一种含鲁米诺的缓释微球的制备方法与流程

1.本发明属于化学试剂技术领域，特别是涉及一种含鲁米诺的缓释微球的制备方法。


背景技术：

2.鲁米诺或称发光胺，是通用的发光化学试剂，在碱性(氢氧化钠溶液)和氧化(过氧化氢溶液)条件下,它可与血红素或血卟啉环内的铁离子发生氧化还原反应。血液中的血红素基团催化氧化剂在鲁米诺溶液的分解，反应产物激活鲁米诺化合物，在暗视野下可观察到蓝色荧光(425nm)。
3.在许多犯罪现场，都会出现血迹。通过有效的手段对犯罪现场血迹进行处理，可以得到大量关于犯罪现场尤其是潜在的犯罪现场的潜在物证信息，这为犯罪现场调查和重建提供了有力证据。但是，许多犯罪者为了逃避法律惩罚而清理或破坏犯罪现场和证据。即使现场未被破坏，直接提取现场血迹形态仍然难度很大。所以，基于鲁米诺极高的灵敏度和特异性等特点，可以探测到纳克级别的微量血迹，化学发光的工作原理也使鲁米诺更适合应用于大面积的血迹检测，因此，鲁米诺试剂常用于犯罪现场潜在血迹的检测，对法医调查有重要意义和应用价值。
4.但在实际应用中，鲁米诺试剂还有不足之处。在进行血迹检测时，鲁米诺溶液产生的荧光持续时间较短，仅可持续30秒左右，并且随着时间的推移，定性地可见光强的逐渐衰减，需要尽快记录，以保证检测结果。但由于鲁米诺溶液产生的荧光持续时间较短，法医在进行现场检测时，常常错过发光时间，未来得及进行拍照记录。这就需要在检测血迹时需要尽快记录，以保证检测结果，对实际操作要求较高，不利于实际应用血迹的检测。
5.因此，如何解决鲁米诺检测血迹发光短的问题，是当前本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

6.本发明主要解决的技术问题是提供一种含鲁米诺的缓释微球的制备方法，通过缓慢释放鲁米诺以延长鲁米诺与血液反应产生的荧光时间，解决现有技术中鲁米诺试剂检测血迹产生的荧光持续时间短的问题。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是提供一种含鲁米诺的缓释微球的制备方法，制备方法包括以下步骤：
8.将100～200mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于2～4ml二氯甲烷溶液中，得到第一混合溶液；
9.将50～150mg鲁米诺溶解于1～3ml氢氧化钠溶液中，得到第二混合溶液；
10.将0.5～1.5ml第二混合溶液加入第一混合溶液中，经超声30～60s乳化后得到初乳；
11.将初乳加入聚乙烯醇和氯化钠溶液中，经搅拌剪切5～15min后得到复乳；
12.将复乳加入5～15ml蒸馏水中，去除二氯甲烷溶液，固化成微球；
13.对微球依次进行收集、冷冻、干燥，得到缓释微球。
14.优选的,氢氧化钠溶液浓度为0.4mol/l。
15.优选的,超声乳化包括以下步骤：
16.第二混合溶液分散在第一混合溶液中；
17.使用超声仪将第二混合溶液和第一混合溶液进行超声乳化；
18.超声仪的工作频率为10～30kz,以使第二混合溶液和第一混合溶液均匀混合，得到初乳。
19.优选的,高速剪切后得到复乳包括以下步骤：
20.将聚乙烯醇和氯化钠溶液均匀混合，得到第三混合溶液；
21.将初乳分散在第三混合溶液中；
22.使用均质机将初乳和第三混合溶液进行高速剪切；
23.剪切速度为12000～15000rmp/min，已得到复乳。
24.优选的,聚乙烯醇的浓度为1～3％。
25.优选的,去除二氯甲烷溶液包括以下步骤：
26.将复乳逐滴加入蒸馏水中；
27.使用磁力搅拌器对复乳和蒸馏水进行高速搅拌；
28.搅拌速度为400～600rmp/min，搅拌时间为4-7h,以将二氯甲烷挥发，得到固化微粒。
29.优选的,将微球离心收集的步骤还包括：
30.使用去离子水洗涤微球。
31.优选的,缓释微球的保存温度在-40℃以下。
32.优选的,微球的干燥时间为12h以上。
33.本发明的有益效果：本发明公开一种含鲁米诺的缓释微球的制备方法，本发明利用plga良好的生物相容性和生物降解性能且降解速度可控,将其作为包含鲁米诺的缓释载体，将鲁米诺与plga制成缓释微球，鲁米诺包埋在plga中，缓慢释放被包埋的鲁米诺，通过控制鲁米诺的释放速率，延长了鲁米诺与血液的反应时间，从而延长了蓝光的发光时间，有助于法医们记录血液检测结果。
附图说明
34.图1为本发明的含鲁米诺的缓释微球的制备方法的流程示意图；
35.图2为本发明的鲁米诺溶液刚与血液接触时发光情况；
36.图3为本发明的鲁米诺-plga溶液刚与血液接触时发光情况；
37.图4为本发明的鲁米诺溶液与血液接触30s后发光情况；
38.图5为本发明的鲁米诺-plga溶液与血液接触30s发光情况；
39.图6为本发明的鲁米诺溶液与血液接触5min后发光情况；
40.图7为本发明的鲁米诺-plga溶液与血液接触5min发光情况；
41.图8为本发明的鲁米诺溶液与血液接触10min后发光情况；
42.图9为本发明的鲁米诺-plga溶液与血液接触10min发光情况。
具体实施方式
43.为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
44.需要说明的是，除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。
45.血迹是犯罪现场或潜在的犯罪现场最常见和最重要的物证，通过血痕检测可以从大量的可疑斑迹中初步筛选出可能是血的物证，有利于犯罪调查。鲁米诺，化学名3-氨基邻苯二甲酰肼，在碱性和氧化条件下，鲁米诺与血红素或血卟啉环内的铁离子发生反应，在暗视野下可观察到蓝色荧光。鲁米诺可以检测到纳克级的微量血迹，比其他预试验试剂的灵敏度高20倍，被广泛用于潜在血迹、大面积血迹、经过清洗或陈旧血迹的确证实验。此外，通过记录鲁米诺化学发光的位置、形状、亮度，可判断血迹形态、分布和数量，用于现场重建和案情分析。但是，由于鲁米诺在进行血迹检测时，产生的荧光持续时间较短，仅可持续30s左右，对于检测结果的记录，是一个不小的挑战，且观察结果须在黑暗环境下。因此，本发明提供一种含鲁米诺的缓释微球的制备方法，制备含鲁米诺的缓释微球，利用缓释制剂可缓慢释放里面包埋的药物以延长药物的释放时间的性能特点，将鲁米诺制成缓释制剂以进行血迹的检测，而使持效期大大延长，可以延长血迹的发光时间。
46.如图1所示，图1为本发明的含鲁米诺的缓释微球的制备方法的流程示意图，本发明采用复乳溶剂挥发法制备缓释微球，其原理是将原辅料先分别溶于两种互不相溶的溶剂中，再通过机械振荡或超声乳化的方法制成乳剂，然后使有机溶剂在一定条件下挥发除去，成球材料析出，固化成微球。此法具有包封率高、操作方法简便、重现性好、无需特殊设备等优点。
47.制备缓释微球的材料有聚乳酸-羟基乙酸共聚物、二氯甲烷、鲁米诺、氢氧化钠、聚乙烯醇、氯化钠溶液和蒸馏水，使用的仪器有天平、移液枪、超声仪、均质机、磁力搅拌器、冰箱、干燥机，本发明采用的实验材料和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
48.含鲁米诺的缓释微球的制备方法包括以下步骤：
49.步骤s1:将100～200mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于2～4ml二氯甲烷溶液中，得到第一混合溶液；
50.步骤s2:将50～150mg鲁米诺溶解于1～3ml氢氧化钠溶液中，得到第二混合溶液；
51.步骤s3:将0.5～1.5ml第二混合溶液加入第一混合溶液中，经超声30s-60s乳化后得到初乳；
52.步骤s4:将初乳加入聚乙烯醇和氯化钠溶液中，经搅拌剪切5～15min后得到复乳；
53.步骤s5:将复乳加入5～15ml蒸馏水中，去除二氯甲烷溶液，固化成微球；
54.步骤s6：对微球依次进行收集、冷冻、干燥，得到缓释微球。
55.实施例1：
56.使用天平称取100mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物,溶于2ml二氯甲烷溶液中，待充分溶解后得到第一混合溶液。其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)是一类可降解的功能高分子
有机聚合物,有良好的生物相容性和生物降解性能且降解速度可控,是一种良好的药物缓释载体。二氯甲烷为有机溶剂，有机溶剂是能溶解一些不溶于水的物质(如油脂、蜡、树脂、橡胶、染料等)的一类有机化合物，其特点是在常温常压下呈液态，具有较大的挥发性，在溶解过程中，溶质与溶剂的性质均无改变。在发明的其他实施例中，二氯甲烷可以替换成乙酸乙酯或丙酮等有机溶剂，可以是单独使用一种或者联合使用。
57.使用天平称取50mg鲁米诺，将鲁米诺加入1ml的氢氧化钠溶液中，待鲁米诺完全溶解于氢氧化钠中，得到第二混合溶液，其中，第二混合溶液为鲁米诺原液，需放在4℃的冰箱里避光保存。在本实施例中，氢氧化钠溶液的浓度为0.4mol/l，配备0.4mol/l的氢氧化钠溶液的步骤包括：使用天平准确称取1.6g氢氧化钠加入到100ml蒸馏水中，待氢氧化钠溶解于蒸馏水中，得到0.4mol/l的氢氧化钠溶液。
58.使用移液枪吸取0.5mg的第二混合溶液，作为内水相，加入到第一混合溶液中，使用超声仪将第二混合溶液和第一混合溶液进行超声乳化，超声仪的频率设置为20kz，超声时间为30s,使之乳化得到初乳。
59.将浓度为2％的聚乙烯醇(pva)和氯化钠(nacl)溶液均匀混合，得到第三混合溶液，作为外水相，聚乙烯醇具有良好的双亲性，能提高水相黏度并吸附在水-油界面，是很好的乳化剂和稳定剂，聚乙烯醇通常加入到外水相作为稳定剂，增大外水相的黏度和降低聚乳酸-羟基乙酸共聚物的扩散速度进而影响微球形态及最终性质。添加氯化钠来调节渗透压，以维持乳液的稳定。
60.使用移液枪吸取初乳，将初乳逐滴加入到5ml的第三混合溶液中，使用均质机将初乳与第三混合溶液进行高速剪切，均质机的转速设置为13500rmp/min，剪切时间为10min,制备得到复乳。均质机的转速影响复乳的粒径大小，转速越高，形成的颗粒越小。在外水相中添加氯化钠，微粒表面因吸附了分子而产生的立体位阻促进乳液液滴的稳定。氯化钠抑制药物渗漏，载药率随氯化钠浓度上升而增大。载药率为缓释微球中鲁米诺含量与称取的鲁米诺含量的比值。添加氯化钠可加强对药物释放的控制，添加氯化钠各组释放减慢。外水相添加氯化钠，有机溶剂挥发、聚合物固化变慢，形成更大更致密微球，内部小孔较少较小，缓释微球的药物释放速度减慢。
61.使用移液枪吸取复乳，将复乳逐滴加入5ml蒸馏水汇总，使用磁力搅拌器搅拌复乳，搅拌速度设置为500rmp/min，搅拌时间为5h,使二氯甲烷挥发，搅拌蒸发，固化成微球。
62.对微球依次进行收集、冷冻、干燥，得到缓释微球。离心收集微球，离心速率为3000rmp/min，离心时间为5min，将收集的微球使用去离子水洗涤3次，去除杂质。将收集的微球置于冰箱冷冻，然后通过干燥机干燥12h,得到含有鲁米诺的缓释微球，制好的缓释微球避光保存其保存温度在-40℃以下。
63.实施例2：
64.使用天平称取150mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物,溶于3ml二氯甲烷溶液中，待充分溶解后得到第一混合溶液。在发明的其他实施例中，二氯甲烷可以替换成乙酸乙酯或丙酮等有机溶剂，可以是单独使用一种或者联合使用。
65.使用天平称取100mg鲁米诺，将鲁米诺加入2ml的0.4mol/l氢氧化钠溶液中，待鲁米诺完全溶解于氢氧化钠中，得到第二混合溶液，其中，第二混合溶液为鲁米诺原液，需放在4℃的冰箱里避光保存。
66.使用移液枪吸取1mg的第二混合溶液，作为内水相，加入到第一混合溶液中，使用超声仪将第二混合溶液和第一混合溶液进行超声乳化，超声仪的频率设置为30kz，超声时间为50s,使之乳化得到初乳。
67.将浓度为1％的聚乙烯醇(pva)和氯化钠(nacl)溶液均匀混合，得到第三混合溶液，使用移液枪吸取初乳，将初乳逐滴加入到10ml的第三混合溶液中，使用均质机将初乳与第三混合溶液进行高速剪切，均质机的转速设置为14000rmp/min，剪切时间为15min,制备得到复乳。
68.使用移液枪吸取复乳，将复乳逐滴加入10ml蒸馏水汇总，使用磁力搅拌器搅拌复乳，搅拌速度设置为600rmp/min，搅拌时间为6h,使二氯甲烷挥发，搅拌蒸发，固化成微球。
69.对微球依次进行收集、冷冻、干燥，得到缓释微球。离心收集微球，离心速率为3500rmp/min，离心时间为7min，将收集的微球使用去离子水洗涤3次，去除杂质。将收集的微球置于冰箱冷冻，然后通过干燥机干燥13h,得到含有鲁米诺的缓释微球，制好的缓释微球避光保存，其保存温度在-40℃以下。
70.实施例3：
71.使用天平称取200mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物,溶于4ml二氯甲烷溶液中，待充分溶解后得到第一混合溶液。在发明的其他实施例中，二氯甲烷可以替换成乙酸乙酯或丙酮等有机溶剂，可以是单独使用一种或者联合使用。
72.使用天平称取150mg鲁米诺，将鲁米诺加入3ml的0.4mol/l氢氧化钠溶液中，待鲁米诺完全溶解于氢氧化钠中，得到第二混合溶液，其中，第二混合溶液为鲁米诺原液，需放在4℃的冰箱里避光保存。
73.使用移液枪吸取1.5mg的第二混合溶液，作为内水相，加入到第一混合溶液中，使用超声仪将第二混合溶液和第一混合溶液进行超声乳化，超声仪的频率设置为30kz，超声时间为60s,使之乳化得到初乳。
74.将浓度为3％的聚乙烯醇(pva)和氯化钠(nacl)溶液均匀混合，得到第三混合溶液，使用移液枪吸取初乳，将初乳逐滴加入到10ml的第三混合溶液中，使用均质机将初乳与第三混合溶液进行高速剪切，均质机的转速设置为15000rmp/min，剪切时间为15min,制备得到复乳。
75.使用移液枪吸取复乳，将复乳逐滴加入10ml蒸馏水汇总，使用磁力搅拌器搅拌复乳，搅拌速度设置为600rmp/min，搅拌时间为7h,使二氯甲烷挥发，搅拌蒸发，固化成微球。
76.对微球依次进行收集、冷冻、干燥，得到缓释微球。离心收集微球，离心速率为4000rmp/min，离心时间为10min，将收集的微球使用去离子水洗涤3次，去除杂质。将收集的微球置于冰箱冷冻，然后通过干燥机干燥14h,得到含有鲁米诺的缓释微球，制好的缓释微球避光保存，其保存温度在-40℃以下。
77.从前述三个实施例制备的缓释微球进行比对，缓释微球的大小、表面形态都有所不同，其中，聚乙烯醇(pva)的浓度在1％～3％之间，缓释微球的粒径随聚乙烯醇的浓度上升而下降。搅拌速度的改变对缓释微球的粒径大小和表面形态有所影响。
78.在实施例1的基础上，调配鲁米诺溶液和鲁米诺-plga溶液，并将此两种溶液置于同一环境中，分别与血液反应，观察两种溶液与血液的反应结果。
79.首先，调配鲁米诺溶液：
80.步骤(1):取2ml的30％wt/v过氧化氢加入到98ml的蒸馏水中，配制成0.176m过氧化氢溶液。其中，wt/v表示质量体积比。
81.步骤(2):称取1.6g氢氧化钠，并将其加入到100ml蒸馏水中，制备0.4m氢氧化钠溶液。其中，1m氢氧化钠溶液就是1mol/l氢氧化钠溶液，氢氧化钠的相对分子量是40.01，制备1m的氢氧化钠溶液需要称取40.01g的氢氧化钠固体溶于1l的蒸馏水。
82.步骤(3):称取100mg鲁米诺加入25ml的0.4m氢氧化钠溶液中，用蒸馏水稀释至100ml，制备出0.004m鲁米诺原液，并将鲁米诺原液放在4℃的冰箱里避光保存。
83.步骤(4):将0.176m过氧化氢溶液、0.4m氢氧化钠溶液和0.004m鲁米诺原液各1ml与7ml的蒸馏水混合，制备10ml鲁米诺溶液。鲁米诺溶液需在制备4h内使用，冰箱内避光保存。
84.根据鲁米诺溶液的配置方法，配置鲁米诺-plga溶液，根据包封率换算，称取含鲁米诺的量相等的缓释微球替换上述鲁米诺，制得鲁米诺-plga溶液,鲁米诺-plga溶液中鲁米诺含量与鲁米诺溶液中鲁米诺含量相当。其中，包封率＝微球中药物含量/(微球药物含量+游离药物含量)
×
100％。
85.制备好鲁米诺溶液和鲁米诺-plga溶液后，将这两种溶液在同一环境中分别滴在有血液的白布上，与血液接触，分别记录即时、30s、5min、10min的测试结果。
86.如图2和图3所示，图2为本发明的鲁米诺溶液刚与血液接触时发光情况，图3为本发明的鲁米诺-plga溶液刚与血液接触时发光情况。观察鲁米诺溶液和鲁米诺-plga溶液分别与血液的反应情况，当鲁米诺溶液和鲁米诺-plga溶液与血液一接触，反应马上开始，鲁米诺溶液和鲁米诺-plga溶液与血液反应均发出明显的蓝光。
87.如图4和图5所示，图4为本发明的鲁米诺溶液与血液接触30s后发光情况，图5为本发明的鲁米诺-plga溶液与血液接触30s发光情况。继续观察鲁米诺溶液和鲁米诺-plga溶液与血液的反应情况，反应30s后，鲁米诺溶液与血液的反应几乎不再发出蓝光，但是鲁米诺-plga溶液与血液仍旧在反应，依旧能看到发出蓝光。
88.如图6和图7所示，图6为本发明的鲁米诺溶液与血液接触5min后发光情况，图7为本发明的鲁米诺-plga溶液与血液接触5min发光情况。继续观察鲁米诺溶液和鲁米诺-plga溶液与血液的反应情况，反应5min后，鲁米诺溶液与血液不再反应，也没有蓝光发出，但是鲁米诺-plga溶液与血液仍旧在反应，依旧能看到发出蓝光。
89.如图8和图9所示，图8为本发明的鲁米诺溶液与血液接触10min后发光情况，图9为本发明的鲁米诺-plga溶液与血液接触10min发光情况。继续观察鲁米诺溶液和鲁米诺-plga溶液与血液的反应情况，反应10min后，鲁米诺-plga溶液与血液几乎不再发生反应，几乎观察不到蓝光发出。
90.从鲁米诺溶液和鲁米诺-plga溶液与血液的反应结果可明显看出，鲁米诺-plga溶液与血液反应产生蓝光的时间持续更长，鲁米诺溶液与血迹接触时，鲁米诺溶液产生的荧光持续时间较短，仅可持续30s左右,鲁米诺溶液几乎不与血液反应，也几乎看不到蓝光。
91.本发明利用plga良好的生物相容性和生物降解性能且降解速度可控,将其作为包含鲁米诺的缓释载体，将鲁米诺与plga制成缓释微球，鲁米诺包埋在plga中，缓慢释放被包埋的鲁米诺，通过控制鲁米诺的释放速率，延长了鲁米诺与血液的反应时间，从而延长了蓝光的发光时间，有助于法医们记录血液检测结果。
92.以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种含鲁米诺的缓释微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将100～200mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于2～4ml二氯甲烷溶液中，得到第一混合溶液；将50～150mg鲁米诺溶解于1～3ml氢氧化钠溶液中，得到第二混合溶液；将0.5～1.5ml所述第二混合溶液加入所述第一混合溶液中，经超声30～60s乳化后得到初乳；将所述初乳加入聚乙烯醇和氯化钠溶液中，经搅拌剪切5～15min后得到复乳；将所述复乳加入5～15ml蒸馏水中，去除所述二氯甲烷溶液，固化成微球；对所述微球依次进行收集、冷冻、干燥，得到缓释微球。2.根据权利要求1所述的含鲁米诺的缓释微球的制备方法，其特征在于,所述氢氧化钠溶液浓度为0.4mol/l。3.根据权利要求1所述的含鲁米诺的缓释微球的制备方法，其特征在于，所述超声乳化包括以下步骤：所述第二混合溶液分散在所述第一混合溶液中；使用超声仪将所述第二混合溶液和第一混合溶液进行超声乳化；所述超声仪的工作频率为10～30kz,以使所述所述第二混合溶液和第一混合溶液均匀混合，得到所述初乳。4.根据权利要求1所述的含鲁米诺的缓释微球的制备方法，其特征在于，所述高速剪切后得到复乳包括以下步骤：将所述聚乙烯醇和氯化钠溶液均匀混合，得到第三混合溶液；将所述初乳分散在所述第三混合溶液中；使用均质机将所述初乳和第三混合溶液进行高速剪切；剪切速度为12000～15000rmp/min，已得到所述复乳。5.根据权利要求4所述的含鲁米诺的缓释微球的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇的浓度为1～3％。6.根据权利要求1所述的含鲁米诺的缓释微球的制备方法，其特征在于，所述去除所述二氯甲烷溶液包括以下步骤：将所述复乳逐滴加入所述蒸馏水中；使用磁力搅拌器对所述复乳和蒸馏水进行高速搅拌；搅拌速度为400～600rmp/min，搅拌时间为4-7h,以将所述二氯甲烷挥发，得到固化微粒。7.根据权利要求1所述的含鲁米诺的缓释微球的制备方法，其特征在于，所述将所述微球离心收集的步骤还包括：使用去离子水洗涤所述微球。8.根据权利要求1所述的含鲁米诺的缓释微球的制备方法，其特征在于，所述缓释微球的保存温度在-40℃以下。9.根据权利要求1所述的含鲁米诺的缓释微球的制备方法，其特征在于，所述微球的干燥时间为12h以上。

技术总结
本发明公开一种含鲁米诺的缓释微球的制备方法，本发明利用PLGA良好的生物相容性和生物降解性能且降解速度可控,将其作为包含鲁米诺的缓释载体，将鲁米诺与PLGA制成缓释微球，鲁米诺包埋在PLGA中，缓慢释放被包埋的鲁米诺，通过控制鲁米诺的释放速率，延长了鲁米诺与血液的反应时间，从而延长了蓝光的发光时间，有助于法医们记录血液检测结果。有助于法医们记录血液检测结果。有助于法医们记录血液检测结果。


技术研发人员：徐瑞光 卢小军 贺进田
受保护的技术使用者：徐瑞光
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/9/23