效果以及抗氧化的原因的序列fy、alped等生物活性肽。
3.近年来，核桃肽产品层出不穷，但目前核桃肽的检测仅仅依靠蛋白质含量测定、pcr检测和液相色谱法测定总肽含量，这些方法均存在准确度低，检测周期长，操作复杂，灵敏度低等缺点，市场上核桃肽产品的品质评价缺乏有效的检测方法，对评价核桃肽产品质量带来较大的阻碍。因此，发明一种快速、高效、高灵敏度的检测方法是有必要的。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法及其应用，本发明可大大提高核桃肽中特征肽段的检测效率和准确度。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
6.一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，包含如下步骤：
7.s1供试品溶液制备：分别精密称取不同厂家的核桃肽样品100mg，加入10ml 0.1％ tfa三氟乙酸水溶液，超声溶解；将溶解在0.1％ tfa三氟乙酸水中的核桃肽溶液上样至预处理后的c18ye spe柱中；用0.1％ tfa三氟乙酸水溶液淋洗除杂，然后用80％ can乙腈溶液洗脱，收集洗脱液进行uplc-qtof/ms质谱分析；
8.s2利用uplc-qtof/ms质谱技术对不同厂家的核桃肽产品进行液相色谱-质谱检测，得到的质谱数据利用peaks studio11软件解析质谱数据，鉴定样品中的多肽序列并筛选出不同厂家核桃肽的共有肽段；
9.s3使用peaks studio11软件的de novo和db search模块对质谱数据进行解析，共发现263个核桃肽共有肽段，最终选定氨基酸序列为fy和alped这两个具有神经保护，提高学习效率和记忆力功能的核桃特征肽段；
10.s4通过氨基酸序列为fy和alped判断市场上其他核桃肽产品的多肽指纹图谱是否含有核桃肽特征肽段的离子信号及响应高低。
11.优选的，s1中can乙腈溶液含0.1％tfa三氟乙酸。
12.优选的，s2中液质分析时采用的色谱柱为hss t3，流速0.3ml/min，以0.1％甲酸-水溶液为流动相a，0.1％甲酸-乙腈溶液为流动相b进行梯度洗脱；洗脱程序为：0-2min，100％a；2-15min，100％-90％a；15-22min，90％-70％a；22-22.1min，70％-100％a，22.1-24min，100％a；图谱采集时间为24min；质谱条件：esi离子源，正离子模式；ida扫描模式；气帘气：35psi；gas1：45psi；gas2：45psi；温度：500℃；离子化压力：4500v；去簇电压：60v；全扫描范围：m/z 50～2000da；裂解电压：5v；cespread：0v。
13.优选的，s3中peaks studio11软件对质谱数据解析时，db search蛋白数据库来源为uniprot蛋白数据库的juglans regia物种，de novo解析参数为parent mass error tolerance 10.0ppm，fragment mass error tolerance0.1da；db search解析参数为parent mass error tolerance 10.0ppm，fragment mass error tolerance 0.1da，max missed cleavages 100，分析质谱数据。
14.优选的，使用一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法判断核桃肽产品的多肽指纹图谱是否含有核桃肽特征肽段的离子信号及响应高低：若含有且氨基酸序列fy和alped含量较高，则说明产品品质较好，若不含有或fy和alped含量较低则说明该产品品质不佳。
15.本发明的有益效果：(1)本发明公开了一种基于特征肽段评价核桃肽的液相色谱-质谱联用方法及其应用，利用核桃肽中的fy及alped两个特征肽段评价核桃肽的产品品质；(2)本发明中采用高分辨液质联用仪作为检测手段，只需要取样微量的核桃肽样品，即可达到有效检测目的；(3)本发明采用c18ye柱(1g，30μm)对样品除杂富集，相比与x1和hlb柱可大大提高富集能力；(4)本发明建立了完善的核桃肽的分离方法及质谱检测方法，通过质谱技术精确地识别不同厂家核桃肽中所有的多肽信息，筛选了核桃肽中的特征多肽作为质量标志物，为核桃肽的质量检测提供了可靠的依据，保障了消费者的权益。
附图说明
16.图1为本发明实施例核桃肽特征肽段fy的质谱离子图；
17.图2为本发明实施例核桃肽特征肽段alped的质谱离子图；
18.图3为本发明实施例xhtl-1(a)、gzhc-1(b)及zsdq-1(c)三个来自不同厂家的核桃肽特征肽段fy的色谱图；
19.图4为本发明实施例xhtl-1(a)、gzhc-1(b)及zsdq-1(c)三个来自不同厂家的核桃肽特征肽段alped的色谱图；
20.图5为本发明实施例厂家1(a)，厂家2(b)及厂家3(c)核桃肽样品中提取特征肽段fy的色谱图；
21.图6为本发明实施例厂家1(a)，厂家2(b)及厂家3(c)核桃肽样品中提取特征肽段alped的色谱图。
具体实施方式
22.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。请参阅图1-6：
23.实施例1
24.核桃肽供试品溶液的制备：分别精密称取xhtl-1、gzhc-1、zsdq-13个来自不同厂家核桃肽样品100mg，加入10ml含0.1％ tfa三氟乙酸的去离子水，超声10min。
25.样品前处理条件优化：准备3个反相spe柱，包括c18ye柱，x1柱和亲水-亲脂平衡的oasis hlb spe柱。其中c18ye及x1柱均在6ml管中填充1g填料吸附剂，oasis hlb spe柱在3ml柱管中填充200mg填料吸附剂。用含有0.1％ tfa的乙醇活化spe柱，然后用0.1％ tfa三氟乙酸水溶液平衡。随后将超声溶解在0.1％ tfa三氟乙酸水中的核桃肽溶液上样至预处理后的3种spe柱中。用1.5倍柱体积0.1％ tfa三氟乙酸去离子水溶液淋洗除杂，然后用2倍柱体积80％ can(含0.1％ tfa三氟乙酸)洗脱。收集洗脱液进行uplc-qtof/ms分析。进行液质联用分析，条件如下：
26.仪器：超高效液相色谱ab sciex x500系列qtof质谱仪
27.色谱柱：waters acquity uplc hss t3色谱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)
28.流动相：a：0.1％甲酸/水b：0.1％甲酸/乙腈
29.洗脱条件：
30.时间(分钟)a％b％010002100015901022703022.11000241000
31.表1洗脱条件表
32.流速：0.3ml/min
33.柱温：40℃
34.波长：280nm
35.进样量：5ul
36.质谱分析方法：
37.离子源：esi离子源；正离子模式；气帘气：35psi；gas1：45psi；gas2：45psi；温度：500℃；离子化压力：4500v，去簇电压：60v；全扫描范围：m/z50～2000；裂解电压：5v。cespread：0v。串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的50个离子进行碰撞诱导解离(cid)二级串联质谱。
38.样品前处理方法确定：不同前处理样品经过uplc-qtof/ms分析后得到的质谱数据利用peaks studio 11软件解析，发现hlb及x1柱的流穿液均能鉴定到肽段信息，而c18ye柱的上样流穿液中不能鉴定到肽段信息，所以最终选定c18ye柱。
39.核桃肽产品检测：样品按照选定的前处理方法进行中uplc-qtof/ms分析后，其中xhtl-1样品中共检测到6972个ms2信息；gzhc-1样品中共检测到6989个ms2信息；zsdq-1样品中共检测到6388个ms2信息。
40.肽段序列的鉴定与结构分析：二级质谱数据采用peaks studio 11软件进行de novo及db search鉴定分析，设置de novo解析参数为parent mass error tolerance 10.0ppm，fragment mass error tolerance 0.1da，酶切类型选择none；设置的db search
蛋白数据库来源为uniprot蛋白数据库(https://www.uniprot.org/)juglansregia物种，解析参数为parent mass error tolerance 10.0ppm；fragment mass error tolerance 0.1da；max missed cleavages 100；甲硫氨酸残基可变修饰(氧化+15.99da)；n-端乙酰化(+42.01da)；允许3个位点误切，假阳性率(fdr)≤1％；其他参数为默认参数。其中xhtl-1样品中共鉴定13328个肽段，其中alc score(％)＞50的有6142个；gzhc-1样品中共鉴定12452个肽段，其中alc score(％)＞50的有5866个；zsdq-1样品中共鉴定13481个肽段。其中alc score(％)＞50的有5369个。
41.筛选不同厂家共性肽段信息：
①
xhtl-1样品中鉴定的alc score(％)＞50的肽段信息为集合a；
②
gzhc-1样品中鉴定的alc score(％)＞50的肽段信息为集合b；
③
zsdq-1样品中鉴定的alc score(％)＞50的肽段信息为集合c；
④
集合a、b及c交集的成分为不同厂家核桃肽中专属性多肽。其中不同厂家核桃肽中共有肽段共263个，具体肽段名称，保留时间，m/z，质量数，alc score(％)，峰面积信息具体详见表2。
42.43.44.45.46.47.[0048][0049]
表2不同厂家核桃肽中共有肽段信息表
[0050]
从263个共有肽段中筛选出具有生物活性的特征性肽段，选定的核桃特征肽段的氨基酸序列为fy和alped的依据为：(1)特征肽段应满足在所产的核桃肽产品中质谱数据中均可以鉴定到，且alc score(％)＞50。(2)特征肽段须具备一定生物活性，而fy及alped具有神经保护，提高记忆力和学习力的功能活性。特征性肽段的鉴定图见图1和图2，其中序列为fy的肽有时也称作肽段一，序列为alped的肽有时也称作肽段二，具体信息详见表3。
[0051][0052]
表3fy及alped特征肽段信息及不同厂家峰面积表
[0053]
实施例2
[0054]
本实施例为基于fy及alped特征肽的其他厂家核桃肽产品品质评价。
[0055]
精密称取厂家1核桃肽样品100mg，加入10ml 0.1％三氟乙酸(tfa)水溶液，超声10min。随后将超声溶解在0.1％ tfa水中的核桃肽溶液上样至预处理后的c18ye柱中。用1.5倍柱体积0.1％ tfa去离子水溶液淋洗脱盐，然后用2倍柱体积80％acn(含0.1％tfa)洗脱。收集洗脱液进行uplc-qtof/ms分析。进行液质联用分析，条件如实施例1。
[0056]
实施例3
[0057]
精密称取厂家2核桃肽样品100mg，加入10ml 0.1％三氟乙酸(tfa)水溶液，超声10min。随后将超声溶解在0.1％ tfa水中的核桃肽溶液上样至预处理后的c18ye柱中。用1.5倍柱体积0.1％ tfa去离子水溶液淋洗脱盐，然后用2倍柱体积80％acn(含0.1％tfa)洗脱。收集洗脱液进行uplc-qtof/ms分析。进行液质联用分析，条件如实施例1。
[0058]
实施例4
[0059]
精密称取厂家3核桃肽样品100mg，加入10ml 0.1％三氟乙酸(tfa)水溶液，超声
10min。随后将超声溶解在0.1％ tfa水中的核桃肽溶液上样至预处理后的c18ye柱中。用1.5倍柱体积0.1％ tfa去离子水溶液淋洗脱盐，然后用2倍柱体积80％acn(含0.1％tfa)洗脱。收集洗脱液进行uplc-qtof/ms分析。进行液质联用分析，条件如实施例1。
[0060]
图5和图6结果显示，在待测样品液相色谱-质谱图中，厂家1样品在保留时间15.1呈现与xhtl-1，gzhc-1及zsdq-1样品中m/z一致的(fy：m/z 329.15)色谱峰，厂家2样品在保留时间13.4呈现与xhtl-1，gzhc-1及zsdq-1样品中m/z一致的(alped：m/z 544.26)色谱峰。但这3个厂家核桃肽样品中不能同时呈现fy与alped两个特征肽段保留时间一致的色谱峰，说明对比例3个厂家的核桃肽样品品质都不是很好，该核桃特征肽及检测方法可以很好地评价市场上不同厂家的核桃肽。
[0061]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。

技术特征：
1.一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，其特征在于，包含如下步骤：s1供试品溶液制备：分别精密称取不同厂家的核桃肽样品100mg，加入10ml 0.1% tfa三氟乙酸水溶液，超声溶解；将溶解在0.1% tfa三氟乙酸水中的核桃肽溶液上样至预处理后的c18ye spe柱中；用0.1% tfa三氟乙酸水溶液淋洗除杂，然后用80% can乙腈溶液洗脱，收集洗脱液进行uplc-qtof/ms质谱分析；s2利用uplc-qtof/ms质谱技术对不同厂家的核桃肽产品进行液相色谱-质谱检测，得到的质谱数据利用peaks studio11软件解析质谱数据，鉴定样品中的多肽序列并筛选出不同厂家核桃肽的共有肽段；s3使用peaks studio11软件的de novo和db search模块对质谱数据进行解析，共发现263个核桃肽共有肽段，最终选定氨基酸序列为fy和alped；s4通过氨基酸序列fy和alped判断市场上核桃肽产品的多肽指纹图谱是否含有核桃肽特征肽段的离子信号及响应高低来评价核桃肽品质。2.根据权利要求1所述的一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，其特征在于，所述s1中can乙腈溶液含0.1%tfa三氟乙酸。3. 根据权利要求1所述的一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，其特征在于，所述s2中液质分析时采用的色谱柱为hss t3，流速0.3ml/min，以0.1%甲酸-水溶液为流动相a，0.1%甲酸-乙腈溶液为流动相b进行梯度洗脱；洗脱程序为：0-2min，100%a；2-15min，100%-90%a；15-22min，90%-70%a；22-22.1min，70%-100%a，22.1-24min，100%a；图谱采集时间为24min；质谱条件：esi离子源，正离子模式；ida扫描模式；气帘气：35psi；gas1：45psi；gas2：45psi；温度：500℃；离子化压力：4500v；去簇电压：60v；全扫描范围：m/z 50~2000da；裂解电压：5v；cespread：0v。4. 根据权利要求1所述的一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，其特征在于，所述s3中peaks studio11软件对质谱数据解析时，db search蛋白数据库来源为uniprot蛋白数据库的juglans regia物种，de novo解析参数为parent mass error tolerance 10.0ppm，fragment mass error tolerance 0.1da；db search解析参数为parent mass error tolerance 10.0ppm，fragment mass error tolerance 0.1da，max missed cleavages 100，分析质谱数据。5.一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法在评价核桃肽品质中的应用，其特征在于：使用如权利要求1至4中任一项所述的一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，判断核桃肽产品的多肽指纹图谱是否含有核桃肽特征肽段的离子信号及响应高低：若含有且氨基酸序列fy和alped含量较高，则说明产品品质较好，若不含有或fy和alped含量较低则说明该产品品质不佳。

技术总结
本发明公开了一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法及其应用，肽段包括肽段一：FY和肽段二：ALPED。本发明运用质谱多肽组学定向分析技术，通过大量实验筛选得到两条核桃肽的特征肽段，这两条特征肽段具有很高的专属性，可用于鉴定核桃肽。并找到了不同厂家研究核桃肽在多肽成分和含量上的差异，并且本发明提供的核桃肽的鉴别方法，通过大量实验筛选出最佳的色谱条件和质谱条件，整个方法操作简单，准确性高，有利于核桃肽的质量控制，不需要单体对照品为对照，只根据核桃肽样品中特征肽段的质谱信息即可进行定性分析，可大大提高核桃肽中特征肽段的检测效率和准确度，可以填补核桃肽研究中的空白，对保证核桃肽的质量具有重要的意义。意义。意义。


技术研发人员：梁鑫淼 王超然 郭秀洁 杨佳颖 徐伟 董海临 金郁
受保护的技术使用者：泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/9/23