用于转座酶定向进化的辅助P-质粒、转座酶定向进化的系统及Tn5转座酶突变体的制作方法

用于转座酶定向进化的辅助p-质粒、转座酶定向进化的系统及tn5转座酶突变体
技术领域
1.本发明专利涉及一种用于转座酶定向进化的辅助p-质粒、转座酶定向进化的系统及tn5转座酶突变体，属于生物技术领域。


背景技术：

2.转座酶在自然界中广泛存在，被认为是基因组重排和进化的重要驱动力之一。tn5转座酶是一种常见的转座酶，是一步酶法建库技术中的核心蛋白，通过体外装配形成tn5蛋白与接头序列的多元复合物，依赖转座酶的“剪切与粘贴”活性，在打断基因组dna的同时将特异性接头加装至每一个dna片段的两端。接头序列通常由三部分组成，包括用于dna片段pcr扩增及测序的引物结合序列、用于样本溯源的barcode标签、以及被tn5转座酶特异性识别的长为19bp的me序列(agatgtgtataagagacag)。受二代测序单次读长的限制，打断的基因组片段长度在300bp左右最佳。但由于酶活性、装配体系等因素的影响，基因组不能被彻底打断，大量过长片段的存在严重损伤了酶法建库的质量。同时，由于野生型tn5转座酶蛋白本身存在一定的偏好性，建库的均一性和覆盖度不能满足需求。
3.另一方面，随着cut&tag技术的兴起和广泛应用，人们对tn5转座酶的“剪切与粘贴”活性提出了更高的要求。在cut&tag技术中，利用抗体与靶蛋白(抗原)的特异性识别与结合，以及非特异性抗体结合蛋白与抗体恒定区的结合，引导tn5转座酶定向切割与靶蛋白存在相互作用的dna序列并加装接头以实现定向建库。随后通过测序即可鉴定靶蛋白在基因组上的结合位点。与传统的chip-seq等技术相比，cut&tag的dna投入量更低、实验周期更短，加上抗原抗体的特异性亲和及接头pcr的特异性扩增，测序的信噪比更高，可更好地用于表观遗传学、大分子间的相互作用等领域的研究。
4.因此，开发一种高效的酶活性筛选方法，以获得一些酶活性更高的转座酶，就显得尤为重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用于转座酶定向进化的辅助p-质粒，可以辅助快速筛选出酶活性更高的转座酶。
6.本发明采用的技术方案为：一种用于转座酶定向进化的辅助p-质粒，所述辅助p-质粒包含受诱导表达的piii neg基因，用于表达拮抗蛋白piii neg；以及转座酶特异性识别序列，并实现转座酶活性与噬菌体拮抗蛋白piii neg表达水平的关联。
7.优选的，在受诱导表达的piii neg基因启动子的侧翼加入所述转座酶特异性识别序列。
8.优选的，所述转座酶为tn5转座酶，所述转座酶特异性识别序列的序列为agatgtgtataagagacag。
9.优选的，所述转座酶特异性识别序列成对存在，分列所述受诱导表达的piii neg
selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution.nat chem biol.2014 mar；10(3):216-22.)，通过在piii neg基因启动子侧翼加入转座酶特异性识别序列，将转座酶的活性与子代噬菌体的生长相关联。当细胞内表达高活性的转座酶突变体时，piii neg蛋白由于启动子缺失而表达量降低，piii蛋白在细胞内的丰度将超过piii neg，进而实现子代噬菌体的正常繁殖。在筛选过一定代次后，可通过降低脱水四环素浓度及提高iptg浓度来增加筛选压力。此时piii的表达下调，piii neg的表达上调，子代噬菌体需要更高活性的转座酶才能确保子代噬菌体的繁殖，从而筛选出活性更高的转座酶。本发明还借助易错pcr的方法构建了表达不同转座酶突变体的噬菌体文库，以实现对氨基酸突变频率的控制，并大幅缩短传代周期。利用上述定向进化的方法，获得一个新的tn5转座酶的突变体，与野生型tn5转座酶相比，其核酸酶活性显著提高。
附图说明
29.图1：tn5转座酶进化原理示意图；
30.图1中p+代表可诱导表达噬菌体衣壳蛋白piii的质粒，其中piii由脱水四环素诱导表达；phage代表改造后的噬菌体基因组，tn5 dna序列取代了piii基因序列，受giii启动子控制；p-代表可表达拮抗蛋白piii neg的质粒，后者表达盒上游存在两串tn5识别序列me以及lac启动子，受iptg诱导表达。c
piii
及c
neg
分别代表细胞内piii和piii neg蛋白的浓度，仅当piii浓度大于piii neg(即c
piii
》c
neg
)时，噬菌体可在细胞内正常繁殖。
31.图2：转座酶表达测试；
32.图2中0、0.5、1.0分别代表诱导tn5表达的iptg诱导浓度0、0.5mm、1.0mm。
33.图3：转座酶胞内活性测试；
34.图3中δrfi代表相比于未诱导时荧光强度差异的绝对值；横坐标代表不同终浓度的l-阿拉伯糖；t50为表达亲本转座酶(seq.no.1)的大肠杆菌，t51为表达富集后的转座酶(seq.no.2)的大肠杆菌。
35.图4：t51转座酶的亲和纯化；
36.图4中s代表超声离心后上清，p代表超声离心后沉淀；1-12代表0-100％梯度洗脱收集的洗脱液。
37.图5：t50转座酶的亲和纯化；
38.图5中s代表超声离心后上清，p代表超声离心后沉淀；1-12代表0-100％梯度洗脱收集的洗脱液。
39.图6：转座酶体外活性测试；
40.图6中0～5.0代表转座酶的投入量分别为0～5.0μl。
具体实施方式
41.下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
42.除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
43.下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
44.实施例1：
45.1、按图1所示构建辅助质粒(p+质粒及p-质粒)(质粒模板可采用miller sm et al.phage-assisted continuous and non-continuous evolution.nat protoc.2020 dec；15(12):4101-4127.公开的模板)，其中p+代表可诱导表达噬菌体衣壳蛋白piii的质粒，p+质粒包含四环素启动子，可诱导噬菌体衣壳蛋白piii表达。p-代表可表达拮抗蛋白piii neg的质粒，p-质粒包含tn5转座酶识别区me，其序列为agatgtgtataagagacag(seq id no.3)，并实现转座酶活性与噬菌体拮抗蛋白piii neg表达水平的关联；
46.2、将步骤1的辅助质粒(p+质粒及p-质粒)同时转化至宿主大肠杆菌细胞，并涂布于氯霉素及羧苄青霉素双抗lb平板；
47.3、用两对引物分别扩增除piii基因以外的m13噬菌体基因组区域(引物m13g-f/r)及tn5蛋白编码区(引物pt51/pt52)，其中tn5片段pcr扩增时添加0.1mm氯化锰(还可以是其他二价金属离子竞争试剂)提高错配率，最终形成单条序列上存在1～5个氨基酸突变的随机突变文库。tn5片段pcr反应体系如下：
[0048][0049][0050]
pt51:ggaaaaaaaaaatgatcacgagtgccttacatcgc(seq id no.4)
[0051]
pt52:ctccttctagattagattttgataccctgggccat(seq id no.5)
[0052]
m13g-f:gggtatcaaaatctaatctagaaggagattttcaacatg(seq id no.6)
[0053]
m13g-r:ggcactcgtgatcattttttttttcctttactccaaaaa(seq id no.7)
[0054]
4、pcr产物回收后参照翌圣生物hieffplus one step cloning kit试剂盒操作手册进行同源重组，重组产物转化至包含了p+及p-质粒的大肠杆菌并诱导piii表达，于37℃、200rpm培养过夜；
[0055]
5、4℃、15000rpm离心10min后分离上清，即为包含tn5突变体的噬菌体文库，可直接侵染大肠杆菌；
[0056]
6、取步骤2的转化子接种于含相应抗生素的4ml液体培养基中，加入50μl步骤5的上清液，37℃、200rpm培养3h；
[0057]
7、将培养液4℃、15000rpm离心10min后分离上清，取50μl上清液接种至新鲜培养液中37℃、200rpm培养3h；
[0058]
8、同时取10μl上清液与新鲜菌液、半固体培养基充分混合倒于固态平板上层，待凝固后37℃倒置培养过夜；
[0059]
9、对双层平板上的噬菌斑进行计数，用于估算传代过程培养液中噬菌体滴度；
[0060]
10、用枪头分别挑取适量噬菌斑在配好的pcr反应buffer中浸泡20s以上，加入taq dna聚合酶在pcr仪中扩增tn5 orf区域并测序；
[0061]
11、针对测序结果进行富集分析，统计各突变点出现的频率变化；
[0062]
12、重复7-11步骤传代5次以上，直至突变位点的富集程度超过80％，传代过程筛选压力为诱导衣壳蛋白piii表达的脱水四环素浓度，脱水四环素(atc)浓度越来越小，其浓度变化见下表：
[0063][0064][0065]
13、根据测序信息，输出优势突变体氨基酸序列，如seq id no.2所示。
[0066]
实施例2：
[0067]
1、以丰度最高的噬菌体基因组为模板扩增tn5突变体的序列，将产物连接至pet21b(+)质粒的ndei/xhoi酶切位点之间；
[0068]
引物如下：21-f：agggcatgatcacgagtgccttacatcgc(seq id no.8)
[0069]
21-r：gtggtggtggtgctcgagttagattttgataccc(seq id no.9)
[0070]
2、将连接物转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞内，挑取阳性转化子进行序列测试，确保氨基酸序列正确。该阳性转化子即包含目的质粒pet21b-t51；
[0071]
3、接种目的克隆于37℃、200rpm过夜培养；
[0072]
4、取适量菌液涂布于固体培养基上，次日随机挑取3个克隆进行蛋白表达测试。如图2所示，图2中0、0.5、1.0分别代表诱导tn5表达的iptg诱导浓度0、0.5mm、1.0mm。3#克隆在37℃诱导4h后目的蛋白的表达水平优于其他克隆，其中iptg浓度为0.5mm或1.0mm对表达水平无显著影响；
[0073]
5、根据表达测试结果，选定最优诱导条件如下表。挑取3#克隆及进化母本即野生型tn5转座酶的表达株(野生型tn5转座酶的序列如seq id no.1所示)接种，并按照200ml规格进行发酵；
[0074][0075]
6、诱导结束后测定od值并在4℃、5000rpm条件下离心20min收集菌体。
[0076]
实施例3：
[0077]
1、将已构建的可表达tn5转座酶突变体t51的pet21b-t51，及可表达野生型tn5转座酶t50的pet21b-t50质粒分别与egfp报告质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布平板后倒置培养过夜；
[0078]
2、分别挑取单克隆进行菌落pcr鉴定；
[0079]
3、各取3个阳性克隆接种于新鲜的4ml液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养；
[0080]
4、按1％的比例分别取3个克隆的培养物，各接种至5支4ml新鲜液体培养基中，编号1～5#，37℃、200rpm培养至od
600
值约0.5时添加终浓度为0.5mm iptg诱导转座酶表达，1h后再添加梯度浓度(终浓度：1#：0；2#：0.05
‰
；3#：0.10
‰
；4#：0.15
‰
；5#：0.20
‰
)的阿拉伯糖诱导egfp表达；
[0081]
5、培养3h后测定菌液浓度，各取含0.1od菌体的菌液至1.5ml离心管内，4℃、5000rpm离心5min后去除上清；
[0082]
6、向沉淀中加入500μl 1*pbs使菌体重悬，4℃、5000rpm离心5min后去除上清；
[0083]
7、重复步骤5一次；
[0084]
8、用100μl 1*pbs将菌体重悬，设定参数ex/em＝488nm/507nm检测菌体荧光信号，并将各梯度下荧光强度减去第一组(1#管)的荧光强度。如图3所示，图3中δrfi代表相比于未诱导时荧光强度差异的绝对值；横坐标代表不同终浓度的l-阿拉伯糖；t50为表达亲本转座酶(seq id no.1)的大肠杆菌，t51为表达富集后的转座酶(seq id no.2)的大肠杆菌。在不同诱导梯度下t51相比于非诱导条件时的信号差均大于t50，即表明转座酶突变体体内切割活性显著高于亲本转座酶。具体的方法可参见zl 202210500786.8专利中公开的方法。
[0085]
实施例4：
[0086]
1、将已构建的可表达tn5突变体的pet21b-t51，及可表达亲本tn5的pet21b-t50质粒分别转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布平板后倒置培养过夜；
[0087]
2、挑取单克隆接种至4ml新鲜lb培养基中过夜培养；
[0088]
3、按1％接种量将培养后的菌液接种至800ml 2*yt培养液中，37℃、200rpm培养至od600值约0.5时添加终浓度为0.5mm的iptg诱导转座酶表达；
[0089]
4、4h后测定菌液浓度，并将菌液在4℃、5000rpm条件下离心20min后收集菌体；
[0090]
5、由于pet21b载体中包含6*his标签及tev蛋白酶酶切位点，转座酶的纯化可适用镍柱纯化、体外消化、收集流穿的流程。具体纯化步骤如下：
[0091]
a)将菌体按10g/100ml的比例添加纯化缓冲液，冰水浴中超声2s、暂停2s共处理30min使菌体完全破碎；
[0092]
b)4℃、15000rpm离心30min后收集上清液；
[0093]
c)使纯化装置平衡稳定后让上清液缓慢流过镍柱，收集流穿液保存于4℃冰箱；
[0094]
d)设置梯度洗脱程序，根据设备中峰图判断蛋白是否被洗脱，收集洗脱液(记为洗脱液a)；
[0095]
e)按试剂盒体系向洗脱液中添加适量重组tev蛋白酶，4℃冰箱中静置反应过夜；
[0096]
f)4℃、15000rpm离心30min后收集上清液；
[0097]
g)使纯化装置平衡稳定后让上清液缓慢流过镍柱，收集全部流穿液；
[0098]
h)选择高浓度溶液洗净层析柱，并用30k超滤管浓缩；
[0099]
i)测定蛋白浓度并用sds-page判定蛋白纯度；
[0100]
6、如图4-5所示，图4中s代表超声离心后上清，p代表超声离心后沉淀；1-12代表0-100％梯度洗脱过程中分段采集的洗脱液。图5中s代表超声离心后上清，p代表超声离心后沉淀；1-12代表0-100％梯度洗脱收集的洗脱液。纯化后的蛋白满足后续测试需求。
[0101]
实施例5：
[0102]
1、含有19bp转座子序列的接头引物包括转座酶识别序列me、第一接头序列及第二接头序列，其序列如下；将转座酶识别序列和接头序列分别进行退火后等体积混匀备用；
[0103]
转座酶识别序列：agatgtgtataagagacag(seq id no.3)
[0104]
第一接头序列：tcgtcggcagcgtcctgtctcttatacacatct(seq id no.10)
[0105]
第二接头序列：gtctcgtgggctcggctgtctcttatacacatct(seq id no.11)
[0106]
2、将tn5转座酶、含转座子序列的接头引物按照一定比例于25℃孵育60min，得到转座子复合体；
[0107]
3、取一定量的核酸dna，配制转座酶酶切反应体系，吹洗混匀短暂离心后置于pcr仪，55℃孵育10min；
[0108]
4、向上述反应体系中加入终止溶液继续孵育10min终止反应；
[0109]
5、向酶切产物中加入一定体积的(0.8
×
/1.0
×
)磁珠，震荡混匀后室温放置5min以上，放入磁力架分离磁珠和液体。待混合液澄清后移除上清，以80％的乙醇水溶液对磁珠漂洗2次，开盖自然干燥。加入ddh2o，混匀后于磁力架上静置，移取上清；
[0110]
6、将片段化产物与扩增引物、扩增酶、扩增反应缓冲液混合，进行链置换反应和文库扩增，获得富集的dna片段。详细步骤及试剂参照hiefffast tagment dna library prep kit for illumina方法。
[0111]
7、重复步骤4；
[0112]
8、构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价。酶切后的产物如图6所示，图6中0～5.0代表转座酶的投入量分别为0～5.0μl。同等条件下转座酶突变体t51的酶切效率更高，与图3的体内结果一致。

技术特征：
1.一种用于转座酶定向进化的辅助p-质粒，其特征在于所述辅助p-质粒包含受诱导表达的piii neg基因，用于表达噬菌体拮抗蛋白piii neg；以及转座酶特异性识别序列，并实现转座酶活性与噬菌体拮抗蛋白piii neg表达水平的关联。2.根据权利要求1所述的辅助p-质粒，其特征在于在受诱导表达的piii neg基因启动子的侧翼加入所述转座酶特异性识别序列。3.根据权利要求2所述的辅助p-质粒，其特征在于所述转座酶为tn5转座酶，所述转座酶特异性识别序列的序列为agatgtgtataagagacag。4.根据权利要求3所述的辅助p-质粒，其特征在于所述转座酶特异性识别序列成对存在，分列所述受诱导表达的piii neg基因启动子两侧。5.根据权利要求2所述的辅助p-质粒，其特征在于所述受诱导表达的piii neg基因启动子包含转录因子结合区及阻遏蛋白结合区，转录因子结合区为p
lac
、p
tet
、p
bad
或p
trp
，阻遏蛋白结合区为laci蛋白结合序列、tetr蛋白结合序列或arac蛋白结合序列。6.一种转座酶定向进化的系统，其特征在于包括：辅助p+质粒、携带转座酶的噬菌体重组基因组、宿主细胞，还包括权利要求1-5中任一项所述的辅助p-质粒；所述辅助p+质粒包含受诱导表达的giii基因，用于表达噬菌体衣壳蛋白的piii蛋白；所述携带转座酶的噬菌体重组基因组中噬菌体的所述giii基因被所述转座酶的编码序列取代，且所述转座酶的编码序列受giii基因启动子的控制；所述辅助p+质粒、辅助p-质粒及携带转座酶的噬菌体重组基因组转化到所述宿主细胞中。7.根据权利要求6所述的转座酶定向进化的系统，其特征在于所述辅助p+质粒中的giii基因受脱水四环素诱导表达。8.根据权利要求6或7所述的转座酶定向进化的系统，其特征在于所述携带转座酶的噬菌体重组基因组为包含不同转座酶突变体的噬菌体重组基因组文库，所述不同转座酶突变体由易错pcr方法获得。9.一种tn5转座酶突变体，其特征在于所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上，发生包括如下点突变:d11g、i117k、r210或i316中的任意一个或至少两个的组合。10.一种tn5转座酶突变体，其特征在于在seq id no.1的基础上，具有以下位点的氨基酸取代：d11g、i117k、r210、i316；其中r210、i316为任意突变；i117k、d11g为特定突变。11.根据权利要求10所述的tn5转座酶突变体，其特征在于其序列如seq id no.2所示。12.一种转座酶定向进化的方法，其特征在于其步骤包括：(1)构建权利要求6所述的辅助p+质粒和权利要求1-5中任一项所述的辅助p-质粒，转化至宿主细胞中，筛选出阳性克隆；(2)制备转座酶突变文库；扩增噬菌体除giii基因以外的基因组区域，并与所述转座酶突变文库进行同源重组，获得携带转座酶的噬菌体重组基因组；(3)取步骤(2)获得的携带转座酶的噬菌体重组基因组侵染步骤(1)获得的阳性克隆，培养，培养过程中诱导表达piiineg基因、以及giii基因；(4)培养结束后收集上清中噬菌体颗粒再侵染步骤(1)获得的阳性克隆，多次重复步骤(3)和(4)，以获得进化后的转座酶。

技术总结
本发明公开了一种用于转座酶定向进化的辅助P-质粒，所述辅助P-质粒包含受诱导表达的PIII neg基因，用于表达拮抗蛋白PIII neg；以及转座酶特异性识别序列，并实现转座酶活性与噬菌体拮抗蛋白PIII neg表达水平的关联。还公开了转座酶定向进化的系统、方法及获得的Tn5转座酶突变体。本发明利用PIII、PIII neg蛋白的竞争关系，通过在PIII neg基因启动子侧翼加入转座酶特异性识别序列，将转座酶的活性与子代噬菌体的生长相关联，从而筛选出活性更高的转座酶。转座酶。转座酶。


技术研发人员：刘想 唐琼卫 谢薇 商曰朋 刘峰 秦雪梅 曹振
受保护的技术使用者：翌圣生物科技（上海）股份有限公司
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/9/23