一种膝状狭养单胞菌SD-3及其在降解有机污染物中的应用

一种膝状狭养单胞菌sd-3及其在降解有机污染物中的应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一株新菌株
‑‑
膝状狭养单胞菌及其在降解有机污染物中的应用。
(二)

背景技术：

2.乙醛，又名醋醛，是一种无色液体，易挥发，有刺激性气味，能够与水和乙醇等一些有机物质互溶。乙醛是有机化合物、醛类的一种，也是一种2类致癌物质。乙醛易燃易挥发，蒸汽能够与空气形成爆炸性混合物。
3.目前乙醛在工农业使用的日益增加，不仅造成环境的污染，而且还会危害到人类身体健康。乙醛具有生物毒性质，暴露在人类周围不同浓度的乙醛会对皮肤，眼睛、呼吸道造成刺激，长期接触乙醛还会使人体表现出类似慢性酒精中毒的性状。此外，乙醛还具有致癌性，高毒性和诱变性。
4.在厨余垃圾降解初期中，乙醛是产生的典型污染物之一，因此研究环境中乙醛的高效降解对人类的生活环境的改善是很有必要的，通过文献检索发现王振杰等在2018年在小鼠胃肠道中分离出三株能够降解乙醛的粪肠球菌；田静等获得一株具有乙醛降解能力的醋酸单胞菌。但这些菌株对于乙醛的降解存在一定的延迟期。
5.目前，需要筛选一种能够在较短时间内开始降解乙醛等有机污染物的菌株，尚未发现有关膝状狭养单胞菌以乙醛为唯一碳源来实现降解的报道。
(三)

技术实现要素：

6.本发明目的是提供一株新菌株
‑‑
膝状狭养单胞菌(stenotrophomonas geniculata)sd-3及其在降解有机污染物中的应用，该菌株能以乙醛等有机酸污染物为唯一碳源实现快速降解，并且生长环境温和，易扩大培养，具有高效、去除能力强的乙醛降解能力。该降解菌的发现对于厨余垃圾、垃圾填埋场和酿酒行业废水废气中乙醛等常见污染物的高效净化有重要意义。
7.本发明采用的技术方案是：
8.本发明提供一株新菌株
‑‑
膝状狭养单胞菌(stenotrophomonas geniculata)sd-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m2023242，保藏日期：2023年03月03日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
9.本发明膝状狭养单胞菌sd-3的基本特征为：菌落呈白色、不透光，易挑取，菌苔沿划线生长；透射电镜下形态为椭圆形、有鞭毛，好氧。
10.本发明还提供一种所述膝状狭养单胞菌sd-3在降解有机污染物中的应用，具体所述的应用是将膝状狭养单胞菌sd-3接种至含有机污染物的ph5-9(优选ph6-8)的无机盐培养液中，在25-35℃、100-200rpm条件下进行培养，实现有机污染物的降解。
11.进一步，所述有机污染物包括乙醛、甲醇、乙醇、乙酸、乙酸乙酯。
12.进一步，所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为156-470mg/l，优选300mg/l。
13.进一步，所述膝状狭养单胞菌杆菌sd-3以静息细胞形式加入，所述无机盐培养液中，静息细胞加入量以菌体干重计为10-100mg/l，优选50mg/l。
14.进一步，优选培养条件为30℃、160rpm。
15.进一步，所述无机盐培养液组成为：k2hpo4·
3h2o 0.942g/l、kh2po
4 0.234g/l、nano
3 1.7g/l、nh4cl 0.98g/l、mgcl
·
6h2o 0.2033g/l、cacl
·
2h2o 0.11g/l、fecl30.0162g/l、微量元素母液5ml/l，溶液去离子水，ph 7.0；其中微量元素母液组成：cuso4·
5h2o 0.02g/l、feso4·
7h2o 1.0g/l、mnso4·
4h2o 0.02g/l、cocl
·
6h2o 0.02g/l、h3bo
3 0.014g/l、znso4·
7h2o 0.10g/l，溶剂为去离子水。
16.本发明膝状狭养单胞菌sd-3以静息细胞形式接种，所述静息细胞按如下步骤制备：
17.(1)斜面培养：将膝状狭养单胞菌sd-3接种于斜面lb固体培养基，30℃培养24～36h，获得斜面菌体；所述lb固体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，琼脂18～20g/l，溶剂为去离子水，ph值自然；
18.(2)扩大培养：用接种环挑取步骤(1)获得的斜面菌体接种至lb液体培养基中，30℃培养24～36h，获得od
600
＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，灭菌的去离子水洗涤，获得膝状狭养单胞菌sd-3静息细胞；所述lb液体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
19.与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
20.本发明提供的膝状狭养单胞菌sd-3取自某厨余垃圾处理厂污水处理站曝气池和厨余垃圾臭气处理设施生物段循环段，对于乙醛等有机污染物具有高效的降解效果，可以在较短时间内开始降解，并能较为完全地将污染物转化成co2、h2o等无害的物质；同时，该菌株也能不同程度地降解其他的乙酸、乙醇等厨余臭气中常见的污染物，因而在厨余垃圾堆肥产生的臭气处理中的生物净化技术中有广阔的应用前景。
21.本发明所述的膝状狭养单胞菌sd-3能将乙醛完全降解为无机物(co2、h2o)和细胞生物质，实现完全矿化，且对于300mg/l以内的乙醛的去除率高达100％。而且，该膝状狭养单胞菌对于厨余垃圾常见的臭气成分(如乙酸)具有高效的降解能力，且能够承受较高浓度的污染物。
(四)附图说明
22.图1为菌株sd-3在lb培养基上菌落形态照片。
23.图2为菌株sd-3的透射电子显微镜照片。
24.图3为菌株sd-3的系统发育树图。
25.图4为膝状狭养单胞菌sd-3对于48h内不同浓度乙醛的降解曲线。
26.图5为膝状狭养单胞菌sd-3在48h内在不同ph对于300mg/l乙醛的降解效果。
(五)具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
28.下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说
明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
29.所述无机盐培养液组成为：k2hpo4·
3h2o 0.942g/l、kh2po
4 0.234g/l、nano31.7g/l、nh4cl 0.98g/l、mgcl
·
6h2o 0.2033g/l、cacl
·
2h2o 0.11g/l、fecl
3 0.0162g/l、微量元素母液5ml/l，溶液去离子水，ph 7.0；其中微量元素母液组成：cuso4·
5h2o0.02g/l、feso4·
7h2o 1.0g/l、mnso4·
4h2o 0.02g/l、cocl
·
6h2o 0.02g/l、h3bo30.014g/l、znso4·
7h2o 0.10g/l，溶剂为去离子水。
30.所述lb固体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，琼脂18g-20g，溶剂为去离子水，ph自然。
31.实施例1：菌株sd-3的分离、纯化及其鉴定。
32.1、菌株sd-3的分离、纯化。
33.菌株sd-3是从某厨余垃圾处理站曝气池活性污泥和厨余垃圾臭气处理设施的生物段循环液，具体步骤如下：
34.初筛：从现场采样含活性污泥的水样500ml，将水样放置于2l的量杯中，加入上述的无机盐培养液1.5l，以100mg/l乙醛作为唯一碳源，在室温下驯化15天，每天重新添加乙醛，使乙醛浓度达到100mg/l，以提供足够的碳源，每隔三天更换无机培养液保证有氮源。
35.复筛：在250ml的摇瓶中加入50ml无机盐培养液，并加5ml初筛驯化15天后的上清液水样和浓度50mg/l的乙醛，摇瓶密封，在30℃进行富集培养，待乙醛浓度为初始加入浓度的50％时，从中取出5ml富集液于50ml新鲜无机盐培养液中，加入相同量的乙醛(使其浓度为50mg/l)，重复上述富集过程5次后，将最后一次富集液用无菌水稀释1500倍后划线lb固体培养基，30℃培养，选择单菌落划线接种至lb固体培养基，30℃培养24h。将单菌落加入无机盐培养液，并加入终浓度100mg/l乙醛唯一的碳源及能源，30℃培养24h，挑选乙醛降解率最高的培养液对应的单菌落，即得到目的菌株，记为菌株sd-3。
36.2、菌株sd-3的鉴定
37.1、菌落形态
38.将菌株sd-3接种至lb固体培养基，30℃培养24h，菌落形态照片见图1。透射电子显微镜确定其形态(图2)。
39.2、16s rrna序列分析
40.采用prepman ultra kits核酸萃取剂提取菌株sd-3的dna，4℃保存。采用细菌通用引物(正向引物：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；反向引物：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)在abi公司pcr扩增仪中进行扩增。采用applied biosystems 3500基因分析仪对pcr纯化后产物进行核酸测序。测序工作由浙江天科高新技术发展有限公司完成。菌株的16s rdna序列如下(genebank登录号为oq457022)，seq id no.1：
41.cagtcgaacggcagcacagaggagcttgctccttgggtggcgagtggcggacgggtgaggaatacatcggaatctactctgtcgtgggggataacgtagggaaacttacgctaataccgcatacgacctacgggtgaaagcaggggatcttcggaccttgcgcgattgaatgagccgatgtcggattagctagttggcggggtaaaggcccaccaaggcgacgatccgtagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccataccgcgtgggtgaagaaggccttcgggttgta
aagcccttttgttgggaaagaaatccagctggctaatacccggttgggatgacggtacccaaagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttactcggaattactgggcgtaaagcgtgcgtaggtggtcgtttaagtccgttgtgaaagccctgggctcaacctgggaactgcagtggatactgggcgactagagtgtggtagagggtagcggaattcctggtgtagcagtgaaatgcgtagagatcaggaggaacatccatggcgaaggcagctacctggaccaacactgacactgaggcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgcgaactggatgttgggtgcaatttggcacgcagtatcgaagctaacgcgttaagttcgccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagtatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgtcgagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactcgaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtccttagttgccagcacgtaatggtgggaactctaaggagaccgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtactacaatggtagggacagagggctgcaagccggcgacggtaagccaatcccagaaaccctatctcagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttt。
42.3、菌株sd-3的生理生化实验鉴定
43.菌株sd-3对梅里埃gn卡上62种碳源的利用能力：利用梅里埃全自动鉴定仪考察菌株对62种不同碳源的代谢情况(委托给浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))。鉴定结果如表1所示。经梅里埃全自动鉴定仪vitek生化反应，菌株sd-3可较强利用12种碳源，对其它50种碳源不能利用。
44.表1菌株sd-3梅里埃全自动鉴定仪vitek生化反应结果(gn卡)
[0045][0046][0047]
表注：+，阳性反应：-：阴性反应
[0048]
通过对菌株sd-3的形态特征及生理生化特征进行研究和分析，同时将该菌16srrna序列同ncbi数据库中的基因序列进行blast对比，结合16s rna同源性分析构建系统发生(如图3)，从而确定该菌株sd-3为stenotrophomonas geniculata，命名为膝状狭养单胞菌(stenotrophomonas geniculata)sd-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编
号：cctcc no：m2023242，保藏日期：2023年03月03日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
[0049]
实施例2、膝状狭养单胞菌sd-3静息细胞的获得。
[0050]
1、斜面培养：
[0051]
将膝状狭养单胞菌sd-3接种至lb液体培养基中，在30℃，160rpm下培养24～36h，再将活化的细菌划线于固体lb平板30℃培养箱培养，取单菌落继续平板画线以检测细菌的纯度，进行lb试管斜面常规(4℃)保存。
[0052]
2、扩大培养
[0053]
将步骤1中的斜面菌体接种至lb液体培养基中，在30℃，160rpm下培养24～36h，获得od
600
＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，灭菌的去离子水洗涤，获得膝状狭养单胞菌sd-3静息细胞。
[0054]
实施例3：膝状狭养单胞菌sd-3对不同浓度的乙醛的降解性能的检测。
[0055]
将无机盐培养液分装在体积均为250ml的摇瓶中，每瓶50ml，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到50mg/l(以细胞干重记)实施例2方法获得的静息细胞，然后加入乙醛作为唯一的碳源使其终浓度分别为156.7、235.1、313.4、391.4、470.1mg/l，摇瓶密封后，30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时取样采用气相色谱法测定摇瓶中残留的乙醛浓度，绘制菌株随着时间变化对于不同初始浓度乙醛的去除率曲线，结果见图4所示。结果表明，当乙醛浓度低于300mg/l，菌株sd-3可以快速地降解添加的底物。
[0056]
采用福立9790ii气相色谱仪检测气相中乙醛的浓度。色谱柱为kb-5(30m
×
0.32mm
×
0.5μm)。进样口、检测器(fid)和柱温分别为120、200和80℃，辅助炉温度为100℃，分流比为100:1。氢气流量为30ml/min，气流为300ml/min，载气氮气流量为30ml/min，气体注入量为1ml。
[0057]
实施例4：膝状狭养单胞菌sd-3在不同初始ph环境下对于300mg/l的乙醛的降解性能检测。
[0058]
用1mol/l naoh水溶液或1mol/l hcl水溶液调节无机盐培养液为不同ph值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，在初始乙醛浓度为200mg/l的条件下接入实施例2方法制备的膝状狭养单胞菌sd-3静息细胞，使各平行样中的初始细胞干重为50mg/l。将样品于30℃，160rpm恒温摇床里振荡培养，并做不加细菌的空白对照(kb)。定时采用实施例3方法测定摇瓶中残留的乙醛浓度，绘制菌株sd-3在不同ph环境下对乙醛随着时间变化的去除率曲线以及在48h内不同ph对于300mg/l的乙醛的降解率，结果见图5所示。结果表明，在各ph下，膝状狭养单胞菌sd-3均能降解乙醛，且在ph为6-8时对乙醛的降解效果最好。
[0059]
实施例5：膝状狭养单胞菌sd-3对不同碳源底物的降解能力
[0060]
在实际应用中，不仅仅存在乙醛这一种有机污染物，厨余垃圾臭气一般包含多种挥发性有机废气。因此，研究膝状狭养单胞菌sd-3对其他底物的降解效果很有必要，采用实施例3实验操作，将碳源改为初始浓度为100mg/l的甲醇、乙醇、乙酸、d-柠檬烯、二硫化碳、乙酸乙酯和氨水，其他操作同实施例3，降解效果如表2所示。
[0061]
表2菌株sd-3对不同底物的降解能力
[0062][0063][0064]
注：“+”有降解能力；
“‑”
无降解能力。

技术特征：
1.膝状狭养单胞菌(stenotrophomonas geniculata)sd-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m2023242，保藏日期：2023年03月03日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。2.一种权利要求1所述膝状狭养单胞菌sd-3在降解有机污染物中的应用。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是将膝状狭养单胞菌sd-3接种至含有机污染物的ph5-9的无机盐培养液中，在25-35℃、100-200rpm条件下进行培养，实现有机污染物的降解。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述有机污染物包括乙醛、甲醇、乙醇、乙酸、乙酸乙酯。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为156-470mg/l。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述膝状狭养单胞菌杆菌sd-3以静息细胞形式加入，所述无机盐培养液中，静息细胞加入量以菌体干重计为10-100mg/l。7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述无机盐培养液组成为：k2hpo4·
3h2o0.942g/l、kh2po
4 0.234g/l、nano
3 1.7g/l、nh4cl 0.98g/l、mgcl
·
6h2o 0.2033g/l、cacl
·
2h2o 0.11g/l、fecl
3 0.0162g/l、微量元素母液5ml/l，溶液去离子水，ph 7.0；其中微量元素母液组成：cuso4·
5h2o 0.02g/l、feso4·
7h2o 1.0g/l、mnso4·
4h2o 0.02g/l、cocl
·
6h2o 0.02g/l、h3bo
3 0.014g/l、znso4·
7h2o 0.10g/l，溶剂为去离子水。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述静息细胞按如下步骤制备：(1)斜面培养：将膝状狭养单胞菌sd-3接种于斜面lb固体培养基，30℃培养24～36h，获得斜面菌体；所述lb固体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，琼脂18～20g/l，溶剂为去离子水，ph值自然；(2)扩大培养：用接种环挑取步骤(1)获得的斜面菌体接种至lb液体培养基中，30℃培养24～36h，获得od
600
＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，灭菌的去离子水洗涤，获得膝状狭养单胞菌sd-3静息细胞；所述lb液体培养基终浓度组成为：nacl 10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。

技术总结
本发明公开了一种膝状狭养单胞菌(Stenotrophomonas geniculata)SD-3及其在降解有机污染物中的应用，本发明膝状狭养单胞菌SD-3对于乙醛等有机污染物具有高效的降解效果，可以较为完全地将污染物转化成CO2、H2O等无害的物质；同时，该菌株也能不同程度地降解其他的乙酸、乙醇等厨余臭气中常见的污染物，因而在厨余垃圾堆肥产生的臭气处理中的生物净化技术中有广阔的应用前景。本发明所述的膝状狭养单胞菌SD-3对于300mg/L以内的乙醛的去除率高达100％。而且，该膝状狭养单胞菌对于厨余垃圾常见的臭气成分(如乙酸)具有高效的降解能力，且能够承受较高浓度的污染物。且能够承受较高浓度的污染物。


技术研发人员：薛福浩 寿登 成卓韦 陈建孟 陈东之 於建明
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/9/23