小细胞外囊泡中miR-15a-5p的应用

小细胞外囊泡中mir-15a-5p的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及小细胞外囊泡中mir-15a-5p在诊断或预后评估糖尿病视网膜病变中的应用。


背景技术：

2.细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)是一种由活细胞释放的纳米级囊泡，含有丰富的蛋白质，mirna和脂质等生物大分子物质，是生物标志物的理想来源。根据evs的生物产生过程、大小以及生理特性等进行进一步分类，如微囊泡(microvesicles，mvs)和外泌体。mvs来自于质膜的“出芽”，直接从细胞脱落，直径在100-1000nm不等。外泌体是由细胞膜两次内陷形成，并且在细胞内经过复杂的物质交换，由细胞分拣后释放到细胞外，直径位于30-150nm之间，具有较高的生物研究价值。差速超速离心法是收集外泌体的金标准，通过差速超速离心法可以分离到直径位于30-150nm的小粒径evs(small evs，sevs)，其主要成分为外泌体，根据2018年发布的专家共识，由于难以直接证明传统差速离心方法分离的小粒径evs为完全纯化的外泌体，建议使用sevs的命名，因此本发明使用sevs命名差速超速离心所得产物。另外sevs的内容物因其母细胞的功能和细胞状态(如转化、分化、刺激和应激)不同而具有很大的差异。因此，sevs及其内容物可以反应母细胞的状态，并进一步提供疾病的信息。
3.专利文献：cn111394447b公开了血浆小细胞外囊泡mir-431-5p在作为糖尿病视网膜病变诊断的标志物方面的应用，通过检测糖尿病患者血浆sevs中的mir-431-5p表达，可以更加准确快速地判断受试者是否具有糖尿病视网膜病变的风险，从而给临床医师提供预防或治疗方案。
4.专利文献：cn111398595a公开了血浆小细胞外囊泡中的蛋白质tnfaip8在作为增殖性糖尿病视网膜病变诊断的标志物方面中的应用。
5.专利文献：cn112575088b公开了血浆外泌体mirna生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用，所述生物标记物为mir-15a-5p，mir-106b-5p和mir-107的组合。
6.非专利文献：micro-rnas in the aqueous humour of patients with diabetic macular oedema(heeyoon cho md phd et al，clin experiment ophthalmol.2020；48:624
–
635.)公开了房水中包括hsa-mir-185-5p、hsa-mir-17-5p、hsa-mir-20a-5p、hsamir-15b-5p和hsa-mir-15a-5p的mirna与糖尿病黄斑水肿的关系。
7.但是，眼内取样检测对医生的经验手法要求高，且对患者或多或少有一定的损害，故本技术发明人力求以血浆作为检测的样本，实现无需眼内取样，也能实现利用生物大分子进行诊断的目的。


技术实现要素：

8.为了以血浆为检测样本，本技术检测了血浆中的mir-15a-5p，发现其表达与疾病
的进展并无相关性，但是却意外的发现，血浆小细胞外囊泡中mir-15a-5p与疾病的进展密切相关，通过检测糖尿病患者血浆sevs中的mir-15a-5p表达，可以更加准确快速地判断受试者是否具有糖尿病视网膜病变的风险，从而给临床医师提供预防或治疗方案。与传统的检测手段相比，分子生物标志物能够更灵敏地预测糖尿病患者的视网膜病变进程，以便临床患者进行早期干预及治疗，其应用前景广阔。
9.本发明的第一方面，提供了一种小细胞外囊泡(smallextracellular vesicles，sevs)中的mir-15a-5p作为标志物在制备诊断或预后评估糖尿病视网膜病变或患病风险评估的产品中的应用。
10.所述的小细胞外囊泡为血浆中的小细胞外囊泡。
11.所述的小细胞外囊泡的直径为30-150nm，优选80-120nm或90-110nm，例如30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150nm等。
12.所述的小细胞外囊泡具有立体的双层脂质膜结构。
13.所述的小细胞外囊泡在透射电镜照片呈现茶杯状或凹盘状。
14.所述的mir-15a-5p包含uagcagcacauaaugguuugug(seq id no：1)。
15.所述的小细胞外囊泡的提取方法包括差速超速离心。
16.具体包括：
17.将血浆经1500-2500g离心10-30分钟后，取上清转至70000-90000g离心20-40分钟后，取上清转至100000-120000g离心100-150min后，取沉淀重悬后再次100000-120000g离心100-150min后获得的沉淀即为血浆小细胞外囊泡。
18.小细胞外囊泡中的mir-15a-5p的提取方法包括：提取mirna，逆转录为cdna，然后采用pcr扩增和鉴定。
19.所述的产品包括检测mir-15a-5p的试剂。优选还包括从血浆中提取小细胞外囊泡的试剂和/或从小细胞外囊泡中提取mir-15a-5p的试剂。
20.所述的检测mir-15a-5p的试剂检测mir-15a-5p的表达量。
21.所述的产品可以为蛋白芯片、基因芯片、引物、探针、试剂盒、仪器设备等。
22.所述的诊断或预后评估糖尿病视网膜病变包括检测mir-15a-5p的表达量。还包括将其与阈值比较，若表达量显著高于阈值，则为糖尿病视网膜病变或具有更高的糖尿病视网膜病变患病风险。
23.所述的阈值可以通过实验确定，例如测定若干健康人的mir-15a-5p的表达量，然后统计获得表达量的平均值或中位数作为阈值。
24.所述的糖尿病性视网膜病变包括非增殖性糖尿病性视网膜病变或增殖性糖尿病性视网膜病变。
25.本发明的第二方面，提供了一种诊断或预后评估糖尿病视网膜病变或糖尿病性视网膜病变患病风险的试剂，所述的试剂包括检测mir-15a-5p的试剂。优选为检测mir-15a-5p表达量的试剂。
26.本发明的第三方面，提供了一种诊断或预后评估糖尿病视网膜病变或糖尿病性视网膜病变患病风险评估的试剂盒，所述的试剂盒包含上述所述的试剂，或者，包括提取血浆中小细胞外囊泡的试剂，以及检测mir-15a-5p的试剂。
27.本发明的第四方面，提供了一种小细胞外囊泡中的mir-15a-5p作为标志物在制备
区分非增殖性糖尿病性视网膜病变和增殖性糖尿病性视网膜病变的产品中的应用。
28.所述的小细胞外囊泡为血浆中的小细胞外囊泡。
29.本发明的第五方面，提供了一种诊断或预后评估糖尿病视网膜病变或糖尿病性视网膜病变患病风险评估的方法，所述的方法包括检测受试者小细胞外囊泡中的mir-15a-5p。优选为检测受试者小细胞外囊泡中的mir-15a-5p的表达量。
30.所述的小细胞外囊泡为血浆中的小细胞外囊泡。
31.本发明的第六方面，提供了一种区分非增殖性糖尿病性视网膜病变和增殖性糖尿病性视网膜病变的方法，所述的方法包括检测受试者小细胞外囊泡中的mir-15a-5p。优选为检测受试者小细胞外囊泡中的mir-15a-5p的表达量。
32.所述的小细胞外囊泡为血浆中的小细胞外囊泡。
33.本发明的第七方面，提供了一种糖尿病性视网膜病变的分型方法，所述的分型方法包括检测受试者小细胞外囊泡中的mir-15a-5p。优选为检测受试者小细胞外囊泡中的mir-15a-5p的表达量。
34.所述的小细胞外囊泡为血浆中的小细胞外囊泡。
35.所述的分型方法将糖尿病性视网膜病变分为非增殖性糖尿病性视网膜病变和增殖性糖尿病性视网膜病变。
36.采用本技术血浆小细胞外囊泡中mir-15a-5p作为标志物，具有很高的特异性和敏感性，而且相对于眼内液(例如玻璃体或房水)，血浆更易取得，并相对无创，更适合做诊断dr的生物标志物。
37.本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。
38.本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应，及将来患病的风险度。
39.本发明所述的“患病风险评估”指评估受试者将来患病的风险度。
40.本发明所述的“受试者”可以为人或非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等。
附图说明
41.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
42.图1a：提取出的sevs的透射电镜照片。
43.图1b：纳米粒度分析提取的sevs尺寸分布。
44.图1c：考马斯亮蓝染色测试血浆和sevs中的蛋白质分布情况。
45.图1d：western blot检测血浆和sevs中的标志物表达情况。
46.图2a：血浆sevs中mir-15a-5p表达随疾病进展的变化。
47.图2b：血浆sevs中不同mirna随疾病进展的变化。
48.图3：不同疾病中，血浆中mir-15a-5p(图a)与sevs中mir-15a-5p(图b)的相对表达对比。
49.图4：不同疾病中，玻璃体中mir-15a-5p的相对表达情况。
50.图5a：血浆sevs中mir-15a-5p及玻璃体中mir-15a-5p在区分npdr与pdr的效力结果。
51.图5b：血浆sevs中mir-15a-5p及玻璃体中mir-15a-5p在区分ndr与dr的效力结果。
具体实施方式
52.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
53.实施例中涉及的实验方法如下：
54.1.1实验对象
55.本研究得到天津医科大学附属眼科医院伦理委员会的批准。天津医科大学附属眼科医院的所有患者均签署了知情同意书。对于血浆及血浆sevs的验证，以健康受试者(ndm)的血浆为对照组，糖尿病无视网膜并发症(无临床dr的糖尿病)，非增殖性糖尿病视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变作为实验组。招募了另一组个体，分组同上，用于收集玻璃体进行qrt-pcr验证。糖尿病患者的纳入标准为：(1)40-80岁，(2)2型糖尿病。排除标准为：(1)免疫系统疾病(2)视网膜血管阻塞(3)其他有眼部并发症的代谢综合征。
56.1.2糖尿病视网膜病变分级
57.根据受试者眼底超广角照相结果或由眼底医生对散瞳后受试者眼底进行判断：
58.a.无明显视网膜病变(ndr)：仅有糖尿病，眼底无异常改变；
59.b.非增殖性糖尿病视网膜病变(npdr)：微动脉瘤，视网膜内出血；静脉串珠样，微血管异常；
60.c.增殖性糖尿病视网膜病变(pdr)：出现1种或多种改变，包括新生血管形成、玻璃体积血或视网膜前出血。
61.1.3血浆及其细胞外囊泡的提取与保存
62.1.3.1血浆：自静脉取血10ml，使用edta抗凝管保存，1800g离心15分钟后取上清血浆，置于-80℃保存。
63.1.3.2sevs：取2ml血浆经2000g
×
15min离心后抽取上清转移入超速离心管，80000g
×
30min离心后得到上清：将上清转移入新的超速离心管进行110,000g
×
120min，得到沉淀，使用1mlpbs重悬后，将体积补充至11.5ml，110,000g
×
120min离心，得到沉淀为sevs。
64.1.4细胞外囊泡的鉴定
65.1.4.1透射电镜观察细胞外囊泡
66.取分装后的sevs，解冻后重悬于200μl pbs液中混匀，取10μl外泌体溶液和4％pfa按体积比1：1混合，滴在干净的塑料薄膜上形成液滴，然后将电镜碳网的正面扣在液滴上，放置20min，10μl磷钨酸负染90s，烤干碳网，使用hitacw-7500透射电子显微镜进行观察并拍照。
67.1.4.2western blot结果显示特征蛋白
68.使用ripa缓冲液从细胞外囊泡和细胞中提取蛋白质，将匀浆液于4℃以12000
×g离心15分钟。上清液转移到另一个透明试管中，然后将来自样品的10μg蛋白质和加入5倍体积蛋白质上样缓冲液的细胞裂解液在95℃加热5分钟。将所有样品上样到sds-page凝胶中电泳，然后将进入凝胶的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。在室温下与质量分数5％牛奶一起孵育1小时后，将膜与一抗包括tsg101，cd63，apoa1在4℃孵育过夜，并用tbst冲洗3次(每次10分钟)。膜置于hrp偶联的二抗(cst)中室温孵育2小时，随后用tbst冲洗3次(每次10分钟)最后，使用增强的化学发光(ecl)拍摄图像。
69.1.4.3考马斯亮蓝(cbb)染色。
70.收集血浆并使用bca分析(solarbio)调整蛋白质浓度。在10％ sds-page的每条泳道中加入12μg变性蛋白质，然后在100v电压下电泳分离蛋白质，并将其置于考马斯亮蓝染色溶液中。在室温下缓慢摇晃2h。然后清洗凝胶，直到它变透明，然后拍照。
71.1.4.4纳米颗粒跟踪分析(nta)
72.用pbs稀释样品至1ml体积，并使用纳米颗粒跟踪分析(nta)3.3dev build 3.3.104进行检测。将温度设置为25℃，激光器设置为蓝色488nm，流速设置为50，模式设置为自动检测，注入样品三次，并将峰值平均值作为模式结果，使用nta软件(nta 3.3dev build 3.3 104)自动分析结果。
73.2.mir-15a-5p表达水平的检测
74.2.1mirna的提取
75.在sevs(或血浆/玻璃体液)中加入500μl的trizol，吹打后室温静置5min，加入110μl buffer a，13000g离心4min，吸取上层水相加至rna吸附柱中，4,000g离心1min，将500μl的wash buffer 1加至离心柱，12,000g离心1min，再加入500μl的wash buffer 2，13000g离心1min，将吸附柱换到新的1.5ml ep管中，开盖晾2min，加入20μl depc水，12,000g离心1min，将离心液再加入吸附柱中，室温5min，12,000g离心1min，收集管中液体即总rna，用nanodrop测浓度。
76.2.2rna逆转录
77.按照下述的比例在ep管中加入试剂，rna总量500ng，之后加gdna remover 1μl混匀室温存放5分钟。按表1加入试剂。放入pcr仪中按照说明书设置程序，结束后将所得cdna置于-20℃保存。
78.表1
[0079]4×
mirna rt buffer5μlmirna rt enzyme mix2μlrna适量总体积20μl
[0080]
2.3qrt-pcr
[0081]
按照表2的比例配制反应液体，上下游引物(见表3)和水混合，混匀后加入384孔板。按照说明书设置程序。
[0082]
表2
[0083]
上游引物1μl下游引物1μlsybr green master4μl
[0084]
表3
[0085][0086]
2.4统计学分析
[0087]
数据以平均数
±
标准差表述。每组数据均进行了正态检验。四组之间数据差异采用spss软件进行one-wayanova方差分析，事后检验选用最小显著性差异(lsd)法。对于非正态分布的数据和方差不均的数据使用秩和检验。对于构成比或率使用卡方检验。p《0.05视为差异有统计学意义。*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001，****代表p《0.0001。
[0088]
实施例1：细胞外囊泡鉴定结果
[0089]
透射电镜照片示sevs呈现典型的茶杯状或凹盘状，具有立体的双层脂质膜结构，直径在30nm-150nm之间。(图1a，标尺＝200nm)。纳米粒度分析显示本实施例提取的样本中囊泡尺寸为97.5
±
10.2nm。(图1b)。考马斯亮蓝染色测试表明sevs的蛋白质分布与血浆不同(图1c)。血浆具有高丰度蛋白聚集，位于72kd。sevs蛋白质分布明显有两个高峰度条带，位于130-250kd之间，72kd-95kd之间，并且无血浆中高丰度蛋白聚集。sevs表达外泌体的重要表面标记蛋白tsg101和cd63，说明sevs是以外泌体为主要成分的小囊泡。而血浆标志物apoa1则在sevs中表达较少(图1d)。证明sevs提取成功。
[0090]
实施例2：mir-15a-5p在dr患者血浆、sevs及玻璃体液中的表达差异
[0091]
血浆sevs芯片结果表明，随着dr的进展，血浆sevs中mir-15a-5p表达增加(图2a、b)。用qrt-pcr检测芯片结果筛选出的mir-15a-5p在sevs及全血浆中的表达水平。结果显示在sevs中(图3b)，pdr组的mir-15a-5p相较于ndm组、ndr组和npdr组明显升高且具有统计学差异(p《0.05)，与芯片结果一致。但是在血浆中，四组之间没有明显差异(图3a)，这也说明了sevs与血浆中的mirna组成有所不同，二者不可互相替代，而sevs由于其生物学特性更加能代表机体的疾病状态。通过qrt-pcr检测玻璃体液中的mir-15a-5p表达水平，发现在pdr患者的玻璃体液中mir-15a-5p的表达水平明显上调，差异有统计学意义(p《0.05)(图4)。
[0092]
实施例3：mir-15a-5p作为生物标志物的特异性和敏感性
[0093]
受试者工作特征(receiver operation characteristic,roc)曲线是将敏感度与特异度相结合综合评估诊断准确度或判别效果的方法。采取roc曲线以评估血浆sevs及玻璃体液中的mir-15a-5p作为诊断dr生物标志物的特异性和敏感性。经分析对比发现，与玻璃体液中mir-15a-5p相比，血浆sevs中mir-15a-5p在区分npdr与pdr上具有更加明显的优
势血浆sevs中mir-15a-5p在区分npdr与pdr的效力为76.2904％，玻璃体液中mir-15a-5p在区分npdr与pdr的效力为60.8333％(图5a)；sevs中mir-15a-5p在区分ndr与dr的效力为77.6078％，玻璃体液中mir-15a-5p在区分ndr与dr的效力为74.5455％(图5b)。这说明sevs中的mir-15a-5p表达水平对是否dr以及dr的病变严重程度具有较高的诊断效力。
[0094]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0095]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

技术特征：
1.小细胞外囊泡中的mir-15a-5p作为标志物在制备诊断或预后评估糖尿病视网膜病变的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的小细胞外囊泡为血浆中的小细胞外囊泡。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的小细胞外囊泡的直径为30-150nm。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的mir-15a-5p包含seq id no：1。5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述的小细胞外囊泡的提取方法包括：将血浆经1500-2500g离心10-30分钟后，取上清转至70000-90000g离心20-40分钟后，取上清转至100000-120000g离心100-150min后，取沉淀重悬后再次100000-120000g离心100-150min后获得的沉淀即为血浆小细胞外囊泡。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括检测mir-15a-5p的试剂。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的检测mir-15a-5p的试剂检测mir-15a-5p的表达量。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断或预后评估糖尿病视网膜病变包括检测mir-15a-5p的表达量。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病性视网膜病变包括非增殖性糖尿病性视网膜病变或增殖性糖尿病性视网膜病变。10.一种诊断或预后评估糖尿病视网膜病变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括提取血浆中小细胞外囊泡的试剂，以及检测mir-15a-5p的试剂。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，提供了一种血浆小细胞外囊泡中miR-15a-5p的应用，尤其在诊断或预后评估糖尿病视网膜病变中的应用。经实验证实，本申请的血浆小细胞外囊泡中miR-15a-5p作为标志物进行糖尿病视网膜病变的诊断，可以获得较高的特异性和敏感性。可以获得较高的特异性和敏感性。可以获得较高的特异性和敏感性。


技术研发人员：李筱荣 张晓敏 张慧 于欣悦
受保护的技术使用者：天津医科大学眼科医院
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/9/23