一株纤维素降解菌及其在油茶粕可溶性膳食纤维改性中的应用

1.本发明属于功能纤维组分生物提取利用技术领域，具体涉及一株纤维素降解菌及其在油茶粕降糖、降脂功能纤维组分高效制备中的应用，该菌株用于发酵提取油茶粕可溶性膳食纤维，能高效获取具有降糖、降脂功能特性的可溶性纤维组分。


背景技术：

2.随着生活水平的提升，人们的饮食结构发生了明显改变，糖类和脂类的摄入量占比较高，导致糖尿病、高血脂、高胆固醇等疾病的发生率居高不下，严重危害了人们的生命健康安全。膳食纤维(dietary fiber，df)是一类不能被人体消化道消化的碳水化合物及其衍生物的统称。大量研究证明，摄入适量的df能降低糖尿病、肥胖症等疾病的发生风险，改善患者的症状。df通常具有疏松多孔的网状结构，其中包含了大量活性基团，赋予了df优良的膨胀性能和吸附性能，使其能在消化道中吸收水、葡萄糖、油脂等物质，抑制消化酶活性，同时使人体产生较强饱腹感，避免过多热量的摄入。此外，df能被肠道菌群酵解产生大量代谢物，维持宿主肠道内环境稳态，降低胃肠道疾病发生风险。因此，目前膳食纤维相关食品已受到消费者青睐，更多低成本优质膳食纤维资源的发掘对于产业发展及人们的健康安全具有重要意义。
3.油茶粕是油茶籽提油后的副产物，随着油茶产业规模的不断扩大，油茶粕产量也呈指数级增长，年产量可达百万吨。油茶粕富含活性物质，其中碳水化合物占比超过了40％，是df的理想来源。但除了少量油茶粕被用作动物饲料或有机肥外，大部分都被当作农业废物进行处理，造成了极大的资源浪费和环境污染。根据df的水溶性，可将其分为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，sdf)和不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，idf)两类。由于优越的理化性质(如高粘度，乳化性，发酵)，sdf通常具有更广泛的应用前景功能特性，故部分学者认为优质df中sdf的占比应达到10％以上。但是，在油茶粕中idf的占比远高于sdf，且纤维素作为idf的主要成分在赋予了细胞结构强度的同时极大的阻碍了作为细胞壁结构填充剂的sdf的提取。这极大的限制了油茶粕纤维资源的开发利用，因此，通过适当的改性方法，通过破坏壁结构来提高sdf的产量和功能特性，对于农产品加工副产品df在食品工业中的应用具有重要意义。
4.微生物发酵是生物改性法之一，通过菌株在发酵过程中产生的各种生物酶(如纤维素酶、半纤维素酶)和有机酸将大分子idf水解成小分子物质，以此提高sdf的产量并改善其降糖、降脂等功能特性。该改性方法具有能源消耗少、无化学污染、作用效果明显的等优势，但目前用于农产品加工副产物中df改性的菌种资源较少，筛选具有较高纤维素降解活性且对茶皂素具有耐受性的菌株用于改性油茶粕df，有利于实现油茶粕df资源的高值化应用。


技术实现要素：

5.针对油茶粕中天然sdf组分产量低活性差的问题，本发明主要解决的技术问题包括提供一株对于茶皂素具有耐受性且能高效降解油茶粕纤维素的发酵菌株，及将该菌株应用于油茶粕sdf的发酵制备，提升可溶性纤维组分的产率及降糖、降脂功能特性，增强其在功能食品中的应用潜力。
6.为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
7.本发明提供了一株筛选自霉变油茶粕的纤维素降解菌，该菌株具有茶皂素耐受性，分类学命名为青霉菌属(penicillium sp.)yc49，已于2023年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉)，保藏编号为cctcc no：m 2023497。
8.本发明还提供了上述菌株在油茶粕sdf改性中的应用，青霉菌yc49用于发酵改性油茶粕sdf，能显著提升其产率，制得具有优良降糖、降脂功能特性的油茶粕可溶性纤维组分。该菌株在油茶粕发酵培养基中能分泌产生内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶等纤维素酶系。
9.本发明同时提供了该菌株在油茶粕降糖、降脂功能纤维组分高效制备中的应用方法，具体是将该菌株作为油茶粕sdf的发酵改性菌株，在大幅提升其产率的同时改善其降糖、降脂活性，高效获取优质功能纤维组分。具体制备方法包括如下步骤：
10.1)将脱脂油茶粕粉碎并过100目筛，获得脱脂油茶粕粉。
11.2)将yc49在pda平板中培养10d，使用无菌生理盐水冲洗制备孢子悬液。将孢子悬液的浓度调节至10
7-108个孢子/ml，按5％(v：v)的接种量将孢子液接种至种子培养基，在28℃、180r/min的条件下培养，获得均一种子液；
12.其中，种子培养基为马铃薯肉汤培养基，培养时间为3
±
1d。
13.3)按10
±
2％(v：v)的接种量将种子液接种至脱脂油茶粕粉发酵培养基，发酵温度为28
±
4℃、摇床转速为180
±
20r/min，发酵时间为4
±
1d，获得油茶粕发酵物；
14.其中，每升发酵培养基包含：脱脂油茶粕粉25
±
5g/l、nacl 1.0
±
0.1g/l、k2hpo43.0
±
0.3g/l、mgso40.2
±
0.02g/l、kcl 0.2
±
0.02g/l、(nh4)no31.0
±
0.1g/l，余量补足水，调节ph＝7
±
1(优选7.2)。
15.4)将油茶粕发酵物的ph调节至6.5，加入耐高温α-淀粉酶，95
±
5℃水浴酶解30
±
5min。调节温度至60
±
5℃，将发酵物的ph调节至6.0，加入木瓜蛋白酶，水浴酶解2
±
0.2h。酶解结束后，100℃水浴加热灭酶活，离心收集上清液。在上清液中加入4倍体积乙醇，静置沉淀8h，离心后收集沉淀并冻干即制备获得具有优良降糖、降脂功能特性的油茶粕可溶性纤维组分。
16.其中，耐高温α-淀粉酶活性为100000
±
10000u/g，添加量为1
±
0.1％(w：v)；木瓜蛋白酶活性为50000
±
5000u/g，添加量为0.5
±
0.05％(w：v)，酶解时长为2
±
0.2h。
17.本发明还提供了青霉菌yc49发酵油茶粕进而制得的具有优良降糖、降脂功能特性的油茶粕可溶性纤维组分。
18.本发明所述方法制备获得的具有降糖、降脂功能特性的油茶粕可溶性纤维组分，在模拟人体消化的条件下，能有效的吸附葡萄糖、胆固醇、油脂等糖类和脂类化合物，并抑制胰脂肪酶、α-淀粉酶的活性，显著降低糖类和脂类的消化率，可用于制备降糖和/或降脂药物，还具有作为功能组分添加到食品中的潜力。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.1.提供了具有一株具有茶皂素耐受性的纤维素降解菌，并将该菌株用于油茶中sdf的改性制备，所用方法简便易行，设备要求简单，大幅提升了油茶粕中优质纤维组分的产率。
21.2.制备获得的可溶性纤维组分具有较高的降糖和降脂功能特性，能作为药物中降糖、降脂功能组分，也可作为配料制成功能性食品，有利于油茶粕中纤维资源的高值化利用。
附图说明
22.图1为实施例1中菌株yc49在cmc琼脂培养基产生的透明圈；
23.图2为实施例1中菌株yc49的系统发育树；
24.图3为实施例2中不同因素交互作用对油茶粕sdf产率影响的响应面图；(a，a)培养基初始ph与发酵时间的交互效应；(b，b)发酵时间与料液比间的交互效应；(c，c)培养基初始ph与料液比间的交互效应。
具体实施方式
25.具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由具体实施例所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
26.以下结合本发明实施例中的附图对本发明作进一步的阐述。
27.实施例1 yc49的筛选及鉴定
28.(1)菌株的初筛
29.采集自然霉变的油茶粕作为纤维素降解菌的来源，将10g自然霉变油茶粕与90ml无菌水混合，28℃、180r/min振荡混合1h。将混合液静置一段时间后，吸取10ml悬浊液加入到90ml富集培养基中，28℃、180r/min培养3d。取10ml富集培养液加入到90ml新的富集培养基中，获得第2代富集培养菌液。按照上述方法，连续培养富集3代后，吸取适量富集培养液梯度稀释后进行涂布平板，挑取单菌落。将菌株接种至cmc琼脂平板中的中央位置，在28℃、180r/min的条件下培养5d后，采用1％的刚果红染液对初筛培养基平板染色30min，菌株yc49在cmc琼脂平板上产生的透明圈如图1所示。
30.富集培养基的配制方法为：脱脂油茶粕粉20g/l、nacl 1.0g/l、k2hpo43.0g/l、mgso40.2g/l、kcl 0.2g/l、(nh4)no31.0g/l、水1l。
31.cmc琼脂培养基的配制方法为：cmc-na 20g/l、nacl 1.0g/l、k2hpo43.0g/l、mgso40.2g/l、kcl 0.2g/l、(nh4)no31.0g/l、琼脂20g/l、水1l。
32.(2)菌株的复筛
33.将菌株在pda平板中培养10d，使用无菌生理盐水冲洗菌落，将孢子悬浮液的浓度调节至10
7-108个孢子/ml，按5％的接种量将孢子液接种至pdb培养基，在28℃、180r/min的条件下培养3d，获得均一种子。将种子液按10％(v：v)的接种量接种至产酶培养基，分别取培养2-7d的发酵液，4800r/min离心10min，取上清液作为粗酶液。将0.5ml粗酶液分别加入到1.5ml 1％的cmc-na溶液和d-(-)水杨苷溶液中，50℃水浴条件下反应30min。反应结束后
迅速加入2ml dns试剂，并于100℃水浴显色5min，以100℃灭活粗酶液作为空白对照，通过葡萄糖标准曲线确定反应产物中原糖含量。将0.5ml粗酶液与1.5mlph＝4.8的磷酸盐缓冲液混合，加入裁剪为矩形(1cm
×
6cm)的whatman no.1无淀粉滤纸，50℃水浴条件下反应60min，同样采用dns法对还原糖产量进行测定。cmc-na溶液和d-(-)水杨苷溶液均以0.1mol/l的磷酸盐缓冲液作为溶剂。
34.将1ml粗酶液在1min内产生1μg葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(u)，yc49的酶活测定结果如表1所示。
35.表1 yc49的酶活测定结果
[0036][0037][0038]
(3)菌株的鉴定
[0039]
对yc49的18s rrna进行测序，将所得的基因序列利用megax进行多重序列比较并构建系统发育树(图2)，结果表明yc49的18s rrna与青霉菌属(penicillium sp.)菌株12-02(eu677999.1)的序列相似性最高，达到99.64％，确定yc49为青霉属真菌。
[0040]
实施例2yc49发酵高效制备油茶粕sdf的工艺优化
[0041]
将实施例2筛选的yc49菌株制得种子液，再接种至脱脂油茶粕粉发酵培养基进行发酵，获得油茶粕发酵物。
[0042]
在单因素试验的基础上，以发酵培养基初始ph、发酵培养基中油茶粕粉比例(w∶v)(即料液比)、发酵天数为变量，以油茶粕sdf得率为响应值，根据box-behnken试验设计原理，对发酵工艺进行了响应面设计优化。因素水平表见表2，试验设计及结果见表3，响应面模型的方差分析结果见表4，不同因素之间的交互作用对sdf产率影响的响应面如图3所示。
[0043]
表2响应面优化因素水平表
[0044][0045]
表3box-behnken试验设计及结果
[0046][0047][0048]
表4响应面模型的方差分析结果
[0049][0050]
从表4中可以看出模型的p值为0.0003，表明该拟合模型具有统计学意义。同时，模型的失拟项(p＝0.4616)并不显著，说明了该模型具有较为理想的拟合效果，能较为准确描述sdf的产率与变量之间的变化关系。此外，该模型的决定系数为0.9652，调整后的决定系数为0.9203，变异系数仅为2.52％，表明了该模型对sdf产率变化的解释度达到96.52％，可
用于预测sdf的产率。通过该响应面模型分析预测的最佳发酵工艺参数为发酵时间4.14d、培养基初始ph 7.18、料液比为1∶26.13，该条件下sdf的预测产率为19.49％。考虑到工艺可行性，在发酵时间为4d、培养基初始ph为7.2、料液比为1∶26的条件下进行发酵改性，该条件下sdf的产率为19.22％，基本与预测值相一致。在未发酵改性时，油茶粕sdf的产率仅为10.67％。最佳发酵改性工艺条件确定为：发酵培养基初始ph＝7.2、发酵时间为4d、料液比为1∶26。
[0051]
以未发酵的油茶粕sdf作为对比例，其提取方法为：灭菌后的发酵培养基不接种菌株，直接用于油茶粕sdf的提取，将灭菌后培养基的ph值调节至6.5，加入1％(w：v)的耐高温α-淀粉酶(100000u/g)，在95℃水浴条件下搅拌30分钟。随后，将混合物的ph值调整至6.0，加入0.5％(w：v)木瓜蛋白酶(50000u/g)，在60℃水浴条件下搅拌2h。酶处理结束后，将混合物在沸水浴中加热10分钟以消除酶活。最后，将混合物4800r/min离心10min后收集上清液，在上清液中加入4倍体积的乙醇(95％)，搅拌混合后静置12h，以4800r/min离心10min收集沉淀，将沉淀冻干即制备获得未改性的sdf。
[0052]
未发酵改性油茶粕的产率仅为10.67％，显著低于yc49发酵后的产率。
[0053]
实施例3发酵改性前后油茶粕sdf的降糖和降脂功能特性对比
[0054]
根据实施例2中的工艺方法制备获得发酵改性的油茶粕sdf(f-sdf)及未改性的油茶粕sdf(ck-sdf)，分别考察两种sdf的葡萄糖吸收能力(gac)、α-淀粉酶抑制能力(α-aair)、持油力(orc)、胰脂肪酶抑制能力(plai)、胆酸钠吸附能力(sbc)及胆固醇吸收能力(cac)，具体结果见表5。
[0055]
表5 yc49发酵改性前后油茶粕sdf的降血脂功能特性对比
[0056][0057]
在发酵改性之后，模拟胃肠道消化条件下油茶粕sdf的降糖和降脂能力均得到了大幅度的提升，这些性质的改善使油茶粕sdf能更加高效的吸附油脂、胆固醇、胆汁酸等参与脂质代谢和葡萄糖、α淀粉酶等参与糖类代谢的关键物质，减少人体对脂类和糖物质的消化吸收，预防高血脂症、肥胖症等疾病的发生。因此，本发明所涉及的应用提升了油茶粕sdf作为药物/食品功能组分的潜力。

技术特征：
1.一株纤维素降解菌，其特征在于，所述菌株的分类学命名为青霉菌(penicillium sp.)yc49，于2023年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2023497，保藏地址为中国武汉武汉大学。2.根据权利要求1所述的一株纤维素降解菌，其特征在于：所述青霉菌yc49菌株筛选自自然霉变的油茶粕，所述纤维素降解菌对于茶皂素具有耐受性。3.权利要求1或2所述的一株纤维素降解菌的应用，其特征在于：所述青霉菌yc49用于发酵改性油茶粕可溶性膳食纤维，能显著提高可溶性膳食纤维产率，制得具有优良降糖、降脂功能特性的油茶粕可溶性纤维组分。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述青霉菌yc49发酵改性油茶粕可溶性膳食纤维的方法包括如下步骤：s1、扩培制得种子液：先将所述青霉菌yc49培养至产生孢子，并制备孢子悬浮液，再加入至种子培养基进行培养，制得种子液；s2、接种发酵：将所述种子液接种至包含脱脂油茶粕粉的发酵培养基中，发酵培养一段时间获得油茶粕发酵物；s3、降糖、降脂功能纤维组分的提取：由耐高温α-淀粉酶、木瓜蛋白酶对所述油茶粕发酵物进行二次水浴酶解，再依次经过灭酶活、离心取上清液、醇沉、离心收集沉淀、冻干，最后获得具有优良降糖、降脂功能特性的油茶粕可溶性纤维组分。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤s1中种子培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基，培养时间为3
±
1d。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤s2中种子液的接种量为10
±
2％，发酵时间为4
±
1d，发酵温度为28
±
4℃，摇床转速为180
±
20r/min；每升发酵培养基包含：脱脂油茶粕粉25
±
5g/l、nacl 1.0
±
0.1g/l、k2hpo
4 3.0
±
0.3g/l、mgso
4 0.2
±
0.02g/l、kcl 0.2
±
0.02g/l、(nh4)no
3 1.0
±
0.1g/l，余量补足水，调节ph＝7
±
1。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤s3中，所述的耐高温α-淀粉酶活性为100000
±
10000u/g，水浴温度为95
±
5℃，添加量为1
±
0.1％w：v，酶解时长为30
±
5min，酶解时调节ph＝6.5；木瓜蛋白酶活性为50000
±
5000u/g，水浴温度为60
±
5℃，添加量为0.5
±
0.05％(w：v)，酶解时长为2
±
0.2h，酶解时调节ph＝6。8.权利要求3至7任一项所述应用中制得的具有优良降糖、降脂功能特性的油茶粕可溶性纤维组分。9.权利要求8所述的油茶粕可溶性纤维组分的应用，其特征在于：所述油茶粕可溶性纤维组分用于制备降糖和/或降脂药物。10.根据权利要求9所述的油茶粕可溶性纤维组分的应用，其特征在于：所述油茶粕可溶性纤维组分在模拟人体消化时能吸附糖类和脂类，并能抑制α-淀粉酶和胰脂肪酶的活性，显著降低糖和脂的消化率。

技术总结
本发明公开了一株纤维素降解菌及其在油茶粕可溶性膳食纤维改性中的应用。该菌株的分类学命名为青霉菌属Penicillium sp.YC49，已于2023年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2023497。将该菌株作为油茶粕可溶性膳食纤维的发酵改性菌株，用于油茶粕可溶性膳食纤维的发酵制备，在优化工艺条件下可溶性膳食纤维的产率大幅提升，且所得纤维组分具有优良的降糖和降脂的功能特性。具有降糖、降脂功能特性的可溶性纤维组分能在模拟人体消化过程的过程中，有效的吸附部分糖和脂并抑制相关消化酶的活性，减少糖和脂的消化吸收程度。该发明为降糖降脂功能药物、健康食品的开发提供了理想原料，并为植物性农业副产物中纤维资源的开发利用提供了理想方法。产物中纤维资源的开发利用提供了理想方法。产物中纤维资源的开发利用提供了理想方法。


技术研发人员：余强 杨超然 郑冰 陈奕 谢建华 司靖宇
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/23