一种活性肥水剂的生产方法及在贝藻体系中的应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种活性肥水剂的生产方法及在贝藻体系中的应用。


背景技术：

2.近年来由于微藻的光自养成本高昂、阴雨天和冬天等弱光条件下微藻缺乏碳源导致产量低下，进而血蚶等贝类缺乏牟氏角毛藻等天然活饵料，难以实现高密度培养。研究发现，当牟氏角毛藻在一些羧酸类做有机碳源的进行兼养培养时，能极大提高生物产量和比生长速率，减少细菌的滋生。并且这些有机酸还可以维持水池的酸碱度，减少氨氮过高带来的氨毒害。但将有机酸作为碳源应用于牟氏角毛藻培育的研究极少。
3.矿物质在一定浓度下也能极大提高微藻的生物量，协同有机碳源共同刺激微藻的新陈代谢。矿物质主要分为三种形态，以硫酸铁、硫酸铜为代表的无机盐矿物质，以乳酸亚铁、柠檬酸铁为代表的有机酸矿物质络合物，以甘氨酸亚铁、酪蛋白肽-锌螯合物为代表的氨基酸、肽类矿物质螯合物。矿物质螯合物的生物活性大于前两者，并且鳌合剂和矿物元素结合，能够防止矿物质在植物培养过程中进行沉淀，并减少矿物质对细胞生长代谢产生的抑制作用。但矿物质螯合物在微藻的培育中几乎无报道。并且，单一纯品的有机酸和矿物质制备繁琐、成本高昂，难以提高微藻培育的经济效益。
4.生物肥水剂，是将饲料原料中的粗蛋白、粗纤维通过菌酶协同发酵，降解成小分子肽、有机酸和氨基酸等。其中，有机酸可充当微藻的碳源，氨基酸和小肽可充当微藻的氮源，肥水剂的大量益生菌或许能协同微藻进一步转化有机物为无机物，提高微藻的生物产量。肥水剂的氨基酸，微量元素可也作为牟氏角毛藻的营养补剂。此外，肥水剂可以根据血蚶的营养需求选择原料，将血粉、羽毛粉和玉米蛋白粉搭配做饲料原料进行发酵，可弥补血粉氨基酸的不平衡，改善血粉的腥臭味，并且血粉富含铁能满足血蚶的营养需求。
5.但羽毛角蛋白富含高度交联的二硫键和疏水性氨基酸限制了其在肥水剂中的应用，且当前市场上缺少商业化的角蛋白酶且价格昂贵，同时多数角蛋白酶的最适ph偏碱性，不利于在酸性条件下应用。因此，亟需开发满足牟氏角毛藻和血蚶的营养需求，且富含酸性角蛋白酶，来提高羽毛粉的酶解效率、降低生产成本的肥水剂。


技术实现要素：

6.针对现有牟氏角毛藻产量低下的问题，本发明根据藻类(牟氏角毛藻)和血蚶的生长需求，提供了一种以血粉、羽毛粉和玉米蛋白粉为原料的高效肥水剂，在肥水剂的生产过程中，根据牟氏角毛藻的生长需求，加入产乙酸高的发酵菌株及矿物质。同时克隆表达一种酸性条件下活性高的角蛋白酶高效工程菌并加入还原剂亚硫酸钠进行协同发酵，获得的肥水剂成品中乙酸、小肽、氨基酸、矿物质螯合率高，对牟氏角毛藻的生长效果影响显著，并对血蚶养殖也有同步直接促进作用，取得了意想不到的显著效果。
7.为了实现以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
8.(1)将血粉、羽毛粉、玉米蛋白粉、次粉和麸皮混合，搅拌均匀，制成固体培养基；
9.(2)选择乳酸菌、酵母菌、芽孢菌接种到相应的培养基进行活化培养并得到相应的乳酸菌、酵母菌、芽孢菌发酵种子液；
10.(3)将来源于bacillus tequilensis strain q7的角蛋白酶基因序列根据粟酒裂殖酵母菌密码子偏好性进行优化，得到编码角蛋白酶的基因，核苷酸序列如seq id no.1所示；以该基因为模板进行pcr扩增，于穿梭质粒载体prep连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用醋酸锂转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组角蛋白酶酵母工程菌，即s.pombe-prep-kerq7；培养所述的重组角蛋白酶酵母工程菌收集菌液，所述菌液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的角蛋白酶；将菌液通过离心固液分离后收集上清液，即为粗酶液；
11.(4)将步骤(2)的乳酸菌、酵母菌、芽孢菌发酵种子液和步骤(3)的s.pombe-prep-kerq7培养后的菌液或粗酶液接种到步骤(1)的固体培养基中，然后再加入矿物质、亚硫酸钠、水搅拌均匀，发酵结束后获得活性肥水剂。
12.优选的，步骤(1)所述的用量为血粉3-10％、羽毛粉3-10％、玉米蛋白粉3-10％、次粉35-45％，麸皮35-45％。
13.优选的，步骤(2)所述的乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌，酵母菌为产朊假丝酵母菌，芽孢菌为枯草芽孢杆菌。
14.优选的，步骤(3)所述培养重组角蛋白酶酵母工程菌温度为30-37℃，转速为180-220rpm，时间为24～48h；所述离心的条件为5000-8000rpm，5-10min。
15.优选的，步骤(4)所述的s.pombe-prep-kerq7以粗酶液方式添加时，添加量占步骤(1)固体培养基质量的25-45％；以菌液添加时，其与乳酸菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液、芽孢菌发酵种子液的总菌液接种量为10～20％(v/w，ml/g)；其中s.pombe-prep-kerq7的菌液与乳酸菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和芽孢菌发酵种子液的体积比为1-3：1-3：1-3：1-3；所述乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌中的一种或多种混合，当多种混合时其体积比为1。
16.更优选的，s.pombe-prep-kerq7的菌液与乳酸菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和芽孢菌发酵种子液的体积比为2：3：2：1。
17.优选的，步骤(4)中控制培养基的含水量为25％-45％(v/w)，发酵的时间为5-12天，发酵的温度20-37℃。
18.优选的，以固体培养基的质量计，步骤(4)所述亚硫酸钠的添加量为0.1～2％(w/w)；矿物质为硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌和碳酸钙；其中硫酸亚铁的添加量为1.77-15.75g/kg(w/w)、硫酸铜的添加量为16.3-94.7mg/kg(w/w)、硫酸锰的添加量为300-1200mg/kg(w/w)、硫酸锌的添加量为73.3-293.3mg/kg(w/w)、碳酸钙的添加量为3.3-33g/kg(该浓度范围是通过活性肥水剂的投喂量和最适牟氏角毛藻生长的矿物质的浓度来对应的；当添加0.3-1.2g/l的活性肥水剂于牟氏角毛藻的培养基中，此时培养基中铁的浓度范围在0.53-4.725mg/l，铜的浓度范围在4.9-28.4ug/l，锰的浓度范围在90-360ug/l，锌的浓度范围在22-88ug/l，钙的浓度范围在1-10mg/l，对应促进牟氏角毛藻生长的矿物质的用量范围)。
19.更优选的，步骤(4)所述亚硫酸钠的添加量为0.1％(w/w)。
20.本发明制备的活性肥水剂用于水产养殖的用途，所述水产包括藻类和血蚶。
21.具体操作是：肥水剂直接抛洒养殖池，每隔1～10天抛洒一次，每次的施用量为0.3g/l-1.2g/l。
22.当投放时间为12月-2月或阴雨天，需要按照原施用量10-30％加量；当投放时间为3～5月份、9～11月份，需要按照原施用量10-30％减量。
23.技术方案的具体筛选过程如下：
24.(a)发酵菌种的筛选
25.初始有机酸选择为：乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸；
26.将有机酸：乳酸以0、0.05、0.075、0.1、0.2g/l、乙酸以0、0.1、0.3、0.5、0.7g/l、甲酸以0、0.05、0.075、0.1、0.2g/l、丙酸以0、0.05、0.075、0.1、0.2g/l、柠檬酸以0、0.1、0.3、0.5、0.7g/l、琥珀酸以0、0.05、0.1、0.3、0.5g/l、酒石酸以0、0.05、0.1、0.3、0.5g/l、苹果酸以0、0.05、0.1、0.3、0.5g/l加入到微藻培养基(f/2人工海水培养基)中，得到含有机酸的f/2人工海水培养基；将ph调节为8.0，再将牟氏角毛藻以10％的接种量转接至含有机酸的f/2人工海水培养基中，初始藻密度为5
×
105个/ml，培养10天，以藻密度为指标，通过结果能够看出不同有机酸对微藻是生长是有重要影响的，其中乙酸和柠檬酸的促进效果尤为明显，进一步通过最优值对比来看，乙酸的影响最为显著，进而筛选到促进牟氏角毛藻生长最佳的乙酸含量为0.5g/l，此时牟氏角毛藻的藻密度为1.23
×
107个/ml，藻密度见图1。
27.f/2人工海水培养基配方为：75mg/l nano3、5mg/l nah2po4·
h2o、9.8μg/l cuso4·
5h2o、22μg/l znso4·
7h2o、10μg/l cocl
·
6h2o、180μg/l mncl2·
4h2o、6.3μg/l na2moo4·
2h2o、4.36mg/l na2edta、3.15mg/l fecl3·
6h2o、100μg/l vb1、0.5μg/l vh、0.5μg/l vb
12
，26g/l 海盐。
28.而后，对乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌的发酵菌液采用hplc进行有机酸的测定，具体实验菌株选择了15种，依次为发酵乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌；通过表1的实验结果可以看出，不同菌株所产生的有机酸含量差异明显，其中布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌所产的乙酸明显高于其他有机酸，因此选择发酵菌株为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌；有机酸含量如下表1。
29.表1不同菌种的有机酸含量
30.[0031][0032]
注：s
1-s
15
依次为：发酵乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌。
[0033]
(b)矿物质形态和浓度的筛选
[0034]
将不同形态的铁源(硫酸铁、硫酸亚铁、甘氨酸亚铁、乳酸亚铁)，锌源(硫酸锌、乳酸锌、甘氨酸锌)，铜源(硫酸铜、柠檬酸铜、甘氨酸铜)，锰源(氯化锰、乙酸锰、甘氨酸锰)，钙源(氯化钙、乳酸钙、天冬氨酸钙)分别按照终浓度fe＝19umol/l、zn＝0.08unol/l、cu＝0.04umol/l、mn＝0.91umol/l、ca＝0.04umol/l，依次加入无铁源、无锌源、无铜源、无铜源、无钙源的f/2人工海水培养基中，然后以10％的接种量接种牟氏角毛藻，初始藻密度控制为5
×
105个/ml，培养8天，筛选到牟氏角毛藻分别在螯合态的铁源、锌源、铜源、钙源下生长最佳，藻密度见图2。
[0035]
进一步以藻密度为指标，优化矿物质浓度，可以看出在不同浓度条件下其对微藻的生长影响极为显著，只有在特定浓度下才能取得良好的结果；通过实验得到0.53-4.725mg/l甘氨酸亚铁为铁源、4.9-28.4ug/l甘氨酸铜为铜源、90-360ug/l甘氨酸锰为锰源时、22-88ug/l甘氨酸锌为锌源和1-10mg/l天冬氨酸钙为钙源时，为牟氏角毛藻最适生长的矿物质浓度。对应矿物质选择为硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌和碳酸钙，其中根据相应的用量转换，确定硫酸亚铁的添加量为1.77-15.75g/kg(w/w)、硫酸铜的添加量为16.3-94.7mg/kg(w/w)、硫酸锰的添加量为300-1200mg/kg(w/w)、硫酸锌的添加量为73.3-293.3mg/kg(w/w)、碳酸钙的添加量为3.3-33g/kg。结果见图3；(c)获得产耐酸性角蛋白酶的粟酒裂殖酵母菌
[0036]
步骤1：
[0037]
s1、将ncbi中的bacillus tequilensis strain的角蛋白酶基因序列(genbank:id kp694221)，根据粟酒裂殖酵母中密码子偏爱性，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化；得到密码子优化后的重组角蛋白酶(记为kerq7)基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；
[0038]
s2、以酵母常用载体prep为模版，先进行载体prep片段的获取：设计反向扩增引物p2(p2-r：cataaactgagcggatacgacg；p2-f：ggatccggggggtaaaaggaat)扩增线性化的prep载体，得到载体prep片段；其中pcr反应条件为：94℃，3min；98℃，10s；55℃，15s；72℃，1min；获得条带大小约9500bp左右，如图4(a)所示，将pcr产物割胶回收片段，并纯化测定浓度。
[0039]
同时，进行目的基因kerq7片段的获取：先设计带有载体同源臂的引物p3(p3-f:t
cgtatccgctcagtttatggaacgtgtttctaagactgattctgaa；
[0040]
p3-r:tccttttaccccccggatccttagtggtggtggtggtggtgattagaagcagcttgaacat)，用引物p3扩增线性化kerq7基因，得到目的基因kerq7片段；其中pcr反应体系为94℃3min，94℃30s，65℃30s，72℃1min，30个循环，72℃10min，条带大小为825bp，如图4(b)所示，产物胶回收后测定核酸浓度。
[0041]
s3、而后，将s2得到的载体prep片段和目的基因kerq7片段利用clonexpress ii one step cloning kit一步克隆试剂盒进行连接；连接后的产物直接转化到大肠杆菌dh5a，培养过夜后挑取转化子进行菌落pcr验证，验证引物为p4(p4-f：tttcttccctctctcgcttc；p4-r：cgtaatatgcagcttgaatgg)，pcr体系为94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，72℃10min，条带大小为1079bp，如图4(c)所示，而后挑取转化子，提质粒送生物公司测序，以便确定是否正向插入和有无突变。
[0042]
步骤2：将正向插入的未发生碱基突变的质粒命名为prep-kerq7，通过醋酸锂转化法导入6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母中，并以不含kerq7的空质粒转入s.pombe作为空白对照。将转化后不含葡萄糖胺的yes固体培养基置于30℃恒温恒湿培养箱中培养3d，长出合适大小的转化子后挑取，并进行菌落pcr验证(见图4(d))和同步扩培，并将pcr验证正确的片段进行胶回收后送生工测序，验证无误后的重组酵母菌进行冻存，并命名为s.pombe-prep-kerq7，空质粒对照酵母命名为s.pombe-prep。
[0043]
步骤3：将s.pombe-prep-kerq7和s.pombe-prep菌在yes固体培养基平板上划线，静置于30℃培养箱中活化培养两天后，分别挑取s.pombe-prep-kerq7和s.pombe-prep的单菌落转接于100mlyes液体培养基中，并在30℃，180rpm摇床中培养至平台期，收集培养液于8000rpm的冷冻离心机上离心，并收集上清液备用；
[0044]
将s.pombe-prep-kerq7和s.pombe-prep的上清液进行超滤浓缩，并用20mm tris-hcl(ph 8.0)清洗三次，浓缩并洗涤后的上清液用于sds-page验证，sds-page显示实验组在28kda处有较明显的特异条带(图5)，以280nm处的吸光度升高0.01定义为一个酶活力单位。测定发现，s.pombe-prep-kerq7的酶活力为108u/l，可用做肥水剂的发酵菌种。
[0045]
本发明的优点和技术效果是：
[0046]
(1)本发明提供了一种促进牟氏角毛藻生长的产乙酸的活性肥水剂，乙酸是经过筛选，并对牟氏角毛藻生长效果显著；同时基于此进一步筛选发酵菌株，在特定菌株的发酵下满足牟氏角毛藻对乙酸的需求，从而能显著地促进牟氏角毛藻生长。
[0047]
(2)本发明提供了一种能够促进牟氏角毛藻生长且制备螯合矿物质成本低廉的活性肥水剂，其矿物质的形态和含量均是经过创造性筛选，在特定的试剂和用量条件下能显著地促进牟氏角毛藻生长。
[0048]
(3)本发明提供了一种具有生物安全性的产角蛋白酶的重组粟酒裂殖酵母菌，可以快速地获得大量的角蛋白酶，因其在酸性条件下依然可以保持较高活性，可直接用于酸性肥水剂中羽毛角蛋白的降解，取得非常显著的技术效果。
[0049]
(4)本发明以血粉、羽毛粉等农业废弃物为原料，通过基因工程技术构建产角蛋白酶工程菌，并筛选促藻生长的多种营养因子，将其制备成一种高效肥水剂应用于贝藻体系，在取得显著效果的同时实现变废为宝，促进我国循环农业的发展。
附图说明
[0050]
图1为不同有机酸对牟氏角毛藻生长的测定结果；其中a是不同乳酸含量对牟氏角毛藻生长的测定结果，b是不同乙酸含量对牟氏角毛藻生长的测定结果，c是不同甲酸含量对牟氏角毛藻生长的测定结果，d是不同丙酸含量对牟氏角毛藻生长的测定结果，e是不同柠檬酸含量对牟氏角毛藻生长的测定结果，f是不同苹果酸含量对牟氏角毛藻生长的测定结果，g是不同酒石酸含量对牟氏角毛藻生长的测定结果，h是不同琥珀酸含量对牟氏角毛藻生长的测定结果。
[0051]
图2为不同矿物质对牟氏角毛藻生长的测定结果；其中，a图是不同形态的铁源对牟氏角毛藻生长的测定结果，其中fe0：无铁源，fe1：三氯化铁，fe2：硫酸亚铁，fe3：乳酸亚铁，fe4：甘氨酸亚铁；b图是同形态的铜源对牟氏角毛藻生长的测定结果，其中cu0：无铜源，cu1：硫酸铜，cu2：柠檬酸铜，cu3：甘氨酸铜，ca：柠檬酸，gc：甘氨酸；c图是不同形态的钙源对牟氏角毛藻生长的测定结果，其中ca0：无钙源，ca1：氯化钙，ca2：乳酸钙，ca3：天冬氨酸钙，la：乳酸，asp：天冬氨酸；d图是不同形态的锌源对牟氏角毛藻生长的测定结果，其中zn0：无锌源，zn1：硫酸锌，zn2：乳酸锌，zn3：甘氨酸锌，la：乳酸，gc：甘氨酸；e图是不同形态的锰源对牟氏角毛藻生长的测定结果，其中mn0：无锰源，mn1：氯化锰，mn2：乙酸锰，mn3：甘氨酸锰，aa：乙酸；gc：甘氨酸。
[0052]
图3为不同螯合矿物质含量对牟氏角毛藻生长的测定结果；其中，a图是不同含量的甘氨酸亚铁对牟氏角毛藻生长的测定结果，b图是不同含量的甘氨酸铜对牟氏角毛藻生长的测定结果，c图是不同含量的甘氨酸锰对牟氏角毛藻生长的测定结果，d图是不同含量的甘氨酸锌对牟氏角毛藻生长的测定结果，e图不同含量的天冬氨酸钙对牟氏角毛藻生长的测定结果。
[0053]
图4为琼脂糖凝胶电泳检测目的片段的结果；a图是扩增的线性化prep片段(1和2为平行)；b图扩增的kerq7片段(1和2为平行)；c图在e.coli dh5a中挑取1、2两个转化子菌落pcr验证；d图在s.pombe-prep-kerq7中挑取1、2两个转化子菌落pcr验证。
[0054]
图5为sds-page验证重组kerq7在粟酒裂殖酵母中的表达；泳道1和泳道2表示重组酵母胞外分泌蛋白；泳道3和泳道4表示对照酵母胞外分泌蛋白；箭头处指示kerq7蛋白。
具体实施方式
[0055]
以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明。做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。下述实施例中所使用的实验原料如无特殊说明，均可通过商业途径得到；除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。
[0056]
藻种来源：牟氏角毛藻购自丰耕藻业有限公司；
[0057]
菌种来源：鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)cgmcc 1.2467、发酵乳杆菌、(lactobacillus fermentum)cgmcc 1.15608、酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)cgmcc 2.1527、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc 1.1086、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)cgmcc1.813、布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)cgmcc 1.15607、双歧杆菌(bifidobacterium lactis)cgmcc 1.5091、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)cgmcc 1.16089、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)
cgmcc 1.12735、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)cgmcc 1.8727、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracei)cgmcc 1.12731、产朊假丝酵母菌(candida utilis)cgmcc 2.3047、凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)cgmcc 1.10823、毕赤酵母菌(pichia pastoris)cgmcc 2.404均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；弯曲乳杆菌(lactobacillus curvatus)来自宁波明舟生物科技有限公司，编号为bmz068373。
[0058]
gfa基因缺陷型粟酒裂殖酵母及prep(带有gfa基因，padh启动子)穿梭表达质粒公开于《粟酒裂殖酵母生物安全性高效表达载体的构建及优化》。
[0059]
注：关于菌株均为可通过现有渠道获取的菌株，本发明的交代仅作说明，并非局限；如本发明限定枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的编号为cgmcc 1.1086的，其他枯草芽孢杆菌均可等同替换。
[0060]
本发明实施例中采取的检测方法可参照如下说明：
[0061]
1.牟氏角毛藻藻密度的测定
[0062]
取100ul藻液，用血球计数板，遵循“记上不记下，记左不记右”的原则，每毫升藻细胞数＝80个小方格细胞总数/80
×
400
×
104×
稀释倍数。
[0063]
2.发酵菌液有机酸的测定
[0064]
将菌液培养至od600nm＝0.6，取2ml菌液8000rpm离心5min。取上清液，过膜测定。色谱柱：月旭oaa柱；流动相：磷酸二氢钾:甲醇＝97:3；磷酸二氢钾浓度为0.01mol/l，并用20％(v/v)磷酸调节ph＝2.7，检测波长：210nm；等度洗脱，流速：0.6ml/min。
[0065]
3.肥水剂有机酸的测定
[0066]
称取1g的活性肥水剂，加入30ml的去离子水浸泡1h，超声30min，后8000rpm离心20min。取上清液，过膜测定。色谱柱：月旭oaa柱；流动相：磷酸二氢钾:甲醇＝97:3；磷酸二氢钾浓度为0.01mol/l，并用20％(v/v)磷酸调节ph＝2.7，检测波长：210nm；等度洗脱，流速：0.6ml/min。
[0067]
4.肥水剂游离氨基酸的测定
[0068]
(1)氨基酸标准曲线的建立
[0069]
配制50mg/l、100mg/l、250mg/l、400mg/l、500mg/l的15种氨基酸混合标准品。以质量浓度和峰面积为横纵坐标，建立标准曲线。
[0070]
(2)样品提取及衍生
[0071]
6.00g发酵饲料与40ml 0.1mol/l hcl混合，超声20min，摇晃浸泡1h，4000rpm离心20min，取100ul上清加入200ul衍生缓冲液，震荡混匀，再加入200ul衍生剂，震荡混匀，60℃水浴反应1h，0.45μm滤膜过滤，待测。
[0072]
(3)计算
[0073]
将测定样品的峰面积代入标准曲线公式中，计算各游离氨基酸的含量。总游离氨基酸含量为各游离氨基酸含量相加的和。
[0074]
(4)色谱条件
[0075]
流动相：0.05mol/l乙酸钠溶液和50％乙腈；色谱柱：c18柱(welch，aq-c18，5.0μm)；检测波长：360nm；流速：1.0ml/min，梯度洗脱条件见表2。
[0076]
表2氨基酸测定梯度洗脱条件
[0077]
时间(min)0.05mol/l乙酸钠溶液(％)50％乙腈(％)
084160.38416469319.56436174555284060340100380100398416468416
[0078]
5.肥水剂粗蛋白和小肽含量的测定
[0079]
称取0.2g干燥后的活性肥水剂进行消化、定氮，用于粗蛋白的测定。称取2.0g干燥后的活性肥水剂，加入50ml15％(v/v)三氯乙酸浸泡1h，取滤液10ml进行消化、定氮，用于小肽的测定。计算公式如下。
[0080][0081]
v0：空白样所用标准盐酸体积(ml)；v1：样品所用标准盐酸体积(ml)；c：标准盐酸浓度(mol/l)；m1：样品质量(g)；m2：粗蛋白含量(％)
[0082]
6.肥水剂矿物离子螯合率的测定
[0083]
称取肥水剂1.00g，于500～550℃的马弗炉中灰化至白色灰烬。若灰化不彻底有黑色炭粒，则冷却后滴加少许硝酸湿润，在电热板上干燥后，移入马弗炉中继续灰化成白色灰烬。冷却后取出，加入10ml 5％硝酸溶液溶解，并用去离子水定容至25ml。同时做空白实验。用电感耦合等离子体光谱仪(icp-oes)测定肥水剂中fe、cu、mn、zn、ca的总含量，分别为fe0、cu0、mn0、zn0、ca0。
[0084]
称取肥水剂1.00g，加入无水乙醇30ml，摇晃浸泡30min，定性滤纸过滤，滤液10000rpm离心10min。取离心后的上清10ml，置于马弗炉中灰化(步骤同上)。用icp-oes测量未络合的fe、cu、mn、zn的含量，分别为fe1、cu1、mn1、zn1。fe、cu、mn、zn络合率计算分别见式(5.1)、(5.2)(5.3)(5.4)。
[0085]
称取肥水剂1.00g，加入50ml 1％醋酸溶液，120rpm，摇晃浸泡30min，定性滤纸过滤，滤液10000rpm离心10min。取离心后的上清10ml，置于马弗炉中灰化(步骤同上)。用icp-oes测量ca的含量，为ca1。
[0086]
称取肥水剂1.00g，加入50ml去离子水，摇晃浸泡30min，定性滤纸过滤，滤液10000rpm离心10min。取离心后的上清10ml，置于马弗炉中灰化(步骤同上)。用icp-oes测量ca的含量，为ca2。ca络合率计算见式(5.5)。
[0087][0088]
[0089][0090][0091][0092]
7.角蛋白酶酶活测定方法
[0093]
取1.0ml加入2.0ml 0.05mol/l tris-hcl缓冲液(ph 7.0)，然后加入10mg羽毛粉作为底物，在30℃恒温摇床中反应，1h后加入2.0ml 10％三氯乙酸(tca)终止反应，10，000rpm4℃离心10min，取上清液于280nm测定其吸光度。反应前添加tca处理的反应管用作对照。酶活定义为在上述反应条件下，280nm处的吸光度升高0.01定义为1个酶活力单位(u)。
[0094]
8.血蚶的生长指标
[0095]
(1)存活率
[0096][0097]
血蚶以贝壳张开，触碰后无法闭壳作为死亡标准。
[0098]
(2)体重日增长率
[0099][0100]
式中，w为日增长重率；w1为实验结束时血蚶的平均体重(g)；w2为实验开始时血蚶的平均体重(g)，t为实验周期(天)。
[0101]
实施例1：
[0102]
(1)乳酸菌、酵母菌和芽孢菌活化培养和发酵种子液的制备；其中乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌，酵母菌为产朊假丝酵母菌，芽孢菌为枯草芽孢杆菌。将布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌接种到相应的培养基进行活化培养并得到相应的发酵种子液。
[0103]
a、培养基的配制：
[0104]
酵母菌和芽孢菌的液体培养基：每升蒸馏水里加入5g酵母浸粉，10g nacl，10g胰蛋白胨，超声5min，待完全溶解后，121℃灭菌30min，冷却后待用。
[0105]
乳酸菌的液体培养基：每升蒸馏水里加入10g牛肉膏，10g大豆蛋白胨，20g葡萄糖，5g酵母浸粉，2g磷酸氢二钾，2g柠檬酸氢二铵，5g无水乙酸钠，1g tween 80，0.58g硫酸镁，0.25g硫酸锰，超声10min，待完全溶解后，121℃高温灭菌30min，冷却后待用。
[0106]
b、乳酸菌、酵母菌和芽孢菌的活化培养和发酵种子液的制备：
[0107]
酵母菌以1％的接种量接种于lb培养基，在30℃，摇床150rpm，培养至od600nm＝0.6；芽孢菌以1％的接种量接种于lb培养基在37℃，摇床150rpm，培养至od600nm＝0.6；乳酸菌以1％的接种量接种于mrs培养基，37℃，厌氧培养到od600nm＝0.6，得到发酵种子液。
[0108]
(2)将5％血粉、5％羽毛粉、5％玉米蛋白粉、42.5％次粉、42.5％麸皮混合搅拌均匀，制成固体培养基。
[0109]
(3)获得重组的角蛋白酶工程菌s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液(操作同前文
筛选步骤c)；
[0110]
(4)将步骤(1)的发酵种子液和步骤(3)的上清液加入步骤(2)的固体培养基中，菌液接种量为6％，其中s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液、乳酸菌发酵种子液、产朊假丝酵母菌发酵种子液、枯草芽孢杆菌发酵种子液的体积比为1:1：1：1，乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌，其中布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌发酵种子液的体积比为1:1：1：1；控制培养基含水量为45％；按照步骤(2)的固体培养基的质量计：加入1.77g/kg(w/w)硫酸亚铁、16.3mg/kg(w/w)硫酸铜、300mg/kg(w/w)硫酸锰、73.3mg/kg(w/w)硫酸锌和3.3g/kg(w/w)碳酸钙，搅拌均匀，进行厌氧发酵，发酵温度30℃，发酵时间7天，发酵结束后获得高效肥水剂(活性肥水剂)；
[0111]
对比例1：
[0112]
以不加菌、不加酶的未发酵肥水剂为对照组；具体为：按照步骤(2)的固体培养基的质量计：在固体培养基中加入1.77g/kg(w/w)硫酸亚铁、16.3mg/kg(w/w)硫酸铜、300mg/kg(w/w)硫酸锰、73.3mg/kg(w/w)硫酸锌和3.3g/kg(w/w)碳酸钙，搅拌均匀，控制含水量为45％，得到未发酵的肥水剂。
[0113]
测定肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、粗蛋白含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率，其中，乙酸和总有机酸的测定见检测方法3，氨基酸的测定见检测方法4，粗蛋白和小肽的测定见检测方法5，铜、铁、锰、锌、钙的螯合率的测定结果见检测方法6，最终测定结果见表3。与未发酵的肥水剂相比，活性肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率均得到了显著的提高。
[0114]
表3.实施例1中活性肥水剂自身产物的测定结果
[0115][0116][0117]
(5)将牟氏角毛藻种子液以10％的接种量转接至10l的f/2人工海水培养基中，控制初始藻密度为5
×
105个/ml；而后将活性肥水剂以0.3g/l添加到牟氏角毛藻的f/2人工海水培养基中；以未发酵肥水剂、不加肥水剂为对照组；调节ph值8.0，培养温度26
±
1℃，光照强度为8000lux，光暗比12h：12h，培养8天后，进行藻细胞计数，计数方法见检测方法1，结果见表4；牟氏角毛藻在添加了活性肥水剂的培养基中的藻密度，是f/2人工海水培养基(无肥水剂)下的1.96倍。
[0118]
s1、其中牟氏角毛藻种子液的制备方法如下：
[0119]
将牟氏角毛藻培养至对数生长期后，以10％(v/v)的接种量，转接至1l的f/2人工海水培养基进行培养，培养至对数生长期，得到牟氏角毛藻种子液；f/2人工海水培养基：75mg/l nano3、5mg/l nah2po4·
h2o、9.8μg/l cuso4·
5h2o、22μg/l znso4·
7h2o、10μg/l cocl
·
6h2o、180μg/l mncl2·
4h2o、6.3μg/l na2moo4·
2h2o、4.36mg/l na2edta、3.15mg/l fecl3·
6h2o、100μg/l vb1、0.5μg/l vh、0.5μg/l vb
12
，26g/l海盐。
[0120]
表4.肥水剂对微藻生长的影响
[0121]
实验组别初始藻密度(
×
105个/ml)最终藻密度(
×
107个/ml)对比例1(未发酵肥水剂)50.62实施例1(活性肥水剂)51.55无肥水剂50.79
[0122]
(6)分别将微藻、活性肥水剂、贝类粉剂单一/混合投喂血蚶，每7天进行一次全换水，取规格相近的血蚶，平均体质量为7.8
±
0.5g，清洁壳表污物和附着生物后，暂养于水箱3l(长
×
宽
×
高＝35cm
×
24cm
×
11cm)中，暂养期间连续充氧，溶氧≥5mg/l，水温20
±
2℃，添加海水晶，使得盐度为26ppt，ph＝8.0
±
0.2，光照8000lux，光暗比12h：12h；
[0123]
投喂实验分为六个组别：
[0124]
a组：微藻，b组：活性肥水剂，c组：贝类粉剂，d组：微藻+活性肥水剂，e组：微藻+贝类粉剂，f组：空白对照(无任何饵料添加)；
[0125]
投喂量：微藻的投饵量为5
×
105个/ml/d，肥水剂和贝类粉剂的投喂量为0.3g/l；培育30天后记录血蚶的存活率和日增重率，计算方法见检测方法8，结果见表5。
[0126]
说明：微藻为在f/2人工海水培养基中培养至对数生长期的牟氏角毛藻。
[0127]
肥水剂为实施例1步骤(4)制备的高效肥水剂；
[0128]
贝类粉剂直接购买自乐渔科技有限公司。
[0129]
表5实施例1中不同饵料对血蚶的生长的影响
[0130]
实验组别a组b组c组d组e组f组血蚶的存活率(％)957859956535血蚶的增重率(％)432.56.83.91
[0131]
由表5可知，血蚶在微藻组别和微藻+活性肥水剂组别获得了最大的存活率95％，在贝类粉剂组别的存活率最低(59％)。其中微藻+活性肥水剂组别(d组)的血蚶增重率达到了最高值，是微藻组别的1.7倍；故与单一加牟氏角毛藻组别相比，活性肥水剂和微藻协同下能显著促进血蚶的增重。
[0132]
实施例2：
[0133]
(1)菌种活化培养和发酵种子液的制备，步骤同实施例1。
[0134]
(2)固体培养基的制备，各组分质量占比同实施例1，搅拌均匀。
[0135]
(3)同实施例1，得到s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液；
[0136]
(4)将步骤(1)的发酵种子液和步骤(3)的s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液加入到步骤(2)的固体培养基中，菌液总接种量为6％，其中控制s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液、乳酸菌发酵种子液、产朊假丝酵母菌发酵种子液与枯草芽孢杆菌发酵种子液的体积比分别为：1：1：1：1、2：1：2：2、3：1：3：3、1：2：1：2、2：2：2：3、3：2：3：1、1：3：1：3、2：3：2：1、2：3：
2：3，其中乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌，布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌发酵种子液的体积比为1:1：1：1；控制培养基含水量为45％；
[0137]
按照步骤(2)的固体培养基的质量计：加入1.77g/kg(w/w)硫酸亚铁、16.3mg/kg(w/w)硫酸铜、300mg/kg(w/w)硫酸锰、73.3mg/kg(w/w)硫酸锌和3.3g/kg(w/w)碳酸钙，搅拌均匀，进行厌氧发酵，发酵温度30℃，发酵时间7天，发酵结束后获得不同菌液比例下的肥水剂；
[0138]
测定不同菌液比例条件下所得到肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、粗蛋白含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率，相关含量的测定见检测方法3、4、5、6，结果见表6。结果表明，与未发酵的肥水剂相比，活性肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率均得到了显著的提高。其中，s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液：乳酸菌发酵种子液：产朊假丝酵母菌发酵种子液：枯草芽孢杆菌发酵种子液体积比为2：3：2：1的组别乙酸含量最高的，相比对比例1增加了38.68mg/g；
[0139]
因此后续选择在s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液、乳酸菌发酵种子液、产朊假丝酵母菌发酵种子液、枯草芽孢杆菌发酵种子液的体积比为2：3：2：1比例条件下的活性肥水剂作为实施例2最终的活性肥水剂，用于后续操作，即步骤(5)和步骤(6)。
[0140]
表6.实施例2中活性肥水剂自身产物的测定结果
[0141][0142]
(5)将牟氏角毛藻种子液(制备步骤同实施例1中的操作)以10％的接种量转接至10l的f/2人工海水培养基中，控制初始藻密度为5
×
105个/ml，牟氏角毛藻种子液的制备如下所示，而后将实施例2最终确认的活性肥水剂以0.3g/l添加到牟氏角毛藻的f/2人工海水培养基中，以未发酵肥水剂(对比例1)、不加肥水剂为对照组，调节ph值8.0，培养温度26
±
1℃，光照强度为8000lux，光暗比12h：12h，培养8天后，进行藻细胞计数，计数方法见检测方法1，结果见表7。牟氏角毛藻在添加了活性肥水剂的培养基中的藻密度，是f/2人工海水培养基下的2.16倍。
[0143]
表7.肥水剂对微藻生长的影响
[0144]
实验组别初始藻密度(
×
105个/ml)最终藻密度(
×
107个/ml)
对比例1未发酵肥水剂50.75实施例2活性肥水剂51.73无肥水剂50.80
[0145]
(6)分别将微藻、实施例2的活性肥水剂、贝类粉剂单一/混合投喂血蚶，每7天进行一次全换水，取规格相近的血蚶，平均体质量为7.8
±
0.5g，清洁壳表污物和附着生物后，暂养于水箱3l(长
×
宽
×
高＝35cm
×
24cm
×
11cm)中，暂养期间连续充氧，溶氧≥5mg/l，水温20
±
2℃，添加海水晶，使得盐度为26ppt，ph＝8.0
±
0.2，光照8000lux，光暗比12h：12h；
[0146]
投喂实验分为六个组别：
[0147]
a组：微藻，b组：活性肥水剂，c组：贝类粉剂，d组：微藻+活性肥水剂，e组：微藻+贝类粉剂，f组：空白对照(无任何饵料添加)；
[0148]
投喂量：微藻的投饵量为5
×
105个/ml/d，肥水剂和贝类粉剂的投喂量为0.3g/l；培育30天后记录血蚶的存活率和日增重率，计算方法见检测方法8，结果见表8。
[0149]
说明：微藻为在f/2人工海水培养基中培养至对数生长期的牟氏角毛藻。
[0150]
肥水剂为实施例2制备的高效肥水剂；
[0151]
贝类粉剂直接购买自乐渔科技有限公司。
[0152]
表8实施例2中不同饵料对血蚶的生长的影响
[0153]
实验组别a组b组c组d组e组f组血蚶的存活率(％)10080701007540血蚶的增重率(％)4437.441.5
[0154]
结论：由表8可知，血蚶在微藻组别和微藻+活性肥水剂组别获得了最大的存活率100％。微藻+活性肥水剂组别(d组)的血蚶增重率达到了最高值，是微藻组别的1.85倍。故与单一加牟氏角毛藻组别相比，活性肥水剂和微藻协同下能显著促进血蚶的增重。
[0155]
实施例3：
[0156]
(1)菌的活化培养和发酵种子液的制备，同实施例1；
[0157]
(2)固体培养基的制备，各组分质量占比同实施例1；
[0158]
(3)同实施例1的操作，得到s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液；
[0159]
(4)将步骤(1)的发酵种子液和步骤(3)的s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液加入到步骤(2)的固体培养基中，菌液接种量为0％、3％、6％、10％、12％、20％，s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液、乳酸菌发酵种子液、产朊假丝酵母菌发酵种子液、枯草芽孢杆菌发酵种子液的体积比为2：3：2：1，乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌，其中布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌发酵种子液的体积比为1:1：1：1，控制含水量为45％；按照步骤(2)的固体培养基的质量计：加入1.77g/kg(w/w)硫酸亚铁、16.3mg/kg(w/w)硫酸铜、300mg/kg(w/w)硫酸锰、73.3mg/kg(w/w)硫酸锌和3.3g/kg(w/w)碳酸钙，搅拌均匀，进行厌氧发酵，发酵温度30℃，发酵时间7天，发酵结束后获得在不同菌液接种量条件下的活性肥水剂；
[0160]
测定不同肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、粗蛋白含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率，相关含量的测定见检测方法3、4、5、6，结果见表9。结果表明：与未发酵的肥水剂相比，活性肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率均得到了显著的提高。其中，菌液接种量为12％时，乙酸含量最高，相
比对比例1增加了51.42mg/g，故后续选择12％的菌液接种量条件下得到的活性肥水剂作为实施例3最终的活性肥水剂，用于后续操作，即步骤(5)和步骤(6)。
[0161]
表9.实施例3中活性肥水剂自身产物的测定结果
[0162][0163][0164]
(5)将牟氏角毛藻种子液(制备步骤同实施例1中的操作)以10％的接种量转接至10l的f/2人工海水培养基中，控制初始藻密度为5
×
105个/ml；
[0165]
将实施例3最终的活性肥水剂以0.3g/l添加到牟氏角毛藻的f/2人工海水培养基中，以未发酵肥水剂、不加肥水剂为对照组，调节ph值8.0，培养温度26
±
1℃，光照强度为8000lux，光暗比12h：12h，培养8天后，进行藻细胞计数，计数方法见检测方法1，结果见表10。牟氏角毛藻在添加了活性肥水剂的培养基中的藻密度，是f/2人工海水培养基下的2.28倍。
[0166]
表10.肥水剂对微藻生长的影响
[0167]
实验组别初始藻密度(
×
105个/ml)最终藻密度(
×
107个/ml)对比例1未发酵肥水剂50.75实施例3活性肥水剂51.82无肥水剂50.80
[0168]
(6)分别将微藻、肥水剂、贝类粉剂单一/混合投喂血蚶，每7天进行一次全换水，取规格相近的血蚶，平均体质量为7.8
±
0.5g，清洁壳表污物和附着生物后，暂养于水箱3l(长
×
宽
×
高＝35cm
×
24cm
×
11cm)中，暂养期间连续充氧，溶氧≥5mg/l，水温20
±
2℃，添加海水晶，使得盐度为26ppt，ph＝8.0
±
0.2，光照8000lux，光暗比12h：12h；
[0169]
投喂实验分为六个组别：
[0170]
a组：微藻，b组：活性肥水剂，c组：贝类粉剂，d组：微藻+活性肥水剂，e组：微藻+贝类粉剂，f组：空白对照(无任何饵料添加)；
[0171]
投喂量：微藻的投饵量为5
×
105个/ml/d，肥水剂和贝类粉剂的投喂量为0.3g/l；培育30天后记录血蚶的存活率和日增重率，计算方法见检测方法8，结果见表11。
[0172]
表11实施例3中不同饵料对血蚶的生长的影响
[0173]
实验组别a组b组c组d组e组f组
血蚶的存活率(％)10085701007030血蚶的增重率(％)442.583.52
[0174]
结论：由表11可知，血蚶在微藻组别和微藻+活性肥水剂组别获得了最大的存活率100％。微藻+活性肥水剂组别(d组)的血蚶增重率达到了最高值，是微藻组别的2倍。故与单一加牟氏角毛藻组别相比，活性肥水剂和微藻协同下能显著促进血蚶的增重。
[0175]
实施例4：
[0176]
(1)菌的活化培养和发酵种子液的制备同实施例1。
[0177]
(2)固体培养基的制备，各组分质量占比同实施例1。
[0178]
(3)同实施例1的操作；得到s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液；
[0179]
(4)将步骤(1)的发酵种子液到步骤(2)的固体培养基中，菌液接种量为12％；其中s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液、乳酸菌发酵种子液、产朊假丝酵母菌发酵种子液、枯草芽孢杆菌发酵种子液的体积比为2：3：2：1，乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌，其中布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌发酵种子液的体积比为1:1：1：1；控制含水量为45％；按照步骤(2)的固体培养基的质量计：加入1.59g/kg(w/w)硫酸亚铁、14.7mg/kg(w/w)硫酸铜、270mg/kg(w/w)硫酸锰、66mg/kg(w/w)硫酸锌和3g/kg(w/w)碳酸钙，0％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％(w/w)亚硫酸钠搅拌均匀，搅拌均匀，进行厌氧发酵，发酵温度30℃，发酵时间7天，发酵结束后获得高效肥水剂，其中，不加亚硫酸钠的肥水剂为对照组；
[0180]
测定肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、粗蛋白含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率，相关含量的测定见检测方法3、4、5、6，结果见表12。结果表明：与不添加亚硫酸钠的活性肥水剂相比，添加了0.05-1％的亚硫酸钠的活性肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率均得到了显著的提高，其中当添加0.1％的亚硫酸钠时，乙酸含量最高，故后续选择0.1％的亚硫酸钠添加量条件下得到的活性肥水剂作为实施例4的活性肥水剂，用于后续操作，即步骤(5)和步骤(6)。
[0181]
表12.实施例4中活性肥水剂自身产物的测定结果
[0182]
亚硫酸钠添加量(％)00.050.10.512乙酸含量(mg/g)51.8752.4253.3952.9852.7950.12总有机酸含量(mg/g)59.9859.2159.8560.7661.0361.60粗蛋白含量％29.3229.4129.5429.7429.8329.09小肽含量(％)32.8933.5434.6536.9838.9937.54游离氨基酸量(mg/g)29.0729.9830.2130.2431.4331.02铁的螯合率(％)84.3289.8390.2192.3293.4392.10钙的螯合率(％)85.5688.5489.3290.3292.2190.21铜的螯合率(％)89.8990.0290.1193.4295.5492.42锰的螯合率(％)85.5488.8488.9990.2291.9991.01锌的螯合率(％)82.3283.4384.5485.5588.0186.53
[0183]
对比例4：操作同实施例4，区别仅为不加入亚硫酸钠。
[0184]
(5)将牟氏角毛藻种子液(制备步骤同实施例1的操作)以10％的接种量转接至10l的f/2人工海水培养基中，控制初始藻密度为5
×
105个/ml；将步实施例4得到的活性肥水剂
以0.3g/l添加到牟氏角毛藻的f/2人工海水培养基中，以未加入亚硫酸钠的肥水剂(对比例4)、加入0.1％(w/w)亚硫酸钠的肥水剂(实施例4)、不加肥水剂为对照组，调节ph值8.0，培养温度26
±
1℃，光照强度为8000lux，光暗比12h：12h，培养8天后，进行藻细胞计数，计数方法见检测方法1，结果见表13。牟氏角毛藻在添加了活性肥水剂的培养基中的藻密度，是f/2人工海水培养基下的2.85倍。
[0185]
表13.肥水剂对微藻生长的影响
[0186][0187]
(6)分别将微藻、肥水剂、贝类粉剂单一/混合投喂血蚶，每7天进行一次全换水，取规格相近的血蚶，平均体质量为7.8
±
0.5g，清洁壳表污物和附着生物后，暂养于水箱3l(长
×
宽
×
高＝35cm
×
24cm
×
11cm)中，暂养期间连续充氧，溶氧≥5mg/l，水温20
±
2℃，添加海水晶，使得盐度为26ppt，ph＝8.0
±
0.2，光照8000lux，光暗比12h：12h；
[0188]
投喂实验分为六个组别：
[0189]
a组：微藻，b组：活性肥水剂(实施例4)，c组：贝类粉剂，d组：微藻+活性肥水剂，e组：微藻+贝类粉剂，f组：空白对照(无任何饵料添加)；
[0190]
投喂量：微藻的投饵量为5
×
105个/ml/d，肥水剂和贝类粉剂的投喂量为0.3g/l。
[0191]
培育30天后记录血蚶的存活率和日增重率，计算方法见检测方法8，结果见表14。
[0192]
表14实施例4中不同饵料对血蚶的生长的影响
[0193]
实验组别a组b组c组d组e组f组血蚶的存活率(％)10090701007030血蚶的增重率(％)4538.531.5
[0194]
结论：由表14可知，血蚶在微藻组别和微藻+活性肥水剂组别获得了最大的存活率100％。微藻+活性肥水剂组别的血蚶增重率达到了最高值，是微藻组别的2.125倍。故与单一加牟氏角毛藻组别相比，活性肥水剂和微藻协同下能显著促进血蚶的增重。
[0195]
实施例5：
[0196]
(1)布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粟酒裂殖酵母工程菌的活化培养和发酵种子液的制备，步骤同实施例1。
[0197]
(2)固体培养基的制备，各组分质量占比同实施例1。
[0198]
(3)同实施例1；得到s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液；
[0199]
(4)将步骤(1)的发酵种子液到步骤(2)的固体培养基中，菌液接种量为12％，s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液、乳酸菌发酵种子液、产朊假丝酵母菌发酵种子液、枯草芽孢杆菌发酵种子液的体积比为2：3：2：1，控制含水量为45％；按照步骤(2)的固体培养基
的质量计：加入1.77g/kg(w/w)硫酸亚铁、16.3mg/kg(w/w)硫酸铜、300mg/kg(w/w)硫酸锰、73.3mg/kg(w/w)硫酸锌和3.3g/kg(w/w)碳酸钙，0.1％(w/w)亚硫酸钠搅拌均匀，搅拌均匀，进行厌氧发酵，发酵温度30℃，发酵时间7天，发酵结束后获得高效肥水剂。
[0200]
测定肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、粗蛋白含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率，相关的含量测定见检测方法3、4、5、6，结果见表15。结果表明：与未发酵的肥水剂相比，活性肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率均得到了显著的提高。
[0201]
表15.实施例5中活性肥水剂自身产物的测定结果
[0202]
检测指标活性肥水剂未发酵肥水剂乙酸含量(mg/g)53.390.45总有机酸含量(mg/g)59.850.98粗蛋白含量％29.5429.87小肽含量(％)34.6514.23游离氨基酸量(mg/g)30.215.43铁的螯合率(％)90.210钙的螯合率(％)89.320铜的螯合率(％)90.110锰的螯合率(％)88.990锌的螯合率(％)84.540
[0203]
(5)将牟氏角毛藻种子液(制备步骤同实施例1)以10％的接种量转接至10l的f/2人工海水培养基中，控制初始藻密度为5
×
105个/ml；
[0204]
而后将实施例5中得到的活性肥水剂以0、0.3、0.6、1.2、2.7g/l添加到牟氏角毛藻的f/2人工海水培养基中，以未活性肥水剂(对比例1)为对照组，调节ph值8.0，培养温度26
±
1℃，光照强度为8000lux，光暗比12h：12h，并马上测定活性肥水剂的乙酸、总有机酸含量、游离氨基酸量、铁、钙、铜、锰、锌含量，测定方法见检测方法6，培养8天后，进行藻细胞计数，计数方法见检测方法1，藻密度的测定结果见表16。结果表明：牟氏角毛藻随着活性肥水剂的添加，藻密度增高，其中在添加了0.6g/l活性肥水剂的培养基中的藻密度达到最高，是f/2人工海水培养基下的3.35倍。在2.7g/l活性肥水剂的培养基中的藻密度下降，甚至低于对照组。活性肥水剂相关含量的测定结果见表17，结果表明：当添加0.3-1.2g/l的活性肥水剂时，培养基中的铁、钙、铜、锰、锌浓度刚好满足牟氏角毛藻的生长需求，而当加入2.7g/l活性肥水剂时，培养基中铜、锰、锌的浓度过高，反而会抑制牟氏角毛藻的生长(牟氏角毛藻最适的矿物质含量范围见图4)；因此，活性肥水剂的添加量在0.3-1.2g/l时，最终藻密度均高于未发酵肥水剂投喂时的藻密度，其中，在0.6g/l时藻密度最高，因此，后续选择0.6g/l作为活性肥水剂的投喂量，用于步骤(5)。
[0205]
表16肥水剂对微藻生长的影响
[0206]
肥水剂投喂量(g/l)初始藻密度(
×
105个/ml)最终藻密度(
×
107个/ml)050.790.352.250.652.65
1.251.932.750.75
[0207]
表17微藻培养基中不同活性肥水剂的相关含量的测定
[0208]
肥水剂投喂量g/l00.30.61.22.7乙酸含量(mg)015.71731.43462.868141.453总有机酸含量(mg)017.95535.9171.82161.595游离氨基酸量(mg)09.06318.12636.25281.567铁(mg/l)00.531.062.124.77钙(mg/l)01249铜(ug/l)04.99.819.644.1锰(ug/l)090180360810锌(ug/l)0224488198
[0209]
(6)分别将微藻、肥水剂、贝类粉剂单一/混合投喂血蚶，每7天进行一次全换水，取规格相近的血蚶，平均体质量为7.8
±
0.5g，清洁壳表污物和附着生物后，暂养于水箱3l(长
×
宽
×
高＝35cm
×
24cm
×
11cm)中，暂养期间连续充氧，溶氧≥5mg/l，水温20
±
2℃，添加海水晶，使得盐度为26ppt，ph＝8.0
±
0.2，光照8000lux，光暗比12h：12h；
[0210]
投喂实验分为六个组别：
[0211]
a组：微藻，b组：活性肥水剂，c组：贝类粉剂，d组：微藻+活性肥水剂，e组：微藻+贝类粉剂，f组：空白对照(无任何饵料添加)；
[0212]
投喂量：
[0213]
微藻的投饵量为5
×
105个/ml/d，肥水剂和贝类粉剂的投喂量为0.6g/l。
[0214]
培育30天后记录血蚶的存活率和日增重率，计算方法见检测方法8，结果见表18。
[0215]
表18实施例5中不同饵料对血蚶的生长的影响
[0216]
实验组别a组b组c组d组e组f组血蚶的存活率(％)100100501006525血蚶的日增重率(％)45310.52.51
[0217]
结论：由表18可知，血蚶在微藻组别和微藻+活性肥水剂组别获得了最大的存活率100％。微藻+活性肥水剂组别的血蚶增重率达到了最高值，是微藻组别的2.625倍。故与单一加牟氏角毛藻组别相比，活性肥水剂和微藻协同下能显著促进血蚶的增重。
[0218]
总结：
[0219]
通过实施例1初步试验可以看出，活性肥水剂的乙酸含量、总有机酸含量、小肽含量、氨基酸含量、铜、铁、锰、锌、钙的螯合率均得到了显著的提高；牟氏角毛藻在添加了活性肥水剂的培养基中的藻密度为1.55
×
107个/ml，是f/2人工海水培养基(无肥水剂)下的1.96倍。血蚶的增重率在牟氏角毛藻+活性肥水剂组别的血蚶增重率达到了最高值6.8％，是单一牟氏角毛藻组别的1.7倍；说明按照本发明所述方法制备的活性肥水剂取得了良好的技术效果。
[0220]
而后，对活性肥水剂进行进一步优化，实施例2改变了s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液：乳酸菌种子液：酵母菌种子液：芽孢菌种子液的比例，结果发现当s.pombe-prep-kerq7的发酵上清液、乳酸菌发酵种子液、产朊假丝酵母菌发酵种子液、枯草芽孢杆菌发酵
种子液的体积比为2：3：2：1进行发酵，其他发酵条件同实施例1，活性肥水剂的乙酸含量进一步提高，从实施例1的35.56mg/g升至39.13mg/g。牟氏角毛藻在添加了该比例的活性肥水剂的培养基中的藻密度为1.73
×
107个/ml，是f/2人工海水培养基(无肥水剂)下的2.16倍。该结果比实施例1高了1.12倍；并且，血蚶的增重率在牟氏角毛藻+活性肥水剂组别的血蚶增重率达到了最高值7.4％，是单一牟氏角毛藻组别的1.85倍，并且比实施例1高了1.09倍；说明菌液比例对实验结果有显著的影响。
[0221]
进一步，在实施例2的发酵条件上，实施例3改变了总菌液接种量，得到总菌液接种量12％时，活性肥水剂的乙酸含量进一步提高，从实施例2的39.13mg/g升至51.87mg/g，效果十分显著。牟氏角毛藻在添加了12％的总菌液的活性肥水剂的培养基中的藻密度为1.82
×
107个/ml，是f/2人工海水培养基(无肥水剂)下的2.28倍。该结果比实施例2高了1.05倍。并且，血蚶的增重率在牟氏角毛藻+活性肥水剂组别的血蚶增重率达到了最高值8％，是单一牟氏角毛藻组别的2倍，比实施例2高了1.08倍；进一步说明总菌液接种量对实验结果有至关重要的影响。
[0222]
进而，由于原料中的羽毛粉和玉米蛋白粉含有丰富的二硫键影响肥水剂的消化率，故在实施例3的发酵条件上，实施例4添加了不同含量的二硫键水解剂亚硫酸钠，发现其用量过多或过少均不能良好的结果，只有在亚硫酸钠的添加量为0.1％时，采取的了显著的效果，从实施例3的51.87mg/g升至53.39mg/g。牟氏角毛藻在添加了0.1％亚硫酸钠的活性肥水剂的培养基中的藻密度为2.25
×
107个/ml，是f/2人工海水培养基(无肥水剂)下的2.85倍。该结果比实施例3高了1.24倍。并且，血蚶的增重率在牟氏角毛藻+活性肥水剂组别的血蚶增重率达到了最高值8.5％，是单一牟氏角毛藻组别的2.125倍，并且比实施例3高了1.06倍。
[0223]
最后，进行实际投喂实验，实施例5在牟氏角毛藻的培养中，改变了活性肥水剂的投喂量；结果表明投喂量也是需要控制的，在0.3-1.2g/l时，牟氏角毛藻的藻密度均高于无活性肥水剂投喂时，其中，在0.6g/l时藻密度最高值2.65
×
107个/ml，是f/2人工海水培养基(无肥水剂)下的3.35倍。该结果比实施例4高了1.18倍。因此，后续选择0.6g/l作为活性肥水剂的投喂量试验。而后，血蚶的增重率在牟氏角毛藻+活性肥水剂组别的血蚶增重率达到了最高值10.5％，是单一牟氏角毛藻组别的2.625倍，并且比实施例4高了1.24倍，比未优化的实施例1高了1.54倍。从而，活性肥水剂既能显著促进牟氏角毛藻生长，也能提高血蚶的存活率和增重率。
[0224]
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
[0225]
本发明涉及的序列如下：
[0226]
1.seq id no.1
[0227]
gaacgtgtttctaagactgattctgaaaagtcttacattgttggttttaaagcttctgct
[0228]
actactaattcttctaaaaaacaagctgttattcaaaacggtggtaaattagaaaagcaa
[0229]
taccgtcttattaatgctgctcaagttactatgtctgaacaagctgctaaaaaacttgaa
[0230]
catgatccttctattgcttacgttgaagaagatcataaagctgaagcttatgctcaaact
[0231]
gttccttatggtcaagaacaaattaaagatcctgctgttcatgctcaaggttataaaggt
[0232]
gctaatgttaaagttgctgttttggatactggtattcatgctgctcatcctgatttaaatg
[0233]
ttgctggtggtgcttcttttgctccttctgaacctaatgctactcaagattttcaatctca
[0234]
tgctcaacatgttgctggtactattgctgctttagataatactattggtgttcttggtgtt
[0235]
gctccttctgcttctttgtacgctgttaaggttcttgatcgtaatggtgatggtcaatact
[0236]
cttggattatttctggtattgaatgggctgttgctaacaacatggatgttattaacatgtc
[0237]
tcttggtggtcctaatggttctactgctttgaagaacgctgttgatactgctaacaatcg
[0238]
tggtgttgttgttgttgctgctgctggtaattctggttcttttggttctacttctactgtt
[0239]
ggttatcctgctaaatatgattctactggtgctgttgctaacgttaactctaacaacgtta
[0240]
acaattcttcttcttctgctggtcctgaattagatgtttctgctcctggtacttctattctt
[0241]
tctactgttccttcttctggttatacttcttatactgctacttctatggcttctcctcatgtt
[0242]
gctggtgctgctgctgttattctttctaagtaccctaacttgactaattctcaagttcgtc
[0243]
aacaattggaaaatactgctactcctttaggagattctttttactacggaaagggtttga
[0244]
ttaatgttcaagctgcttctaattaa
[0245]
2.seq id no.2
[0246]
ervsktdseksyivgfkasattnsskkqaviqnggklekqyrlinaaqvtmseqaakklehdpsiayveedhkaeayaqtvpygqeqikdpavhaqgykganvkvavldtgihaahpdlnvaggasfapsepnatqdfqshaqhvagtiaaldntigvlgvapsaslyavkvldrngdgqyswiisgiewavannmdvinmslggpngstalknavdtannrgvvvvaaagnsgsfgststvgypakydstgavanvnsnnvnnssssagpeldvsapgtsilstvpssgytsytatsmasphvagaaavilskypnltnsqvrqqlentatplgdsfyygkglinvqaasn。

技术特征：
1.一种活性肥水剂的生产方法，其特征在于，制备步骤如下：(1)将血粉、羽毛粉、玉米蛋白粉、次粉和麸皮混合，搅拌均匀，制成固体培养基；(2)选择乳酸菌、酵母菌、芽孢菌接种到相应的培养基进行活化培养并得到相应的乳酸菌、酵母菌、芽孢菌发酵种子液；所述的乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌，酵母菌为产朊假丝酵母菌，芽孢菌为枯草芽孢杆菌；(3)将来源于bacillus tequilensis strain q7的角蛋白酶基因序列根据粟酒裂殖酵母菌密码子偏好性进行优化，得到编码角蛋白酶的基因，核苷酸序列如seq id no.1所示；以该基因为模板进行pcr扩增，于穿梭质粒载体prep连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用醋酸锂转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组角蛋白酶酵母工程菌，即s.pombe-prep-kerq7；培养所述的重组角蛋白酶酵母工程菌收集菌液，所述菌液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的角蛋白酶；将菌液通过离心固液分离后收集上清液，即为粗酶液；(4)将步骤(2)的乳酸菌、酵母菌、芽孢菌发酵种子液和步骤(3)的s.pombe-prep-kerq7培养后的菌液或粗酶液接种到步骤(1)的固体培养基中，然后再加入矿物质、亚硫酸钠、水搅拌均匀，发酵结束后获得活性肥水剂；其中矿物质为硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌和碳酸钙。2.根据权利要求1所述的一种活性肥水剂的生产方法，其特征在于，步骤(1)所述的用量为血粉3-10％、羽毛粉3-10％、玉米蛋白粉3-10％、次粉35-45％，麸皮35-45％。3.根据权利要求1所述的一种活性肥水剂的生产方法，其特征在于，步骤(3)所述培养重组角蛋白酶酵母工程菌温度为30-37℃，转速为180-220rpm，时间为24～48h；所述离心的条件为5000-8000rpm，5-10min。4.根据权利要求1所述的一种活性肥水剂的生产方法，其特征在于，步骤(4)所述的s.pombe-prep-kerq7以粗酶液方式添加时，添加量占步骤(1)固体培养基质量的25-45％；以菌液添加时，其与乳酸菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液、芽孢菌发酵种子液的总菌液接种量为10～20％；其中s.pombe-prep-kerq7的菌液与乳酸菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和芽孢菌发酵种子液的体积比为1-3：1-3：1-3：1-3；所述乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌中的一种或多种混合，当多种混合时其体积比为1。5.根据权利要求4所述的一种活性肥水剂的生产方法，其特征在于，所述s.pombe-prep-kerq7的菌液与乳酸菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和芽孢菌发酵种子液的体积比为2：3：2：1。6.根据权利要求1所述的一种活性肥水剂的生产方法，其特征在于，步骤(4)中控制培养基的含水量为25％-45％，发酵的时间为5-12天，发酵的温度20-37℃。7.根据权利要求1所述的一种活性肥水剂的生产方法，其特征在于，以固体培养基的质量计，步骤(4)所述亚硫酸钠的添加量为0.1～2％；硫酸亚铁的添加量为1.77-15.75g/kg、硫酸铜的添加量为16.3-94.7mg/kg、硫酸锰的添加量为300-1200mg/kg、硫酸锌的添加量为73.3-293.3mg/kg、碳酸钙的添加量为3.3-33g/kg。8.根据权利要求1～7任一项所述的方法制备的活性肥水剂。9.根据权利要求8所述的活性肥水剂用于贝藻套养的用途。10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述贝藻套养包括牟氏角毛藻和血蚶；具
体操作是：活性肥水剂直接抛洒养殖池，每隔1～10天抛洒一次，每次的施用量为0.3g/l-1.2g/l。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种活性肥水剂的生产方法及在贝藻体系中的应用。步骤为:本发明以血粉搭配羽毛粉、玉米蛋白粉作为发酵原料，再以藻类生长为指标，筛选有机碳源中的乙酸作为主要碳源，并将产乙酸较高的布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌和产朊假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌作为发酵菌种，再将一种酸性条件下具有高活性的角蛋白酶基因kerQ7克隆到食品级粟酒裂殖酵母中，菌酶协同进行好氧及厌氧发酵，所得的肥水剂中乙酸、小肽、氨基酸、矿物质螯合率含量高，能够显著促进牟氏角毛藻和血蚶的生长，并能改善养殖池水质，取得了显著的技术效果。取得了显著的技术效果。取得了显著的技术效果。


技术研发人员：陈华友 李柯仪 夏雨桐 王振 陈华撑
受保护的技术使用者：陈华友
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/9/23