一种改性高碳磷比生物炭菌剂、制备方法及其应用
未命名
09-29
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一种改性高碳磷比生物炭菌剂、制备方法及其应用
1.技术领域
2.本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种改性高碳磷比生物炭菌剂、制备方法及其应用。
背景技术：
3.现如今，由于错误的耕作、施肥等措施，造成大量水土流失，农业土壤质量退化等问题。川渝地区坡耕地比例大、质量低、障碍多，坡耕地有机质含量和饱和点低，始终徘徊在10 g/kg左右，2/3以上坡耕地有机质低于10 g/kg。因此坡耕地多源增碳消障技术和产品的研发意义重大，应用前景广阔。生物炭作为一种新型的土壤改良剂，自身具备优良的特性，成为近年来研究的热点，其施入土壤后会对土壤中碳、磷循环造成重要影响。土壤中的磷易被固定，有效磷含量低，解决土壤磷素有效性含量低、易被固定这一问题，是培肥土壤、提升作物产量的关键。
技术实现要素：
4.本发明的第一目的在于提供一种改性高碳磷比生物炭菌剂，该菌剂能够提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，实现土壤培肥，从而解决现目前土壤磷素有效性含量低、易被固定而导致的土壤贫瘠的技术问题。
5.本发明的第二目的在于提供一种改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，该制备方法操作简便，使改性高碳磷比生物炭菌剂便于大规模批量生产，从而提高生产效率的同时，降低操作人员的操作难度。
6.本发明的第三目的在于提供一种改性高碳磷比生物炭菌剂在土壤肥力改善方面的应用，该菌剂通过利用高c/p比大麦秸秆制备生物炭并负载磷活化及促生微生物菌群，可以提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，达到对坡耕地土壤培肥的目的。
7.相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：一、 本发明提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂，该菌剂通过将生物炭和细菌结合制备而成，通过利用高c/p比大麦秸秆制备生物炭并负载磷活化及促生微生物菌群，可以提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，达到对坡耕地土壤培肥的目的。
8.二、 本发明还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，本方法采用水热大麦生物炭含氧官能团更加丰富，且具有泥炭性质，利于后续土壤微生物定殖，且还采用了植酸对生物炭进行改性，将生物炭的物理性质进行优化，具有植酸的生物炭在热解过程中更容易形成蜂窝形状，形态更整齐。且植酸盐改性生物炭能促进电子转移，其表面存在偏磷酸，偏磷酸易溶于水生成正磷酸（h3po4），对植物吸收磷有利；在改性后的生物炭上负载具有磷活化和根系促生能力的功能微生物菌群，如：解磷菌（侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、磷酸盐溶解性曲霉 ）；根际促生菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌），促进作物根系在土壤中的扎
根深度及对磷元素的吸收。最后采用壳聚糖包裹材料，壳聚糖能在温和的酸度（ph4-5）下溶解，当根区的ph值足够低时，被包裹的复合材料才会释放，防止p被fe、al、ca固定，达到根际智能释放的目的；且该方法操作简便，使改性高碳磷比生物炭菌剂便于大规模批量生产，从而提高生产效率的同时，降低操作人员的操作难度。
9.三、 本发明还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂在土壤肥力改善方面的应用，其能够应用于瘠薄坡耕地的典型作物体系中，可以提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，实现土壤培肥。
具体实施方式
10.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
11.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
12.本发明实施例提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂，包括如下原料：生物炭和复合菌液，生物炭与复合菌液的质量体积比为1/（20-30） g/ml，复合菌液包括侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液，侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液的质量比为1:1:1:1:1。
13.在本发明的一些实施例中，在上述复合菌液中，枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2.0
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2.0
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉的活菌量≥10.0
×
108cfu/ml。
14.在本发明的一些实施例中，上述改性高碳磷比生物炭菌剂还包括壳聚糖，壳聚糖涂覆于负载复合菌液的生物炭上。
15.另一方面，本发明的实施例还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂在土壤肥力改善方面的应用。
16.另一方面，本发明的实施例还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，包括如下步骤：将大麦秸秆粉碎并过筛后得到大麦秸秆颗粒，将大麦秸秆颗粒于180-300℃水热碳化后得到生物炭粗品，将生物炭粗品与植酸溶液混合并热解后用超纯水冲洗至ph为中性，即得到生物炭；取侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌并活化后分别于30-35℃恒温培养18-24 h，得到侧孢芽孢杆菌固体培养基、巨大芽孢杆固体培养基、磷酸盐溶解性曲霉固体培养基、枯草芽孢杆菌固体培养基和地衣芽孢杆菌固体培养基，分别挑取侧孢芽孢杆菌固体培养基、巨大芽孢杆固体培养基、磷酸盐溶解性曲霉固体培养基、枯草芽孢杆菌固体培养基和地衣芽孢杆菌固体培养基中的菌落接种于液体培养基中并于25-30℃、150-200 rpm恒温培养至活菌数≥1.0
×
108cfu/ml，得到侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液后按照质量比1:1:1:1:1进行混合后，即得到复合菌液；将生物炭
加入到复合菌液内后振摇1.5-2.5 h后离心取沉淀，得到菌剂粗品；将菌剂粗品与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合后于12000-18000 rpm离心30-60 min后取最底层沉淀，即得到改性高碳磷比生物炭菌剂。
17.在本发明的一些实施例中，上述植酸溶液的质量浓度为22-28%，生物炭粗品与植酸溶液的固液比为1:（1.5-2.5）。
18.在本发明的一些实施例中，上述热解包括如下步骤：将生物炭粗品与植酸溶液混合后通入惰性气体将温度以8-12 ℃/min的速率从室温升高至100℃持续0.8-1.2 h后继续以8-12
ꢀ°
c/min的速率升高至250
°
c、450
°
c和650
°
c并分别持续1.8-2.2 h，然后降温至50℃后即完成热解。
19.在本发明的一些实施例中，上述凝胶状高粘性壳聚糖基质的制备方法包括如下步骤：将壳聚糖溶解于ph为4的无水冰乙酸中，即制得凝胶状高粘性壳聚糖基质，壳聚糖与无水冰乙酸的质量体积比为35-45 mg/ml，无水冰乙酸内含有3.5-4.5 mol/l的naoh。
20.在本发明的一些实施例中，上述生物炭粗品在水热碳化后、与植酸溶液混合前还包括研磨步骤，生物炭粗品在研磨后的大小为200-250 μm。
21.在本发明的一些实施例中，上述过筛的目数为100-200目。
22.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
23.实施例1生物炭粗品制备：采用粉碎机将大麦秸秆粉碎，过100目筛获得大麦秸秆颗粒采用低温水热炭化（180oc）制备生物炭粗品，将制备后的生物炭粗品研磨至200 μm备用。
24.植酸改性：将制备好的生物炭粗品与质量浓度为22%的植酸溶液按固液比1:1.5混合。在充分混合后，将其放入马弗炉中以开始热解。首先通过通入惰性气体氮气将温度以8
ꢀ°
c/min的速率从室温升高至100
ꢀ°
c持续1.2 h，然后以8
ꢀ°
c/min的速率升高至250
ꢀ°
c、450
ꢀ°
c和650
°
c并分别持续2.2 h。当马弗炉内温度降至50
ꢀ°
c时，取出生物炭并立即用超纯水冲洗，直至生物炭的ph为中性。
25.复合菌液制备：从-80℃冰箱中取出甘油保存的侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，置于-4℃冰箱解冻后，在超净台中用无菌接种针接种于中培养，使菌株充分活化，然后放置30℃恒温培养箱中培养18 h。再用无菌接种针挑取平皿中的菌株接种至液体培养基，将液体培养基置于25℃恒温摇床培养箱中，转速150 r/min，使发酵液中活菌数达到1.0
×
108cfu/ml以上。经活化、发酵后，计数，每种发酵液中有效活菌数》1.0
×
108cfu/ml。
26.根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释或浓缩后，取菌种的发酵液按照质量比1:1:1:1:1混合制得复合菌液，使复合菌液中枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉活菌量≥10
×
108cfu/ml。
27.复合菌液负载：将复合菌液在4℃和5000 rpm下离心10分钟，并将收集的细胞用蒸馏水洗涤五次
并重悬于pbs缓冲液（ph=7.0）中。将1 g生物炭加入到20 ml复合菌液中并振摇1.5小时，通过离心获得的沉淀即为复合菌剂粗品。
28.壳聚糖包裹：壳聚糖（35 mg）溶解在1 ml具有naoh（3.5 mol/l）的ph=4的无水冰乙酸中，获得凝胶状高粘性壳聚糖基质。将改性并负载微生物俊基后的生物炭与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合，以12000 rpm离心30 min。获得2个不同的沉淀层，最底层即为改性高碳磷比生物炭菌剂。
29.实施例2生物炭粗品制备：采用粉碎机将大麦秸秆粉碎，过200目筛获得大麦秸秆颗粒采用低温水热炭化（300oc）制备生物炭粗品，将制备后的生物炭粗品研磨至250 μm备用。
30.植酸改性：将制备好的生物炭粗品与质量浓度为28%的植酸溶液按固液比1:2.5混合。在充分混合后，将其放入马弗炉中以开始热解。首先通过通入惰性气体氮气将温度以12
ꢀ°
c/min的速率从室温升高至100
ꢀ°
c持续0.8 h，然后以12
ꢀ°
c/min的速率升高至250
ꢀ°
c、450
ꢀ°
c和650
°
c并分别持续1.8 h。当马弗炉内温度降至50
ꢀ°
c时，取出生物炭并立即用超纯水冲洗，直至生物炭的ph为中性。
31.复合菌液制备：从-80℃冰箱中取出甘油保存的侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，置于-4℃冰箱解冻后，在超净台中用无菌接种针接种于中培养，使菌株充分活化，然后放置35℃恒温培养箱中培养24 h。再用无菌接种针挑取平皿中的菌株接种至液体培养基，将液体培养基置于30℃恒温摇床培养箱中，转速200 r/min，使发酵液中活菌数达到1.0
×
108cfu/ml以上。经活化、发酵后，计数，每种发酵液中有效活菌数》1.0
×
108cfu/ml。
32.根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释或浓缩后，取菌种的发酵液按照质量比1:1:1:1:1混合制得复合菌液，使复合菌液中枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉活菌量≥10
×
108cfu/ml。
33.复合菌液负载：将复合菌液在4℃和5000 rpm下离心10分钟，并将收集的细胞用蒸馏水洗涤五次并重悬于pbs缓冲液（ph=7.0）中。将1 g生物炭加入到30 ml复合菌液中并振摇2.5小时，通过离心获得的沉淀即为复合菌剂粗品。
34.壳聚糖包裹：壳聚糖（45 mg）溶解在1 ml具有naoh（4.5 mol/l）的ph=4的无水冰乙酸中，获得凝胶状高粘性壳聚糖基质。将改性并负载微生物俊基后的生物炭与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合，以18000 rpm离心60 min。获得2个不同的沉淀层，最底层即为改性高碳磷比生物炭菌剂。
35.实施例3生物炭粗品制备：
采用粉碎机将大麦秸秆粉碎，过150目筛获得大麦秸秆颗粒采用低温水热炭化（240oc）制备生物炭粗品，将制备后的生物炭粗品研磨至225 μm备用。
36.植酸改性：将制备好的生物炭粗品与质量浓度为25%的植酸溶液按固液比1:2混合。在充分混合后，将其放入马弗炉中以开始热解。首先通过通入惰性气体氮气将温度以10
ꢀ°
c/min的速率从室温升高至100
ꢀ°
c持续1 h，然后以10
ꢀ°
c/min的速率升高至250
ꢀ°
c、450
ꢀ°
c和650
°
c并分别持续2 h。当马弗炉内温度降至50
ꢀ°
c时，取出生物炭并立即用超纯水冲洗，直至生物炭的ph为中性。
37.复合菌液制备：从-80℃冰箱中取出甘油保存的侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，置于-4℃冰箱解冻后，在超净台中用无菌接种针接种于中培养，使菌株充分活化，然后放置32℃恒温培养箱中培养21 h。再用无菌接种针挑取平皿中的菌株接种至液体培养基，将液体培养基置于28℃恒温摇床培养箱中，转速180 r/min，使发酵液中活菌数达到1.0
×
108cfu/ml以上。经活化、发酵后，计数，每种发酵液中有效活菌数》1.0
×
108cfu/ml。
38.根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释或浓缩后，取菌种的发酵液按照质量比1:1:1:1:1混合制得复合菌液，使复合菌液中枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉活菌量≥10
×
108cfu/ml。
39.复合菌液负载：将复合菌液在4℃和5000 rpm下离心10分钟，并将收集的细胞用蒸馏水洗涤五次并重悬于pbs缓冲液（ph=7.0）中。将1 g生物炭加入到25 ml复合菌液中并振摇2小时，通过离心获得的沉淀即为复合菌剂粗品。
40.壳聚糖包裹：壳聚糖（40 mg）溶解在1 ml具有naoh（4 mol/l）的ph=4的无水冰乙酸中，获得凝胶状高粘性壳聚糖基质。将改性并负载微生物俊基后的生物炭与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合，以15000 rpm离心45 min。获得2个不同的沉淀层，最底层即为改性高碳磷比生物炭菌剂。
41.实施例4生物炭粗品制备：采用粉碎机将大麦秸秆粉碎，过130目筛获得大麦秸秆颗粒采用低温水热炭化（230oc）制备生物炭粗品，将制备后的生物炭粗品研磨至220 μm备用。
42.植酸改性：将制备好的生物炭粗品与质量浓度为24%的植酸溶液按固液比1:1.8混合。在充分混合后，将其放入马弗炉中以开始热解。首先通过通入惰性气体氮气将温度以9
ꢀ°
c/min的速率从室温升高至100
ꢀ°
c持续1.1 h，然后以9
ꢀ°
c/min的速率升高至250
ꢀ°
c、450
ꢀ°
c和650
°
c并分别持续2.1 h。当马弗炉内温度降至50
ꢀ°
c时，取出生物炭并立即用超纯水冲洗，直至生物炭的ph为中性。
43.复合菌液制备：
从-80℃冰箱中取出甘油保存的侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，置于-4℃冰箱解冻后，在超净台中用无菌接种针接种于中培养，使菌株充分活化，然后放置31℃恒温培养箱中培养20 h。再用无菌接种针挑取平皿中的菌株接种至液体培养基，将液体培养基置于27℃恒温摇床培养箱中，转速170 r/min，使发酵液中活菌数达到1.0
×
108cfu/ml以上。经活化、发酵后，计数，每种发酵液中有效活菌数》1.0
×
108cfu/ml。
44.根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释或浓缩后，取菌种的发酵液按照质量比1:1:1:1:1混合制得复合菌液，使复合菌液中枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉活菌量≥10
×
108cfu/ml。
45.复合菌液负载：将复合菌液在4℃和5000 rpm下离心10分钟，并将收集的细胞用蒸馏水洗涤五次并重悬于pbs缓冲液（ph=7.0）中。将1 g生物炭加入到23 ml复合菌液中并振摇1.8小时，通过离心获得的沉淀即为复合菌剂粗品。
46.壳聚糖包裹：壳聚糖（39 mg）溶解在1 ml具有naoh（3.8 mol/l）的ph=4的无水冰乙酸中，获得凝胶状高粘性壳聚糖基质。将改性并负载微生物俊基后的生物炭与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合，以14000 rpm离心40 min。获得2个不同的沉淀层，最底层即为改性高碳磷比生物炭菌剂。
47.实施例5生物炭粗品制备：采用粉碎机将大麦秸秆粉碎，过170目筛获得大麦秸秆颗粒采用低温水热炭化（260oc）制备生物炭粗品，将制备后的生物炭粗品研磨至235 μm备用。
48.植酸改性：将制备好的生物炭粗品与质量浓度为27%的植酸溶液按固液比1:2.2混合。在充分混合后，将其放入马弗炉中以开始热解。首先通过通入惰性气体氮气将温度以11
ꢀ°
c/min的速率从室温升高至100
ꢀ°
c持续0.9 h，然后以11
ꢀ°
c/min的速率升高至250
ꢀ°
c、450
ꢀ°
c和650
°
c并分别持续1.9 h。当马弗炉内温度降至50
ꢀ°
c时，取出生物炭并立即用超纯水冲洗，直至生物炭的ph为中性。
49.复合菌液制备：从-80℃冰箱中取出甘油保存的侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，置于-4℃冰箱解冻后，在超净台中用无菌接种针接种于中培养，使菌株充分活化，然后放置33℃恒温培养箱中培养22 h。再用无菌接种针挑取平皿中的菌株接种至液体培养基，将液体培养基置于29℃恒温摇床培养箱中，转速190 r/min，使发酵液中活菌数达到1.0
×
108cfu/ml以上。经活化、发酵后，计数，每种发酵液中有效活菌数》1.0
×
108cfu/ml。
50.根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释或浓缩后，取菌种的发酵液按照质量比1:1:1:1:1混合制得复合菌液，使复合菌液中枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌
的活菌量≥5
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉活菌量≥10
×
108cfu/ml。
51.复合菌液负载：将复合菌液在4℃和5000 rpm下离心10分钟，并将收集的细胞用蒸馏水洗涤五次并重悬于pbs缓冲液（ph=7.0）中。将1 g生物炭加入到27 ml复合菌液中并振摇2.2小时，通过离心获得的沉淀即为复合菌剂粗品。
52.壳聚糖包裹：壳聚糖（43 mg）溶解在1 ml具有naoh（4.2 mol/l）的ph=4的无水冰乙酸中，获得凝胶状高粘性壳聚糖基质。将改性并负载微生物俊基后的生物炭与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合，以16000 rpm离心50 min。获得2个不同的沉淀层，最底层即为改性高碳磷比生物炭菌剂。
53.对比例1将实施例3中的植酸溶液改性步骤取消，其余步骤与实施例3相同。
54.对比例2将实施例3中的复合菌液负载步骤取消，其余步骤与实施例3相同。
55.对比例3将实施例3中的生物炭粗品制备步骤取消，其余步骤均与实施例3相同。
56.其中实施例1-5和对比例1-3中所用磷酸盐溶解性曲霉为泡盛曲霉aspergillus awamori 3.11511，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均购自四川省眉山益稷农业科技有限公司。
57.实验例1取实施例3和对比例1-3所制得的复合菌剂并将其对夏季六月的玉米盆栽进行施用，施用周期为每月一次，一共施用半年，实施例3和对比例1-3的复合菌剂的施用量均为22.5t/hm2。
58.半年后测量玉米的株高、径粗和根长，所得结果如表1所示。
59.表1 盆栽玉米的株高、径粗和根长记录表处理株高（cm）径粗（cm）根长（cm）实施例388.981.8927.79对比例179.881.5224.35对比例273.451.4422.68对比例369.831.0517.54根据表1结果所示，施用实施例3所制得的复合菌剂的盆栽玉米的株高、径粗和根长均明显优于对比例1-3中所制得的复合菌剂，因此可见，本发明所提供的改性高碳磷比生物炭菌剂能够有效改善土壤的肥力，从而改良植物的生长情况。
60.实验例2取实施例3和对比例1-3所制得的复合菌剂并将其对夏季六月的玉米大田进行施用，施用周期为每月一次，一共施用半年，实施例3和对比例1-3的复合菌剂的施用量均为22.5t/hm2。
61.半年后测量玉米的株高、穗长、根长和产量，所得结果如表2所示。
62.表2 大田玉米的株高、径粗、根长和产量记录表处理株高（cm）径粗（cm）根长（cm）产量（t.hm-2
）实施例3220.3722.89
±
0.5184.3312.78对比例1214.4619.34
±
0.5162.7811.89对比例2199.7818.57
±
0.5145.4611.34对比例3170.5616.98
±
0.5124.8710.67根据表2结果所示，施用实施例3所制得的复合菌剂的大田玉米的株高、径粗、根长和产量均明显优于对比例1-3中所制得的复合菌剂，因此可见，本发明所提供的改性高碳磷比生物炭菌剂能够有效改善土壤的肥力，从而改良植物的生长情况，并提高植物的结实率，从而提高植物的产量。
63.综上所述，本发明实施例提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂、制备方法及其应用：一、 本发明实施例提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂，该菌剂通过将生物炭和细菌结合制备而成，通过利用高c/p比大麦秸秆制备生物炭并负载磷活化及促生微生物菌群，可以提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，达到对坡耕地土壤培肥的目的。
64.二、 本发明实施例还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，本方法采用水热大麦生物炭含氧官能团更加丰富，且具有泥炭性质，利于后续土壤微生物定殖，且还采用了植酸对生物炭进行改性，将生物炭的物理性质进行优化，具有植酸的生物炭在热解过程中更容易形成蜂窝形状，形态更整齐。且植酸盐改性生物炭能促进电子转移，其表面存在偏磷酸，偏磷酸易溶于水生成正磷酸（h3po4），对植物吸收磷有利；在改性后的生物炭上负载具有磷活化和根系促生能力的功能微生物菌群，如：解磷菌（侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、磷酸盐溶解性曲霉 ）；根际促生菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌），促进作物根系在土壤中的扎根深度及对磷元素的吸收。最后采用壳聚糖包裹材料，壳聚糖能在温和的酸度（ph4-5）下溶解，当根区的ph值足够低时，被包裹的复合材料才会释放，防止p被fe、al、ca固定，达到根际智能释放的目的；且该方法操作简便，使改性高碳磷比生物炭菌剂便于大规模批量生产，从而提高生产效率的同时，降低操作人员的操作难度。
65.三、 本发明实施例还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂在土壤肥力改善方面的应用，其能够应用于瘠薄坡耕地的典型作物体系中，可以提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，实现土壤培肥。
66.以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
技术特征：
1.一种改性高碳磷比生物炭菌剂，其特征在于，包括如下原料：生物炭和复合菌液，所述生物炭与所述复合菌液的质量体积比为1/（20-30） g/ml，所述复合菌液包括侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液，所述侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液的质量比为1:1:1:1:1。2.根据权利要求1所述的改性高碳磷比生物炭菌剂，其特征在于，在所述复合菌液中，枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
10
8 cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2.0
×
10
8 cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2.0
×
10
8 cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
10
8 cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉的活菌量≥10.0
×
10
8 cfu/ml。3.根据权利要求1所述的改性高碳磷比生物炭菌剂，其特征在于，还包括壳聚糖，所述壳聚糖涂覆于负载所述复合菌液的所述生物炭上。4.一种如权利要求1-3任意一项所述的改性高碳磷比生物炭菌剂在土壤肥力改善方面的应用。5.一种如权利要求1-3任意一项所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将大麦秸秆粉碎并过筛后得到大麦秸秆颗粒，将所述大麦秸秆颗粒于180-300℃水热碳化后得到生物炭粗品，将所述生物炭粗品与植酸溶液混合并热解后用超纯水冲洗至ph为中性，即得到所述生物炭；取侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌并活化后分别于30-35℃恒温培养18-24 h，得到侧孢芽孢杆菌固体培养基、巨大芽孢杆固体培养基、磷酸盐溶解性曲霉固体培养基、枯草芽孢杆菌固体培养基和地衣芽孢杆菌固体培养基，分别挑取侧孢芽孢杆菌固体培养基、巨大芽孢杆固体培养基、磷酸盐溶解性曲霉固体培养基、枯草芽孢杆菌固体培养基和地衣芽孢杆菌固体培养基中的菌落接种于液体培养基中并于25-30℃、150-200 rpm恒温培养至活菌数≥1.0
×
10
8 cfu/ml，得到所述侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液后按照质量比1:1:1:1:1进行混合后，即得到所述复合菌液；将所述生物炭加入到所述复合菌液内后振摇1.5-2.5 h后离心取沉淀，得到菌剂粗品；将所述菌剂粗品与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合后于12000-18000 rpm离心30-60 min后取最底层沉淀，即得到所述改性高碳磷比生物炭菌剂。6.根据权利要求5所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，所述植酸溶液的质量浓度为22-28%，所述生物炭粗品与所述植酸溶液的固液比为1:（1.5-2.5）。7.根据权利要求5所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，所述热解包括如下步骤：将所述生物炭粗品与所述植酸溶液混合后通入惰性气体将温度以8-12 ℃/min的速率从室温升高至100℃持续0.8-1.2 h后继续以8-12
ꢀ°
c/min的速率升高至250
°
c、450
°
c和650
°
c并分别持续1.8-2.2 h，然后降温至50℃后即完成热解。8.根据权利要求5所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，所述凝胶状高粘性壳聚糖基质的制备方法包括如下步骤：将壳聚糖溶解于ph为4的无水冰乙酸中，即制得所述凝胶状高粘性壳聚糖基质，所述壳聚糖与所述无水冰乙酸的质量体积比为35-45 mg/ml，所述无水冰乙酸内含有3.5-4.5 mol/l的naoh。9.根据权利要求5所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，所述生物
炭粗品在水热碳化后、与植酸溶液混合前还包括研磨步骤，所述生物炭粗品在所述研磨后的大小为200-250 μm。10.根据权利要求5所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，所述过筛的目数为100-200目。
技术总结
本发明提出了一种改性高碳磷比生物炭菌剂、制备方法及其应用，涉及微生物技术领域。其中该生物炭菌剂包括如下原料：生物炭和复合菌液，所述生物炭与所述复合菌液的质量体积比为1/（20-30）g/mL，该菌剂能够提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，实现土壤培肥，从而解决现目前土壤磷素有效性含量低、易被固定而导致的土壤贫瘠的技术问题；该生物炭菌剂的制备方法操作简便，使改性高碳磷比生物炭菌剂便于大规模批量生产，从而提高生产效率的同时，降低操作人员的操作难度。降低操作人员的操作难度。
技术研发人员：唐晓燕 查孟琴 兰思颉 胡思柳 黄容 吴英杰 李冰 王昌全
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/9/23
1.技术领域
2.本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种改性高碳磷比生物炭菌剂、制备方法及其应用。
背景技术：
3.现如今，由于错误的耕作、施肥等措施，造成大量水土流失，农业土壤质量退化等问题。川渝地区坡耕地比例大、质量低、障碍多，坡耕地有机质含量和饱和点低，始终徘徊在10 g/kg左右，2/3以上坡耕地有机质低于10 g/kg。因此坡耕地多源增碳消障技术和产品的研发意义重大，应用前景广阔。生物炭作为一种新型的土壤改良剂，自身具备优良的特性，成为近年来研究的热点，其施入土壤后会对土壤中碳、磷循环造成重要影响。土壤中的磷易被固定，有效磷含量低，解决土壤磷素有效性含量低、易被固定这一问题，是培肥土壤、提升作物产量的关键。
技术实现要素：
4.本发明的第一目的在于提供一种改性高碳磷比生物炭菌剂，该菌剂能够提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，实现土壤培肥，从而解决现目前土壤磷素有效性含量低、易被固定而导致的土壤贫瘠的技术问题。
5.本发明的第二目的在于提供一种改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，该制备方法操作简便，使改性高碳磷比生物炭菌剂便于大规模批量生产，从而提高生产效率的同时，降低操作人员的操作难度。
6.本发明的第三目的在于提供一种改性高碳磷比生物炭菌剂在土壤肥力改善方面的应用，该菌剂通过利用高c/p比大麦秸秆制备生物炭并负载磷活化及促生微生物菌群，可以提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，达到对坡耕地土壤培肥的目的。
7.相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：一、 本发明提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂，该菌剂通过将生物炭和细菌结合制备而成，通过利用高c/p比大麦秸秆制备生物炭并负载磷活化及促生微生物菌群，可以提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，达到对坡耕地土壤培肥的目的。
8.二、 本发明还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，本方法采用水热大麦生物炭含氧官能团更加丰富，且具有泥炭性质，利于后续土壤微生物定殖，且还采用了植酸对生物炭进行改性，将生物炭的物理性质进行优化，具有植酸的生物炭在热解过程中更容易形成蜂窝形状，形态更整齐。且植酸盐改性生物炭能促进电子转移，其表面存在偏磷酸，偏磷酸易溶于水生成正磷酸（h3po4），对植物吸收磷有利；在改性后的生物炭上负载具有磷活化和根系促生能力的功能微生物菌群，如：解磷菌（侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、磷酸盐溶解性曲霉 ）；根际促生菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌），促进作物根系在土壤中的扎
根深度及对磷元素的吸收。最后采用壳聚糖包裹材料，壳聚糖能在温和的酸度（ph4-5）下溶解，当根区的ph值足够低时，被包裹的复合材料才会释放，防止p被fe、al、ca固定，达到根际智能释放的目的；且该方法操作简便，使改性高碳磷比生物炭菌剂便于大规模批量生产，从而提高生产效率的同时，降低操作人员的操作难度。
9.三、 本发明还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂在土壤肥力改善方面的应用，其能够应用于瘠薄坡耕地的典型作物体系中，可以提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，实现土壤培肥。
具体实施方式
10.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
11.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
12.本发明实施例提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂，包括如下原料：生物炭和复合菌液，生物炭与复合菌液的质量体积比为1/（20-30） g/ml，复合菌液包括侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液，侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液的质量比为1:1:1:1:1。
13.在本发明的一些实施例中，在上述复合菌液中，枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2.0
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2.0
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉的活菌量≥10.0
×
108cfu/ml。
14.在本发明的一些实施例中，上述改性高碳磷比生物炭菌剂还包括壳聚糖，壳聚糖涂覆于负载复合菌液的生物炭上。
15.另一方面，本发明的实施例还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂在土壤肥力改善方面的应用。
16.另一方面，本发明的实施例还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，包括如下步骤：将大麦秸秆粉碎并过筛后得到大麦秸秆颗粒，将大麦秸秆颗粒于180-300℃水热碳化后得到生物炭粗品，将生物炭粗品与植酸溶液混合并热解后用超纯水冲洗至ph为中性，即得到生物炭；取侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌并活化后分别于30-35℃恒温培养18-24 h，得到侧孢芽孢杆菌固体培养基、巨大芽孢杆固体培养基、磷酸盐溶解性曲霉固体培养基、枯草芽孢杆菌固体培养基和地衣芽孢杆菌固体培养基，分别挑取侧孢芽孢杆菌固体培养基、巨大芽孢杆固体培养基、磷酸盐溶解性曲霉固体培养基、枯草芽孢杆菌固体培养基和地衣芽孢杆菌固体培养基中的菌落接种于液体培养基中并于25-30℃、150-200 rpm恒温培养至活菌数≥1.0
×
108cfu/ml，得到侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液后按照质量比1:1:1:1:1进行混合后，即得到复合菌液；将生物炭
加入到复合菌液内后振摇1.5-2.5 h后离心取沉淀，得到菌剂粗品；将菌剂粗品与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合后于12000-18000 rpm离心30-60 min后取最底层沉淀，即得到改性高碳磷比生物炭菌剂。
17.在本发明的一些实施例中，上述植酸溶液的质量浓度为22-28%，生物炭粗品与植酸溶液的固液比为1:（1.5-2.5）。
18.在本发明的一些实施例中，上述热解包括如下步骤：将生物炭粗品与植酸溶液混合后通入惰性气体将温度以8-12 ℃/min的速率从室温升高至100℃持续0.8-1.2 h后继续以8-12
ꢀ°
c/min的速率升高至250
°
c、450
°
c和650
°
c并分别持续1.8-2.2 h，然后降温至50℃后即完成热解。
19.在本发明的一些实施例中，上述凝胶状高粘性壳聚糖基质的制备方法包括如下步骤：将壳聚糖溶解于ph为4的无水冰乙酸中，即制得凝胶状高粘性壳聚糖基质，壳聚糖与无水冰乙酸的质量体积比为35-45 mg/ml，无水冰乙酸内含有3.5-4.5 mol/l的naoh。
20.在本发明的一些实施例中，上述生物炭粗品在水热碳化后、与植酸溶液混合前还包括研磨步骤，生物炭粗品在研磨后的大小为200-250 μm。
21.在本发明的一些实施例中，上述过筛的目数为100-200目。
22.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
23.实施例1生物炭粗品制备：采用粉碎机将大麦秸秆粉碎，过100目筛获得大麦秸秆颗粒采用低温水热炭化（180oc）制备生物炭粗品，将制备后的生物炭粗品研磨至200 μm备用。
24.植酸改性：将制备好的生物炭粗品与质量浓度为22%的植酸溶液按固液比1:1.5混合。在充分混合后，将其放入马弗炉中以开始热解。首先通过通入惰性气体氮气将温度以8
ꢀ°
c/min的速率从室温升高至100
ꢀ°
c持续1.2 h，然后以8
ꢀ°
c/min的速率升高至250
ꢀ°
c、450
ꢀ°
c和650
°
c并分别持续2.2 h。当马弗炉内温度降至50
ꢀ°
c时，取出生物炭并立即用超纯水冲洗，直至生物炭的ph为中性。
25.复合菌液制备：从-80℃冰箱中取出甘油保存的侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，置于-4℃冰箱解冻后，在超净台中用无菌接种针接种于中培养，使菌株充分活化，然后放置30℃恒温培养箱中培养18 h。再用无菌接种针挑取平皿中的菌株接种至液体培养基，将液体培养基置于25℃恒温摇床培养箱中，转速150 r/min，使发酵液中活菌数达到1.0
×
108cfu/ml以上。经活化、发酵后，计数，每种发酵液中有效活菌数》1.0
×
108cfu/ml。
26.根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释或浓缩后，取菌种的发酵液按照质量比1:1:1:1:1混合制得复合菌液，使复合菌液中枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉活菌量≥10
×
108cfu/ml。
27.复合菌液负载：将复合菌液在4℃和5000 rpm下离心10分钟，并将收集的细胞用蒸馏水洗涤五次
并重悬于pbs缓冲液（ph=7.0）中。将1 g生物炭加入到20 ml复合菌液中并振摇1.5小时，通过离心获得的沉淀即为复合菌剂粗品。
28.壳聚糖包裹：壳聚糖（35 mg）溶解在1 ml具有naoh（3.5 mol/l）的ph=4的无水冰乙酸中，获得凝胶状高粘性壳聚糖基质。将改性并负载微生物俊基后的生物炭与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合，以12000 rpm离心30 min。获得2个不同的沉淀层，最底层即为改性高碳磷比生物炭菌剂。
29.实施例2生物炭粗品制备：采用粉碎机将大麦秸秆粉碎，过200目筛获得大麦秸秆颗粒采用低温水热炭化（300oc）制备生物炭粗品，将制备后的生物炭粗品研磨至250 μm备用。
30.植酸改性：将制备好的生物炭粗品与质量浓度为28%的植酸溶液按固液比1:2.5混合。在充分混合后，将其放入马弗炉中以开始热解。首先通过通入惰性气体氮气将温度以12
ꢀ°
c/min的速率从室温升高至100
ꢀ°
c持续0.8 h，然后以12
ꢀ°
c/min的速率升高至250
ꢀ°
c、450
ꢀ°
c和650
°
c并分别持续1.8 h。当马弗炉内温度降至50
ꢀ°
c时，取出生物炭并立即用超纯水冲洗，直至生物炭的ph为中性。
31.复合菌液制备：从-80℃冰箱中取出甘油保存的侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，置于-4℃冰箱解冻后，在超净台中用无菌接种针接种于中培养，使菌株充分活化，然后放置35℃恒温培养箱中培养24 h。再用无菌接种针挑取平皿中的菌株接种至液体培养基，将液体培养基置于30℃恒温摇床培养箱中，转速200 r/min，使发酵液中活菌数达到1.0
×
108cfu/ml以上。经活化、发酵后，计数，每种发酵液中有效活菌数》1.0
×
108cfu/ml。
32.根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释或浓缩后，取菌种的发酵液按照质量比1:1:1:1:1混合制得复合菌液，使复合菌液中枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉活菌量≥10
×
108cfu/ml。
33.复合菌液负载：将复合菌液在4℃和5000 rpm下离心10分钟，并将收集的细胞用蒸馏水洗涤五次并重悬于pbs缓冲液（ph=7.0）中。将1 g生物炭加入到30 ml复合菌液中并振摇2.5小时，通过离心获得的沉淀即为复合菌剂粗品。
34.壳聚糖包裹：壳聚糖（45 mg）溶解在1 ml具有naoh（4.5 mol/l）的ph=4的无水冰乙酸中，获得凝胶状高粘性壳聚糖基质。将改性并负载微生物俊基后的生物炭与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合，以18000 rpm离心60 min。获得2个不同的沉淀层，最底层即为改性高碳磷比生物炭菌剂。
35.实施例3生物炭粗品制备：
采用粉碎机将大麦秸秆粉碎，过150目筛获得大麦秸秆颗粒采用低温水热炭化（240oc）制备生物炭粗品，将制备后的生物炭粗品研磨至225 μm备用。
36.植酸改性：将制备好的生物炭粗品与质量浓度为25%的植酸溶液按固液比1:2混合。在充分混合后，将其放入马弗炉中以开始热解。首先通过通入惰性气体氮气将温度以10
ꢀ°
c/min的速率从室温升高至100
ꢀ°
c持续1 h，然后以10
ꢀ°
c/min的速率升高至250
ꢀ°
c、450
ꢀ°
c和650
°
c并分别持续2 h。当马弗炉内温度降至50
ꢀ°
c时，取出生物炭并立即用超纯水冲洗，直至生物炭的ph为中性。
37.复合菌液制备：从-80℃冰箱中取出甘油保存的侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，置于-4℃冰箱解冻后，在超净台中用无菌接种针接种于中培养，使菌株充分活化，然后放置32℃恒温培养箱中培养21 h。再用无菌接种针挑取平皿中的菌株接种至液体培养基，将液体培养基置于28℃恒温摇床培养箱中，转速180 r/min，使发酵液中活菌数达到1.0
×
108cfu/ml以上。经活化、发酵后，计数，每种发酵液中有效活菌数》1.0
×
108cfu/ml。
38.根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释或浓缩后，取菌种的发酵液按照质量比1:1:1:1:1混合制得复合菌液，使复合菌液中枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉活菌量≥10
×
108cfu/ml。
39.复合菌液负载：将复合菌液在4℃和5000 rpm下离心10分钟，并将收集的细胞用蒸馏水洗涤五次并重悬于pbs缓冲液（ph=7.0）中。将1 g生物炭加入到25 ml复合菌液中并振摇2小时，通过离心获得的沉淀即为复合菌剂粗品。
40.壳聚糖包裹：壳聚糖（40 mg）溶解在1 ml具有naoh（4 mol/l）的ph=4的无水冰乙酸中，获得凝胶状高粘性壳聚糖基质。将改性并负载微生物俊基后的生物炭与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合，以15000 rpm离心45 min。获得2个不同的沉淀层，最底层即为改性高碳磷比生物炭菌剂。
41.实施例4生物炭粗品制备：采用粉碎机将大麦秸秆粉碎，过130目筛获得大麦秸秆颗粒采用低温水热炭化（230oc）制备生物炭粗品，将制备后的生物炭粗品研磨至220 μm备用。
42.植酸改性：将制备好的生物炭粗品与质量浓度为24%的植酸溶液按固液比1:1.8混合。在充分混合后，将其放入马弗炉中以开始热解。首先通过通入惰性气体氮气将温度以9
ꢀ°
c/min的速率从室温升高至100
ꢀ°
c持续1.1 h，然后以9
ꢀ°
c/min的速率升高至250
ꢀ°
c、450
ꢀ°
c和650
°
c并分别持续2.1 h。当马弗炉内温度降至50
ꢀ°
c时，取出生物炭并立即用超纯水冲洗，直至生物炭的ph为中性。
43.复合菌液制备：
从-80℃冰箱中取出甘油保存的侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，置于-4℃冰箱解冻后，在超净台中用无菌接种针接种于中培养，使菌株充分活化，然后放置31℃恒温培养箱中培养20 h。再用无菌接种针挑取平皿中的菌株接种至液体培养基，将液体培养基置于27℃恒温摇床培养箱中，转速170 r/min，使发酵液中活菌数达到1.0
×
108cfu/ml以上。经活化、发酵后，计数，每种发酵液中有效活菌数》1.0
×
108cfu/ml。
44.根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释或浓缩后，取菌种的发酵液按照质量比1:1:1:1:1混合制得复合菌液，使复合菌液中枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉活菌量≥10
×
108cfu/ml。
45.复合菌液负载：将复合菌液在4℃和5000 rpm下离心10分钟，并将收集的细胞用蒸馏水洗涤五次并重悬于pbs缓冲液（ph=7.0）中。将1 g生物炭加入到23 ml复合菌液中并振摇1.8小时，通过离心获得的沉淀即为复合菌剂粗品。
46.壳聚糖包裹：壳聚糖（39 mg）溶解在1 ml具有naoh（3.8 mol/l）的ph=4的无水冰乙酸中，获得凝胶状高粘性壳聚糖基质。将改性并负载微生物俊基后的生物炭与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合，以14000 rpm离心40 min。获得2个不同的沉淀层，最底层即为改性高碳磷比生物炭菌剂。
47.实施例5生物炭粗品制备：采用粉碎机将大麦秸秆粉碎，过170目筛获得大麦秸秆颗粒采用低温水热炭化（260oc）制备生物炭粗品，将制备后的生物炭粗品研磨至235 μm备用。
48.植酸改性：将制备好的生物炭粗品与质量浓度为27%的植酸溶液按固液比1:2.2混合。在充分混合后，将其放入马弗炉中以开始热解。首先通过通入惰性气体氮气将温度以11
ꢀ°
c/min的速率从室温升高至100
ꢀ°
c持续0.9 h，然后以11
ꢀ°
c/min的速率升高至250
ꢀ°
c、450
ꢀ°
c和650
°
c并分别持续1.9 h。当马弗炉内温度降至50
ꢀ°
c时，取出生物炭并立即用超纯水冲洗，直至生物炭的ph为中性。
49.复合菌液制备：从-80℃冰箱中取出甘油保存的侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，置于-4℃冰箱解冻后，在超净台中用无菌接种针接种于中培养，使菌株充分活化，然后放置33℃恒温培养箱中培养22 h。再用无菌接种针挑取平皿中的菌株接种至液体培养基，将液体培养基置于29℃恒温摇床培养箱中，转速190 r/min，使发酵液中活菌数达到1.0
×
108cfu/ml以上。经活化、发酵后，计数，每种发酵液中有效活菌数》1.0
×
108cfu/ml。
50.根据发酵液中的活菌数对发酵液进行稀释或浓缩后，取菌种的发酵液按照质量比1:1:1:1:1混合制得复合菌液，使复合菌液中枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
108cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌
的活菌量≥5
×
108cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉活菌量≥10
×
108cfu/ml。
51.复合菌液负载：将复合菌液在4℃和5000 rpm下离心10分钟，并将收集的细胞用蒸馏水洗涤五次并重悬于pbs缓冲液（ph=7.0）中。将1 g生物炭加入到27 ml复合菌液中并振摇2.2小时，通过离心获得的沉淀即为复合菌剂粗品。
52.壳聚糖包裹：壳聚糖（43 mg）溶解在1 ml具有naoh（4.2 mol/l）的ph=4的无水冰乙酸中，获得凝胶状高粘性壳聚糖基质。将改性并负载微生物俊基后的生物炭与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合，以16000 rpm离心50 min。获得2个不同的沉淀层，最底层即为改性高碳磷比生物炭菌剂。
53.对比例1将实施例3中的植酸溶液改性步骤取消，其余步骤与实施例3相同。
54.对比例2将实施例3中的复合菌液负载步骤取消，其余步骤与实施例3相同。
55.对比例3将实施例3中的生物炭粗品制备步骤取消，其余步骤均与实施例3相同。
56.其中实施例1-5和对比例1-3中所用磷酸盐溶解性曲霉为泡盛曲霉aspergillus awamori 3.11511，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均购自四川省眉山益稷农业科技有限公司。
57.实验例1取实施例3和对比例1-3所制得的复合菌剂并将其对夏季六月的玉米盆栽进行施用，施用周期为每月一次，一共施用半年，实施例3和对比例1-3的复合菌剂的施用量均为22.5t/hm2。
58.半年后测量玉米的株高、径粗和根长，所得结果如表1所示。
59.表1 盆栽玉米的株高、径粗和根长记录表处理株高（cm）径粗（cm）根长（cm）实施例388.981.8927.79对比例179.881.5224.35对比例273.451.4422.68对比例369.831.0517.54根据表1结果所示，施用实施例3所制得的复合菌剂的盆栽玉米的株高、径粗和根长均明显优于对比例1-3中所制得的复合菌剂，因此可见，本发明所提供的改性高碳磷比生物炭菌剂能够有效改善土壤的肥力，从而改良植物的生长情况。
60.实验例2取实施例3和对比例1-3所制得的复合菌剂并将其对夏季六月的玉米大田进行施用，施用周期为每月一次，一共施用半年，实施例3和对比例1-3的复合菌剂的施用量均为22.5t/hm2。
61.半年后测量玉米的株高、穗长、根长和产量，所得结果如表2所示。
62.表2 大田玉米的株高、径粗、根长和产量记录表处理株高（cm）径粗（cm）根长（cm）产量（t.hm-2
）实施例3220.3722.89
±
0.5184.3312.78对比例1214.4619.34
±
0.5162.7811.89对比例2199.7818.57
±
0.5145.4611.34对比例3170.5616.98
±
0.5124.8710.67根据表2结果所示，施用实施例3所制得的复合菌剂的大田玉米的株高、径粗、根长和产量均明显优于对比例1-3中所制得的复合菌剂，因此可见，本发明所提供的改性高碳磷比生物炭菌剂能够有效改善土壤的肥力，从而改良植物的生长情况，并提高植物的结实率，从而提高植物的产量。
63.综上所述，本发明实施例提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂、制备方法及其应用：一、 本发明实施例提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂，该菌剂通过将生物炭和细菌结合制备而成，通过利用高c/p比大麦秸秆制备生物炭并负载磷活化及促生微生物菌群，可以提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，达到对坡耕地土壤培肥的目的。
64.二、 本发明实施例还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，本方法采用水热大麦生物炭含氧官能团更加丰富，且具有泥炭性质，利于后续土壤微生物定殖，且还采用了植酸对生物炭进行改性，将生物炭的物理性质进行优化，具有植酸的生物炭在热解过程中更容易形成蜂窝形状，形态更整齐。且植酸盐改性生物炭能促进电子转移，其表面存在偏磷酸，偏磷酸易溶于水生成正磷酸（h3po4），对植物吸收磷有利；在改性后的生物炭上负载具有磷活化和根系促生能力的功能微生物菌群，如：解磷菌（侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、磷酸盐溶解性曲霉 ）；根际促生菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌），促进作物根系在土壤中的扎根深度及对磷元素的吸收。最后采用壳聚糖包裹材料，壳聚糖能在温和的酸度（ph4-5）下溶解，当根区的ph值足够低时，被包裹的复合材料才会释放，防止p被fe、al、ca固定，达到根际智能释放的目的；且该方法操作简便，使改性高碳磷比生物炭菌剂便于大规模批量生产，从而提高生产效率的同时，降低操作人员的操作难度。
65.三、 本发明实施例还提供了一种改性高碳磷比生物炭菌剂在土壤肥力改善方面的应用，其能够应用于瘠薄坡耕地的典型作物体系中，可以提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，实现土壤培肥。
66.以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
技术特征：
1.一种改性高碳磷比生物炭菌剂，其特征在于，包括如下原料：生物炭和复合菌液，所述生物炭与所述复合菌液的质量体积比为1/（20-30） g/ml，所述复合菌液包括侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液，所述侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液的质量比为1:1:1:1:1。2.根据权利要求1所述的改性高碳磷比生物炭菌剂，其特征在于，在所述复合菌液中，枯草芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
10
8 cfu/ml，巨大芽孢杆菌的活菌量≥2.0
×
10
8 cfu/ml，侧芽孢杆菌的活菌量≥2.0
×
10
8 cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌量≥5.0
×
10
8 cfu/ml，磷酸盐溶解性曲霉的活菌量≥10.0
×
10
8 cfu/ml。3.根据权利要求1所述的改性高碳磷比生物炭菌剂，其特征在于，还包括壳聚糖，所述壳聚糖涂覆于负载所述复合菌液的所述生物炭上。4.一种如权利要求1-3任意一项所述的改性高碳磷比生物炭菌剂在土壤肥力改善方面的应用。5.一种如权利要求1-3任意一项所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将大麦秸秆粉碎并过筛后得到大麦秸秆颗粒，将所述大麦秸秆颗粒于180-300℃水热碳化后得到生物炭粗品，将所述生物炭粗品与植酸溶液混合并热解后用超纯水冲洗至ph为中性，即得到所述生物炭；取侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、磷酸盐溶解性曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌并活化后分别于30-35℃恒温培养18-24 h，得到侧孢芽孢杆菌固体培养基、巨大芽孢杆固体培养基、磷酸盐溶解性曲霉固体培养基、枯草芽孢杆菌固体培养基和地衣芽孢杆菌固体培养基，分别挑取侧孢芽孢杆菌固体培养基、巨大芽孢杆固体培养基、磷酸盐溶解性曲霉固体培养基、枯草芽孢杆菌固体培养基和地衣芽孢杆菌固体培养基中的菌落接种于液体培养基中并于25-30℃、150-200 rpm恒温培养至活菌数≥1.0
×
10
8 cfu/ml，得到所述侧孢芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、磷酸盐溶解性曲霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液后按照质量比1:1:1:1:1进行混合后，即得到所述复合菌液；将所述生物炭加入到所述复合菌液内后振摇1.5-2.5 h后离心取沉淀，得到菌剂粗品；将所述菌剂粗品与凝胶状高粘性壳聚糖基质混合后于12000-18000 rpm离心30-60 min后取最底层沉淀，即得到所述改性高碳磷比生物炭菌剂。6.根据权利要求5所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，所述植酸溶液的质量浓度为22-28%，所述生物炭粗品与所述植酸溶液的固液比为1:（1.5-2.5）。7.根据权利要求5所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，所述热解包括如下步骤：将所述生物炭粗品与所述植酸溶液混合后通入惰性气体将温度以8-12 ℃/min的速率从室温升高至100℃持续0.8-1.2 h后继续以8-12
ꢀ°
c/min的速率升高至250
°
c、450
°
c和650
°
c并分别持续1.8-2.2 h，然后降温至50℃后即完成热解。8.根据权利要求5所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，所述凝胶状高粘性壳聚糖基质的制备方法包括如下步骤：将壳聚糖溶解于ph为4的无水冰乙酸中，即制得所述凝胶状高粘性壳聚糖基质，所述壳聚糖与所述无水冰乙酸的质量体积比为35-45 mg/ml，所述无水冰乙酸内含有3.5-4.5 mol/l的naoh。9.根据权利要求5所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，所述生物
炭粗品在水热碳化后、与植酸溶液混合前还包括研磨步骤，所述生物炭粗品在所述研磨后的大小为200-250 μm。10.根据权利要求5所述的改性高碳磷比生物炭菌剂的制备方法，其特征在于，所述过筛的目数为100-200目。
技术总结
本发明提出了一种改性高碳磷比生物炭菌剂、制备方法及其应用，涉及微生物技术领域。其中该生物炭菌剂包括如下原料：生物炭和复合菌液，所述生物炭与所述复合菌液的质量体积比为1/（20-30）g/mL，该菌剂能够提高土壤的有机质含量和作物磷的利用效率，实现土壤培肥，从而解决现目前土壤磷素有效性含量低、易被固定而导致的土壤贫瘠的技术问题；该生物炭菌剂的制备方法操作简便，使改性高碳磷比生物炭菌剂便于大规模批量生产，从而提高生产效率的同时，降低操作人员的操作难度。降低操作人员的操作难度。
技术研发人员：唐晓燕 查孟琴 兰思颉 胡思柳 黄容 吴英杰 李冰 王昌全
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/9/23
版权声明
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