具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂及其制备方法与应用

1.本发明涉及一种天然药食同源中药的高值化深加工产品，特别是涉及具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.寿命的稳步增长和老龄化人口问题给当今社会带来新的挑战
‑‑
老年相关疾病，深入研究衰老、科学应对人口老龄化是重大需求。除近视高发外，许多眼科大病种与年龄增长密切相关。
3.年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,amd)是视网膜黄斑区域的退行性疾病，引起进行性中央视力丧失，是65岁及以上老年人视力丧失甚至失明的主要原因。逐渐成为一个重大的公共卫生问题，具有重大的社会、经济影响。临床上分为早期、中期、晚期3个阶段，晚期amd导致严重的永久性中央视力丧失，对生活质量有重大影响。晚期amd包括干性或湿性两种类型，干性amd主要特征为视网膜外层、视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,rpe)和脉络膜毛细血管萎缩，当萎缩区域累及中央视网膜时视功能明显受损。目前，尚无有效的治疗手段，仅有部分选择性补体c3抑制剂compstatin、人单克隆抗体rn6g和gsk933776、醋酸格拉替雷等在临床试验中。湿性amd主要特征为视网膜黄斑和脉络膜异常的新生血管，当新生血管出现漏液、漏血和急性渗出时导致黄斑结构扭曲，严重者视力丧失，若不处理会失明。西医主流疗法以玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)抗体为主，如雷珠单抗、哌加他尼、阿柏西普等。但需每年5～6次反复注射，费用约3万/年，即使灭菌仍可能将眼表微生物带入玻璃体有引发眼内炎的风险；且仅部分患者获益，停止治疗可导致渗出物复发，不能防止萎缩或纤维化物。补充维生素c、维生素e、β-胡萝卜素和锌可降低从干性发展为湿性的风险，但不能防止中度发展至干性，亟需有效的治疗手段。
4.传统医学基于整体观，认为眼睛与全身各脏腑皆有密切联系，如《黄帝内经》称：“五藏六腑之精气，皆上注于目而为之精
…
目者，五脏六腑之精也”。五脏中尤以肝与目关系最为密切：《素问
·
金匮真言论》云“东方青色，入通于肝，开窍于目，藏精于肝”；《素问
·
五藏生成》云“肝受血而能视”；《灵枢
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经脉》记载“肝足厥明之脉
…
连目系”；《灵枢
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脉度》称“肝气通于目，肝和则目能辨五色矣”。中医眼科“视瞻昏渺”证候与干性amd和湿性amd渗出前期相似，据《证治准绳
·
杂病
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七窍门》所载之“视瞻昏渺”病因病机“有神劳、有血少、有元气弱、有元精亏而昏渺者”。肝开窍于目，黄斑是中心视力最敏锐部位，与肝亦密切相关。
5.菊花作为平肝明目要药，是治疗湿性amd的和血明目片的重要药味，被列入《中成药治疗年龄相关性黄斑变性(湿性)临床应用指南(2020年)》。菊花(flos chrysanthemi)为菊科菊属植物菊chrysanthemum morifolium ramat.的干燥头状花序，味甘、苦，性微寒，具有散风清热、平肝明目、清热解毒功效，常用于目赤肿痛、眼目昏花等(《中华人民共和国药典》(2020版)一部)。《神农本草经》列为上品：“主风头眩肿痛，目欲脱，泪出
…
久服利血气，
轻身耐劳延年”。《药性赋》载：“菊花能明目而清风”。《本草纲目》称：“菊花，昔人谓其能除风热，益肝补阴。盖不知其尤多益金、水二脏也，补水所以制火，益金所以平木，木平则风息，火降则热除”。《本草正义》记载：“惟菊花之清苦降泄，能收摄虚阳而纳归于下，故为目科要药”。据此，菊花可散风清热、平肝明目从而改善amd。
6.菊花虽然在我国已经有几千年的药用和食用记载，但产品形式单一，多以初级农产品形式在市场流通，附加值较低，药农收益少。此外，菊花性微寒，老龄化人群易脾胃虚弱，久服菊花可能伤脾胃，针对这一问题本发明创造性地提取菊花的活性部位，并与实验筛选和验证的益生菌复配或共同发酵制备菊花活性菌剂。一方面益生菌的引入可以调节老龄化人群肠道菌群结构，避免久服菊花损伤脾胃，增加脾胃运化功能从而延缓机体衰老水平；另一方面该菊花活性菌剂来源天然，口感佳，易服用，老龄化人群接受度高，可作为日常功能食品或饮品用于预防amd。本发明延伸了菊花的产业链，拓展了菊花的高值化利用途径，同时为amd防治提供支撑，推动我国老年健康事业发展。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明的目的在于提供一种菊花活性菌剂，其能够对年龄相关性黄斑变性具有良好的改善作用；本发明的另一目的是提供上述菊花活性菌剂的制备方法和应用。
8.技术方案：为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案。
9.一种具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，它由下述制备方法得到：
10.(1)取药用菊花，投入提取罐中，加入8～20倍量的蒸馏水，加热回流或煎煮提取1～3次，过滤、合并提取液，减压浓缩得菊花水提物浸膏，备用；
11.(2)取步骤(1)得到的菊花水提物浸膏，加入无水乙醇使其含醇量为55％～95％，静置、离心分离得菊花粗多糖部位，上清液减压浓缩得菊花上清部位，备用；
12.(3)取步骤(1)的菊花水提物浸膏或步骤(2)的菊花上清部位，加入乳杆菌属细菌的一种或多种，复配或共同发酵获得菊花活性菌剂。
13.作为优选方案，所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，步骤(1)中提取条件为：步骤(1)中提取条件为：取菊花，依次加入20倍量、10倍量和8倍量的蒸馏水，加热回流或煎煮提取3次，每次0.5～2小时，过滤，合并三次提取滤液。
14.作为优选方案，所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，步骤(2)中所述的乙醇含量为55％、65％、75％、85％或95％。特别优选75％。
15.作为优选方案，所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，步骤(3)中所述的菊花提取物为菊花水提物浸膏、菊花粗多糖部位或菊花上清部位，特别优选菊花粗多糖部位。
16.作为特别优选方案，所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，步骤(3)中所述的菊花菊花粗多糖部位先由55％乙醇沉淀去除分子量较大的多糖，再由75％的乙醇醇沉获得。
17.作为优选方案，所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，步骤(3)中所述的菌剂为瑞士乳杆菌、中国台湾乳杆菌、罗氏乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌，特别优选瑞士乳杆菌。
18.作为优选方案，所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，步骤(3)中所述的复合方式为复配或共同发酵。
19.作为特别优选方案，所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，步骤(3)复配比例为菊花粗多糖部位(折合菊花原药材)：瑞士乳杆菌菌粉(折合活性菌)＝1g：10
10
cfu。
20.一种具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，它由下述制备方法得到：
21.(1)取药用菊花，去除杂质，适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入20倍量的蒸馏水浸泡过夜，加热到微沸回流提取60分钟；取药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的蒸馏水，加热到100℃提取，依次为45分钟、30分钟。过滤、合并三次提取液，减压浓缩得菊花水提物浸膏，备用；
22.(2)取步骤(1)得到的菊花水提物浸膏，加入无水乙醇使其含醇量为55％，充分搅拌，静置过夜、离心分离得上清液，浓缩后加入无水乙醇使其含醇量为75％，充分搅拌，静置过夜、离心分离沉淀，得菊花粗多糖部位。
23.(3)取步骤(2)得到的菊花粗多糖部位，加入瑞士乳杆菌、中国台湾乳杆菌、罗氏乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌菌粉，复配或共同发酵即得菊花活性菌剂。
24.作为优选方案，以上所述的菊花活性菌剂，其特征在于，取步骤(3)得到的菊花粗多糖部位，加入瑞士乳杆菌活性菌粉，进行复配得菊花活性菌剂。
25.作为优选方案，以上所述的菊花活性菌剂，其特征在于，取步骤(3)得到的菊花粗多糖部位，加入瑞士乳杆菌活性菌粉，进行复配，菊花粗多糖部位(折合菊花原药材)：瑞士乳杆菌菌粉(折合活性菌)＝1g：10
10
cfu。
26.本发明对菊花活性菌剂中各原料所含成分进行分析：以葡萄糖为对照品，采用苯酚硫酸法，应用紫外-可见分光光度在490nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的菊花粗多糖部位中中性多糖的含量为77.90％；以葡萄糖醛酸为对照品，采用卡唑硫酸法，应用紫外-可见分光光度在512nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的菊花粗多糖部位中酸性多糖的含量为18.59％。由此可知，制备得到的菊花粗多糖部位中性多糖和总酸性多糖含量之和大于等于96.49％，有效成分含量高。
27.本发明所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂在制备治疗年龄相关性黄斑变性的药品、功能食品、保健品或化妆品中的应用。
28.本发明所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂与药学、食品或化妆品可接受的载体制备成药品、功能食品、保健品或化妆品。
29.一种药物制剂，其由权利要求1至6任一项所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂与药学、食品或化妆品可接受的载体制成颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、滴眼液、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、眼膜、眼罩或眼贴等。
30.有益效果：本发明提供的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂在菊花原有应用基础上进行新的用途开发，和现有技术相比具有以下优点：
31.(1)本发明以药用菊花为原料，制备其活性提取物，并与有益的微生物复配或共同发酵而成，克服了菊花相关产品形式单一、附加值低的问题，延伸了菊花产业链，可实现菊资源的精细、高值化利用，具有很好的经济效应、社会效益和生态效益。
32.(2)实验结果表明，本发明提供的菊花活性菌剂中的益生菌可以调节肠道菌群结构，增加乳杆菌属益生菌丰度；同时，本发明中的菊花活性菌剂可以改善年龄相关性黄斑变性的各种症状及临床指标。在治疗年龄相关性黄斑变性的应用中，本发明提供的菊花活性菌剂能够减少碘酸钠所致小鼠视网膜色素上皮细胞变性丧失，增加视网膜厚度，改善小鼠在黑白箱行为学中的视觉功能，增加小鼠肠道乳杆菌属益生菌的丰度。
33.(3)本发明通过比较优选出最佳的制备工艺，可操作性强，自动化程度高，分离得到的菊花粗多糖活性成分含量和转移率高，能很好地保留原料中的有效成分，杂质少，无毒副作用；制备工艺中能量消耗少，生产成本低，对环境友好。
附图说明
34.图1菊花对amd小鼠视觉保护作用，注：与空白对照组con比较：
35.#p《0.05，##p《0.01；与模型组amd相比，*p《0.05，**p《0.01。
36.图2菊花对amd小鼠视网膜的保护作用，注：与空白对照组con比较：
37.#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001；与模型组amd相比，*p《0.05，**p《0.01，
38.***p《0.001。
39.图3菊花对amd小鼠肠道菌群群落结构的影响。
40.图4菊花对amd小鼠肠道乳杆菌属(a)及瑞士乳杆菌(b)种水平的影响。注：与空白对照组con比较:#p《0.05。
41.图5菊花对amd小鼠肠道菌群种水平的物种注释。
42.图6菊花水提取物(a)、粗多糖(b)和上清液(c)对瑞士乳杆菌的促生长作用。
43.图7各实施例对amd小鼠视觉保护作用，注：与空白对照组nc比较:#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001；与模型组amd相比，*p《0.05，**p《0.01。
44.图8各实施例对amd小鼠视网膜的保护作用，注：与空白对照组nc比较:#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001；与模型组amd相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
45.图9各实施例对amd小鼠肠道益生菌乳杆菌的调节作用，注：与空白对照组nc比较:#p《0.05；与模型组amd相比，*p《0.05，**p《0.01。
具体实施方式
46.下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
47.本发明所述的药材和乙醇用量均指得是重量体积比。乙醇均指的是体积浓度。
48.实施例1与菊花复配或共同发酵的益生菌筛选
49.一、实验材料与药物
50.1.药物和试剂
51.areds2 formula购自美国bausch&lomb公司(rochester，ny，usa)；碘酸钠购自上海麦克林生化科技有限公司(批号：c11815462)；氯化钠注射液购自河南科伦药业有限公司(批号：a19080101a)；羧甲基纤维素钠(批号：j14hs173796)购自上海源叶生物科技有限公司。
gel extraction kit(axygen biosciences,union city,ca,usa)进行回收产物纯化，2％琼脂糖凝胶电泳检测，并用quantus
tm fluorometer(promega,usa)对回收产物进行检测定量。使用nextflextm rapid dna-seq kit(bioo scientific，美国)进行建库：(1)接头链接；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用pcr扩增进行文库模板的富集；(4)磁珠回收pcr产物得到最终的文库。利用illumina公司的miseq pe300/novaseq pe250平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。
63.使用fastp(https://github.com/opengene/fastp，version 0.20.0)软件对原始测序序列进行质控，使用flash(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version1.2.7)软件进行拼接：(1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含n碱基的reads；(2)根据pe reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；(3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；(4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
64.使用uparse软件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根据97％的相似度对序列进行otu聚类并剔除嵌合体。利用rdp classifier[5](http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)对每条序列进行物种分类注释，比对silva16s rrna数据库(version 138)，设置比对阈值为70％。由于上述16s多样性分析结果只能到属水平，无法具体到某个种，因此进一步对空白组、模型组以及菊花给药组进行肠道菌宏基因组测序。
[0065]
三、实验结果
[0066]
1.黑白箱视觉行为学
[0067]
黑白箱结果表明：与空白对照组相比，模型组小鼠在黑箱中的停留时间显著缩短，说明碘酸钠导致模型组小鼠视力严重受损(p《0.01)。与模型组相比，菊花水提物浸膏高剂量组(cmh)和菊花水提物浸膏低剂量组(cml)均能明显延长小鼠在黑箱中的停留时间(p《0.05，p《0.01)，表明菊花水提取物能改善碘酸钠造成的小鼠视力损伤(图1)。
[0068]
2.otc视网膜形态学观察
[0069]
oct结果表明：与空白对照组相比，模型组小鼠的总视网膜厚度显著降低(p《0.001)；与模型组相比，各给药组均能一定程度改善上述改变，菊花水提物浸膏高剂量组(cmh，p《0.05)改善作用明显，菊花水提物浸膏低剂量组(cml)也有改善趋势(图2)。
[0070]
3.肠道菌16s多样性分析
[0071]
门水平上，粪便各组样本中主要的门分类水平为：厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)、脱铁杆菌门(deferrbacterota)、弯曲杆菌门(campilobacterota)、脱硫杆菌门(desulfobacterota)、髌骨细菌门(patescibacteria)。其中厚壁杆菌门占据门水平中的主要比例，拟杆菌门次之(图3a)。科水平上，按所占比例依次为乳杆菌科(lactobacilaceae)、拟杆菌科(muribaculaceae)、毛螺菌科(bacteroidaceae)等(图3b)。属水平上，所占比例依次为乳杆菌属(lactobacillus)、norank_f_muribaculacea、毛螺菌属(lachnospiraceae_nk4a136_group)、拟杆菌属(bacteroides)等(图3c)。空白组与模型组在属水平的构成上差异较大，对丰度前五的菌群分析，发现模型组乳杆菌属肠道菌丰度下降(图3d)。
[0072]
4.肠道菌菌宏基因组分析
[0073]
结合上述16s多样性结果，重点关注丰度最高的乳杆菌属(lactobacillus)、毛螺菌属(lachnospiraceae_nk4a136_group)、拟杆菌属(bacteroides)细菌。宏基因组定量数据结果表明：相比空白组，模型组乳杆菌属以及属内瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)含量均有所下降(p《0.05，p》0.05)，菊花水提物浸膏低剂量组(cml)可一定程度增加乳杆菌属以及瑞士乳杆菌的丰度(图4)。宏基因组物种注释结果也表明：乳杆菌属的瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)丰度较高，且模型组含量显著低于空白对照组(图5)。
[0074]
经由上述16s微生物多样性及宏基因组数据筛选，结合原卫生部发布的《可用于食品的菌种名单》和《可用于婴幼儿食品的菌种名单》，筛选瑞士乳杆菌、中国台湾乳杆菌、罗氏乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等乳杆菌属的一种或多种作为用于改善amd的益生菌。
[0075]
实施例2菊花提取物对乳杆菌的促生长作用
[0076]
上述结果表明菊花提取物可增加肠道内乳杆菌属肠道菌丰度，为考察菊花提取物是否对乳杆菌具有直接促生长作用，进行如下实验：
[0077]
(1)取药用菊花1kg，适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入20倍量的蒸馏水过夜，加热煎煮60分钟；取药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的蒸馏水，煎煮时间分别为45分钟和30分钟。过滤、合并三次提取液，减压浓缩得菊花水提物浸膏，备用；
[0078]
(2)取步骤(1)得到的菊花水提物浸膏，加入无水乙醇使其含醇量为55％，充分搅拌，静置过夜、离心分离得上清液，浓缩后加入无水乙醇使其含醇量为75％，充分搅拌，静置过夜、离心分离沉淀得菊花粗多糖部位，合并二次的上清液，减压回收乙醇得菊花上清部位，备用；
[0079]
(3)取对数生长期的瑞士乳杆菌，加入不同浓度的上述菊花水提取物(cm)、菊花粗多糖部位(dt)、菊花上清部位(sq)，使其终浓度为1μg/ml～10mg/ml，30℃孵育24小时，采用紫外分光光度计测定600nm的浊度。结果表明：菊花水提物在10μg/ml～100μg/ml浓度范围内可显著促进瑞士乳杆菌生长(图6a)，菊花粗多糖在10μg/ml～1mg/ml浓度范围内可显著促进瑞士乳杆菌生长(图6b)，菊花上清液在1μg/ml～10μg/ml浓度范围内可显著促进瑞士乳杆菌生长(图6c)，表明菊花水提取物及其不同部位较低浓度下能够在一定程度上促进瑞士乳杆菌的生长，尤其以菊花粗多糖在10μg/ml浓度时促生长作用最为显著。
[0080]
实施例3
[0081]
1、一种具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0082]
(1)取药用菊花1kg，适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入20倍量的蒸馏水过夜，加热煎煮60分钟；取药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的蒸馏水，煎煮时间分别为45分钟和30分钟。过滤、合并三次提取液，减压浓缩得菊花水提物浸膏，备用；
[0083]
(2)取步骤(1)得到的菊花水提物浸膏，加入无水乙醇使其含醇量为55％，充分搅拌，静置过夜、离心分离沉淀得菊花粗多糖部位；
[0084]
(3)取步骤(2)得到的菊花粗多糖部位，与10
11
cfu罗氏乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌混菌菌粉(菌落数比1：1：1)按照菊花原药材：活性菌＝1g：108cfu复配，即得具有改
善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂。
[0085]
实施例4
[0086]
1、一种具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0087]
取药用菊花1kg，适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入20倍量的蒸馏水过夜，加热煎煮60分钟；取药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的蒸馏水，煎煮时间分别为45分钟和30分钟。过滤、合并三次提取液，减压浓缩得菊花水提物浸膏，备用；
[0088]
(2)取步骤(1)得到的菊花水提物浸膏，加入无水乙醇使其含醇量为75％，充分搅拌，静置过夜、离心分离上清液并减压浓缩，得菊花上清部位；
[0089]
(3)取步骤(2)得到的菊花上清部位，与10
12
cfu瑞士乳酸菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌混菌菌粉(菌落数比1：1：1)按照菊花原药材：活性菌＝1g：109cfu复配，即得具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂。
[0090]
实施例5
[0091]
1、一种具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0092]
(1)取药用菊花1kg，适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入20倍量的蒸馏水过夜，加热煎煮60分钟；取药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的蒸馏水，煎煮时间分别为45分钟和30分钟。过滤、合并三次提取液，减压浓缩得菊花水提物浸膏，备用；
[0093]
(2)取步骤(1)得到的菊花水提物浸膏，加入无水乙醇使其含醇量为55％，充分搅拌，静置过夜、离心分离得上清液，浓缩后加入无水乙醇使其含醇量为75％，充分搅拌，静置过夜、离心分离沉淀得菊花粗多糖部位；
[0094]
取步骤(2)得到的菊花粗多糖部位，与10
13
cfu瑞士乳酸菌菌粉按照菊花原药材：活性菌＝1g：10
10
cfu复配，即得具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂。
[0095]
实施例6
[0096]
1、一种具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0097]
(1)取药用菊花1kg，适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入20倍量的蒸馏水过夜，加热煎煮60分钟；取药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的蒸馏水，煎煮时间分别为45分钟和30分钟。过滤、合并三次提取液，减压浓缩得菊花水提物浸膏，备用；
[0098]
(2)取步骤(1)得到的菊花水提物浸膏，与10
13
cfu瑞士乳酸菌菌粉按照菊花原药材：活性菌＝1g：10
10
cfu复配，即得具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂。
[0099]
实施例7
[0100]
1、一种具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0101]
(1)取药用菊花1kg，适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入20倍量的蒸馏水过夜，加热煎煮60分钟；取药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的蒸馏水，煎煮时间分别为45分钟和30分钟。过滤、合并三次提取液，减压浓缩得菊花水提物浸膏，备用；
[0102]
(2)取步骤(1)得到的菊花水提物浸膏，与10
13
cfu瑞士乳酸菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌混菌菌粉(菌落数比1：1：1)按照菊花原药材：活性菌＝1g：10
10
cfu于30℃共同发酵18
小时，离心收集菌体冷冻干燥，上清液减压浓缩，即得具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂。
[0103]
实施例8菊花活性菌剂对amd小鼠的药效学实验
[0104]
一、实验材料与药物
[0105]
1.药物和试剂
[0106]
areds2 formula购自美国bausch&lomb公司(rochester，ny，usa)；碘酸钠购自上海麦克林生化科技有限公司(批号：c11815462)；氯化钠注射液购自河南科伦药业有限公司(批号：a19080101a)；羧甲基纤维素钠(批号：j14hs173796)购自上海源叶生物科技有限公司。
[0107]
2.实验动物
[0108]
雄性spf级icr小鼠，6月龄，体重25
±
5g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(京)2021-0006，动物合格号：no.110011230102876928。小鼠饲养于南京中医药大学spf实验动物中心屏障环境，温度(22
±
2)℃，相对湿度(55
±
10)％，光照12h/黑暗12h，自由饮水和进食，标准饲料饲喂，定期更换垫料。动物实验方案经过南京中医药大学药物安全性评价研究中心动物伦理委员会审核批准，所有操作均符合实验动物伦理相关规定。
[0109]
3.实验仪器
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labconco freezone冷冻干燥机(美国labconco公司)；bt125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；酶联免疫仪(美国bio-tek公司)。
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4.受试药物及处理方法
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取实施例3～7的菊花活性菌剂，临用前以0.5％的羧甲基纤维素钠混悬，以菊花生药量的临床等效量1g/kg的剂量给药。
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二、实验方法
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适应性饲养7天后，6月龄icr雄性小鼠随机分为8组，分别为空白对照组(nc)、模型组(amd)、实施例3(ss3)、实施例4(ss4)、实施例5(ss5)、实施例6(ss6)、实施例7(ss7)、菊花组(jh)，每组10只。除空白对照组外，腹腔注射碘酸钠(35mg/kg)一周制备amd模型。造模结束后灌胃给药，连续灌胃给药1周。
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给药结束后，将小鼠放置黑白箱的白箱中央，给予2700lux光照300s，拍摄记录小鼠在黑白箱中的行为，统计小鼠停留在黑箱中的时间。末次给药后，小鼠麻醉后固定于实验台保持平卧，oct拍照前10min，复方托吡卡胺滴眼液散瞳。
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取各组小鼠粪便，stool genomic dna kit试剂盒提取粪便dna，green qpcr supermix(+dyei/dyeii)用于量化mrna水平，2-δδct
法用于计算相对mrna表达。eubacteria内参基因序列为5’：actcctacgggaggcagcagt，3’：attaccgcggctgctggc；lactobacillus乳杆菌目的基因序列为5’：agcagtagggaatcttcca，3’：caccgctacacatggag。qpcr反应体系(20μl)：template(cdna)2μl、f-primer 0.5μl、rprimer 0.5μl、2
×
sybgeen pcr mix 10μl、ddh2o 7μl。3000r/min离心20s混匀，加入pcr板，每孔18μl，800r/min离心5min。qpcr测定：采用abi7900型基因扩增仪进行pcr扩增，设定程序为(45循环)，每个循环的条件为：94℃30s；94℃5s；60℃34s；72℃10s。
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三、实验结果
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1.黑白箱视觉行为学
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黑白箱结果表明：与空白对照组相比，模型组小鼠在黑箱中的停留时间显著缩短，说明碘酸钠导致模型组小鼠视力严重受损(p《0.001)，菊花给药组可显著增加小鼠黑箱停留时间(p《0.01)。与模型组相比，实施例3～实施例7均能明显延长小鼠在黑箱中的停留时间(p《0.01，p《0.05，p《0.001，p《0.01，p《0.05)，表明上述实施例中的菊花活性菌剂均能改善碘酸钠造成的小鼠视力损伤，尤其以实施例5的作用最为显著(图7)。
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2.otc视网膜形态学观察
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oct结果表明：与空白对照组相比，模型组小鼠的总视网膜厚度显著降低(p《0.001)，菊花给药组视网膜厚度显著增加(p《0.05)；与模型组相比，实施例3～实施例7均能显著增加视网膜厚度(p《0.01，p《0.001，p《0.001，p《0.001，p《0.001)，且实施例3～实施例7对视网膜的改善作用均强于单用菊花提取物组，表明上述实施例中的菊花活性菌剂均能改善碘酸钠造成的视网膜结构丧失而变薄，且其改善作用均优于单用菊花组(图8)。
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3.粪便乳杆菌表达量
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pcr结果表明：与空白对照组相比，模型组小鼠肠道乳杆菌丰度显著降低(p《0.05)，菊花给药组乳杆菌丰度显著增加(p《0.05)；与模型组相比，实施例3～实施例7均能增加小鼠肠道乳杆菌丰度(p《0.05，p《0.05，p《0.01，p《0.01，p》0.05)，且实施例3～实施例7对乳杆菌丰度的上调作用均强于单用菊花提取物组，表明上述实施例中的菊花活性菌剂均能改善碘酸钠造成的肠道益生菌乳杆菌丰度的下降，且其改善作用均优于单用菊花组(图9)。
[0124]
以上实验结果表明，本发明提供的菊花活性菌剂可以改善年龄相关性黄斑变性：能够增强辨别明、暗的能力，改善视觉功能；改善年龄相关性黄斑变性过程中视网膜色素上皮细胞变性、丧失等导致的视网膜厚度减小，增加视网膜厚度；同时，调节肠道菌群结构，增加肠道益生菌乳杆菌的丰度，改善模型小鼠的胃肠功能。
[0125]
本发明通过不同制备工艺的菊花活性菌剂的活性不同，通过本发明比较可知，实施例5制备得到的菊花活性菌剂活性最强，取得了非常好的预料不到的技术效果。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，其特征在于，它由下述制备方法得到：(1)取药用菊花，投入提取罐中，加入8～20倍量的蒸馏水，加热回流或煎煮提取1～3次，过滤、合并提取液，减压浓缩得菊花水提物浸膏，备用；(2)取步骤(1)得到的菊花水提物浸膏，加入无水乙醇使其含醇量为55％～95％，静置、离心分离得菊花粗多糖部位，上清液减压浓缩得菊花上清部位，备用；(3)取步骤(1)的菊花水提物浸膏或步骤(2)的菊花上清部位，加入乳杆菌属细菌的一种或多种，复配或共同发酵获得菊花活性菌剂。2.根据权利要求1所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，其特征在于，步骤(1)中提取条件为：取药用菊花，依次加入20倍量、10倍量和8倍量的蒸馏水，加热回流或煎煮提取3次，每次0.5～2小时，过滤，合并三次提取滤液。3.根据权利要求1所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，其特征在于，步骤(2)中所述乙醇含量为55％、65％、75％、85％或95％。4.根据权利要求1所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，其特征在于，步骤(3)中所述的菌剂为瑞士乳杆菌、中国台湾乳杆菌、罗氏乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，其特征在于：步骤(3)中菊花粗多糖部位：瑞士乳杆菌＝1g：10
10
cfu。6.根据权利要求1所述的一种具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂，其特征在于，它由下述制备方法得到：(1)取药用菊花，适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入20倍量的蒸馏水过夜，加热煎煮60分钟；取药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的蒸馏水，煎煮时间分别为45分钟和30分钟。过滤、合并三次提取液，减压浓缩得菊花水提物浸膏，备用；(2)取步骤(1)得到的菊花水提物浸膏，加入无水乙醇使其含醇量为55％，充分搅拌，静置过夜、离心分离得上清液，浓缩后加入无水乙醇使其含醇量为75％，充分搅拌，静置过夜、离心分离沉淀得菊花粗多糖部位；(3)取步骤(2)得到的菊花粗多糖部位，与瑞士乳酸菌菌粉按照菊花原药材：活性菌＝1g：10
10
cfu复配，即得具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂。7.权利要求1至6任一项所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂在制备改善年龄相关性黄斑变性的药品、功能食品、保健品或化妆品中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，菊花粗多糖部位在制备改善年龄相关性黄斑变性疾病的肠道乳杆菌属失调药物中的应用。9.权利要求1至6任一项所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂与药学、食品或化妆品可接受的载体制备成药品、功能食品、保健品或化妆品。10.一种药物制剂，其由权利要求1至6任一项所述的具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂与药学、食品或化妆品可接受的载体制成颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、滴眼液、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、眼膜、眼罩或眼贴。

技术总结
本发明公开了一种具有改善年龄相关性黄斑变性的菊花活性菌剂及其制备方法与应用，该菊花活性菌剂是由菊花活性提取物与有益的微生物复配或共同发酵而成。本发明提供的有益微生物经过动物实验的16S肠道菌测序及宏基因组学筛选获得，药效学实验结果表明该菊花活性菌剂可增加动物肠道益生菌乳杆菌属的丰度，并且对年龄相关性黄斑变性动物具有很好的改善作用，可显著增加年龄相关性黄斑变性动物的视网膜厚度，改善动物的视力功能。本发明提供的制备方法，整个制备工艺简单，设计合理，所得菊花活性菌剂生物活性高，且风味佳。且风味佳。且风味佳。


技术研发人员：魏丹丹 段金廒 宋宇涵 王淇 刘海峰 郭建明
受保护的技术使用者：南京中医药大学
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/9/23