一种携带EGFR三突变靶点基因的耐药细胞模型、构建方法及其应用

一种携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型、构建方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型、构建方法及其应用。


背景技术：

2.肺癌是最常见的呼吸系统恶性肿瘤，也是世界上死亡率最高的癌症，其中，大约80％的肺癌患者属于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)类型1。
3.表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，egfr)是一种广泛分布于人体各种组织细胞膜上的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。egfr的突变和异常激活与多种肿瘤如非小细胞肺癌、食管癌、乳腺癌等肿瘤的发生发展、恶性程度、转移等密切相关。egfr的常见突变可以分为两大类，一类是药物敏感突变，即突变后可以使用抗肿瘤靶向药物，例如19外显子缺失、21外显子l858r突变；另一类是耐药突变，即突变后对某种抗肿瘤靶向药物耐药，例如t790m突变、c797s突变。
4.小分子egfr抑制剂目前已发展了三代，但是耐药一直是这类药物面临的主要问题。第一代是以gefitinib(商品名iressa)为代表，包括erlotinib(商品名tarceva)和icotinib(商品名conmana)等在内的喹唑啉类药物，他们均为可逆的egfr抑制剂，主要对具有egfr 19位外显子e746-a750缺失突变和21位外显子l858r点突变的nsclc患者具有很好的疗效。egfr(l858r/t790m)双突变是患者服用第一代egfr抑制剂后出现的耐药突变，是导致第一代egfr抑制剂失效的主要原因。第二代是基于喹唑啉结构研发的可共价结合atp口袋的不可逆抑制剂，这类药物以afatinib(商品名gilotrif)和dacomitinib(商品名vizimpro)为代表，对egfr敏感突变和egfr(l858r/t790m)耐药双突变均有较强的抑制活性。然而，第二代egfr抑制剂虽然可有效抑制耐药突变，但选择性较差，对野生型egfr也有较高抑制活性，加之其不可逆抑制特性，导致这类药物毒副作用较大，治疗窗较窄，目前在临床上仍用于携带egfr敏感突变的患者，在克服egfr(l858r/t790m)耐药突变的临床治疗中由于剂量受限，疗效并不显著。第三代egfr抑制剂是嘧啶类结构的不可逆抑制剂，以osimertinib(奥希替尼，商品名tagrisso，临床前研究名为azd9291)，rociletinib，avitinib，olmutinib和wz4002为代表，前者已于2015年11月在美国上市。该药物对egfr(l858r/t790m)耐药突变具有高度选择性(对野生型egfr抑制作用较弱)，毒副作用较小且疗效显著，可使病人的无进展生存期达到10个月以上，为广大nsclc患者，尤其是服用第一代egfr抑制剂后出现egfr(l858r/t790m)耐药突变的患者带来了福音。
5.然而，在服用osimertinib(tagrisso)的患者中发现了egfr(c797s)等新的耐药突变，并且进一步的研究显示，egfr(del/t790m/c797s)和egfr(l858r/t790m/c797s)三突变是导致患者对osimertinib(tagrisso)耐药的主要原因，甚至会导致nsclc细胞对目前上市的所有egfr抑制剂耐受。然而，目前临床上针对该类耐药突变的小分子抑制剂研究较少，耐药患者后续无药可用。因此，构建egfr(del/t790m/c797s)和egfr(l858r/t790m/c797s)三
突变抑制剂筛选模型，寻找有效的小分子抑制剂，对抗肿瘤药物的研发具有重要意义。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型、构建方法及其应用以解决上述技术问题。
8.本发明是这样实现的：
9.第一方面，本发明提供了一种携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型，细胞内包括带有egfr(del/t790m/c797s)三突变的质粒或带有egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的质粒；
10.带有egfr(del/t790m/c797s)三突变的质粒表达突变型egfr，突变型egfr蛋白e746-a750缺失突变、第790位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸且第797位半胱氨酸突变为丝氨酸，其cds序列具有如seq id no.1所示；
11.带有egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的质粒表达突变型egfr，突变型egfr蛋白第858位氨基酸由亮氨酸突变为精氨酸、第790位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸且第797位半胱氨酸突变为丝氨酸，其cds序列具有如seq id no.2所示；
12.细胞为对egfr抑制剂成瘾的非小细胞肺癌细胞。
13.基于靶点和基于表型的筛选是抗肿瘤药物研发常用的两类方法，前者通过靶点鉴定和针对该靶点的酶水平测试筛选药物，筛选体系简单，但得到的药物往往达不到预期疗效；基于表型的筛选利用肿瘤细胞增殖等表型评价药物疗效，得到的化合物有效率高，但在靶点鉴定和机制研究中难度较大。发明人采用基因工程技术(慢病毒质粒)构建了生长高度依赖于egfr(del/t790m/c797s)或egfr(l858r/t790m/c797s)这两种耐药突变的靶点基因的耐药细胞模型。此类细胞兼具基于靶点和表型筛选的优势，通过寻找抑制细胞增殖的化合物即为该耐药突变靶点的潜在抑制剂，显著提高了药物发现的效率。
14.在本发明应用较佳的实施方式中，对egfr抑制剂成瘾的非小细胞肺癌细胞选自pc9或hcc827细胞。
15.第二方面，本发明还提供了一种携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型的构建方法，其包括如下步骤：将带有egfr(del/t790m/c797s)或egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的质粒、慢病毒包装辅助质粒、表达水泡性口炎病毒的融合性外壳g糖蛋白的质粒共同转染宿主细胞以包装重组慢病毒，然后将重组慢病毒感染对egfr抑制剂成瘾的非小细胞肺癌细胞，筛选获得携带egfr(del/t790m/c797s)或egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的非小细胞肺癌细胞株；
16.带有egfr(del/t790m/c797s)三突变的质粒表达突变型egfr，突变型egfr蛋白e746-a750缺失突变、第790位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸且第797位半胱氨酸突变为丝氨酸，其cds序列具有如seq id no.1所示；
17.带有egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的质粒表达突变型egfr，突变型egfr蛋白第858位氨基酸由亮氨酸突变为精氨酸、第790位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸且第797位半胱氨酸突变为丝氨酸，其cds序列具有如seq id no.2所示。
18.在本发明应用较佳的实施方式中，对egfr抑制剂成瘾的非小细胞肺癌细胞选自
pc9或hcc827细胞。
19.宿主细胞例如选自293细胞、293t细胞、293ft细胞、cho细胞、cos细胞、小鼠l细胞、lncap细胞、633细胞、vero、bhk细胞、cv1细胞、hela细胞、mdck细胞、hep-2细胞和per6细胞中的任一种。
20.第三方面，本发明还提供了携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型在筛选egfr耐药突变的小分子抑制剂中的应用。
21.本发明的筛选对象为chemdiv阳性化合物库，该化合物库中的小分子多为上市药物或临床试验药物，便于开展老药新用和临床的转化、实践。通过前期的表型筛选发明人发现了一个对egfr(del/t790m/c797s)和egfr(l858r/t790m/c797s)耐药三突变细胞均有较高抑制活性的化合物czc-54252，有关该化合物可靶向上述egfr耐药三突变的研究未见报道。因此，本发明提供的携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型在筛选egfr耐药突变的小分子抑制剂中具有良好的应用前景。
22.在本发明应用较佳的实施方式中，egfr耐药突变选自egfr(c797s)耐药突变、egfr(t790m)耐药突变、egfr(l858r)耐药突变、egfr(l798i)耐药突变、egfr(t790m/del19)耐药突变、egfr(t790m/l858r)耐药突变、egfr(del/t790m/c797s)耐药突变、egfr(l858r/t790m/c797s)耐药突变、egfr(del/t790m/l798i)耐药突变和egfr(l858r/t790m/l798i)耐药突变中的任意一种。
23.第四方面，本发明还提供了一种筛选egfr耐药突变的小分子抑制剂的方法，其包括：以egfr(l858r/t790m/c797s)或egfr(del/t790m/c797s)蛋白晶体结构为基础，采用分子对接gold软件对specs、enamine化合物库中的化合物进行虚拟筛选，根据打分函数和成药性预测挑选化合物，再采用上述携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型或上述的构建方法获得的耐药细胞模型筛选egfr耐药突变的小分子抑制剂。在一种可选的实施方式中，采用分子对接gold软件对specs、enamine化合物库以及自建库中的化合物进行虚拟筛选。
24.第五方面，本发明还提供了携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型在制备抗肿瘤药物中的应用；
25.在一种可选的实施方式中，肿瘤为非小细胞肺癌。
26.第六方面，本发明还提供了czc-54252在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用。
27.czc-54252除了表现出对egfr(del/t790m/c797s)和egfr(l858r/t790m/c797s)耐药三突变细胞有较高抑制活性，本研究还发现其czc-54252对a549、nci-h23和nci-h358等egfr野生型nsclc细胞的ic50分别为1.801μm、3.736μm和5.396μm，对其它类型肿瘤细胞的ic50大都》3μm，显示了一定的选择性，避免了第二代egfr抑制剂的选择性差的缺点。并且czc-54252通过直接靶向egfr(c797s)发挥抗肿瘤作用，与其原作用靶点lrrk2无相关性。
28.czc-54252，cas no.:1191911-27-9，分子式:c22h25cln6o4s分子量:504.99。
29.在一种可选的实施方式中，上述药物还包括药学上可接受的载体。载体例如包括药学上可接受的添加剂或辅料，药学上可接受的添加剂或辅料选自如下一种或多种：溶剂、缓冲液、乳化剂、悬浮剂、分解剂、崩解剂、分散剂、黏结剂、赋形剂、安定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润湿剂、润滑剂、吸收延迟剂、香味剂、甜味剂、色素以及脂质体。
30.赋形剂可以是例如：水、乙醇、2-丙醇、甘油、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、右旋糖、糖蜜、淀粉、改性淀粉、明胶、山梨醇、肌醇、甘露醇、微晶
纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙酸纤维素、虫胶、鲸蜡醇、聚乙烯基吡咯烷酮、石蜡、蜡、天然和合成橡胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、右旋糖酐、饱和和不饱和脂肪酸、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸甘油酯、月桂基硫酸钠、食用油、芝麻油、椰子油、花生油、大豆油、卵磷脂、乳酸钠、聚氧乙烯脂肪酸酯和聚氧丙烯脂肪酸酯、山梨聚糖脂肪酸酯、山梨酸、苯甲酸、柠檬酸、抗坏血酸、鞣酸、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氧化镁、氧化锌、二氧化硅、氧化钛、二氧化钛、硫酸镁、硫酸锌、硫酸钙、碳酸钾、磷酸钙、磷酸二钙、溴化钾、碘化钾、滑石、高岭土、果胶、交聚维酮、琼脂和膨润土。
31.在本发明应用较佳的实施方式中，上述药物的剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、粉剂或注射剂。片剂例如选自糖衣片剂、薄膜衣片剂或肠溶衣片剂。胶囊剂例如选自硬胶囊剂或软胶囊剂。
32.在本发明应用较佳的实施方式中，上述药物的剂型选自注射剂。
33.在本发明应用较佳的实施方式中，上述药物用于：靶向egfr(c797s)耐药突变。
34.本发明具有以下有益效果：
35.(1)本发明采用基因工程技术(慢病毒质粒)构建了生长高度依赖于egfr(del/t790m/c797s)或egfr(l858r/t790m/c797s)这两种耐药突变的靶点基因的耐药细胞模型。此类细胞兼具基于靶点和表型筛选的优势，通过寻找抑制细胞增殖的化合物即为该耐药突变靶点的潜在抑制剂，显著提高了药物发现的效率。因此，耐药细胞模型的提出大幅提升了egfr耐药突变的小分子抑制剂的研发速率。
36.(2)本发明提供的耐药细胞模型的建立可以为以非小细胞肺癌的egfr通路相关药物筛选及耐药研究提供细胞模型，提高筛选的特异性及灵敏性；也可应用于egfr影响的相关通路蛋白的差异性比较研究。
37.(3)czc-54252除了表现出对egfr(del/t790m/c797s)和egfr(l858r/t790m/c797s)耐药三突变细胞有较高抑制活性，本发明还发现其czc-54252对a549、nci-h23和nci-h358等egfr野生型nsclc细胞的ic50分别为1.801μm、3.736μm和5.396μm，对其它类型肿瘤细胞的ic50大都》3μm，显示了一定的选择性，避免了第二代egfr抑制剂选择性差多的缺点。并且czc-54252通过直接靶向egfr(c797s)发挥抗肿瘤作用，与其原作用靶点lrrk2无相关性。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
39.图1为慢病毒载体和包装载体图谱；
40.图2为第三代egfr抑制剂azd9291对敏感细胞和构建的耐药细胞的抑制活性；(a)azd9291对hcc827和hcc827-del、hcc827-lrtm耐药细胞抑制活性对比图(纵坐标为具有细胞活性的细胞百分比)；(b)azd9291对pc-9和pc-9-del、pc-9-lrtm耐药细胞抑制活性的对比图；
41.图3为azd9291，egfr-2c以及gefitinib对构建的多种耐药突变nsclc细胞的生长
抑制曲线以及ic50值；#1代表pc-9-del(del/t790m/c797s)三突变细胞，#2代表pc-9-lrtm(l858r/t790m/c797s)三突变细胞，#3代表pc-9(del/t790m)双突变细胞，#4代表pc-9(l858r/t790m)双突变细胞，#5代表pc-9(del/t790m/l798i)三突变细胞，#6代表pc-9(l858r/t790m/l798i)三突变细胞，#7代表pc-9亲本细胞；
42.图4为采用pc-9-del细胞对虚拟筛选得到的化合物进行进一步的筛选和活性验证结果图：(a)实验室自建库中部分化合物筛选结果；(b)specs和enamine商业库中部分化合物筛选结果；
43.图5为czc-54252、egfr-2c和azd9291对几种携带egfr突变细胞的抑制活性统计结果图；
44.图6为czc-54252的酶水平测试结果和选择性统计结果图；(a)czc-54252的分子结构；(b)czc-54252对egfr(l858r/t790m/c797s)突变激酶的抑制曲线；(c)czc54252、egfr-2c和azd9291抑制a549细胞活力的曲线图。
具体实施方式
45.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
46.除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编，1984)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司(academic press，inc.)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《当代分子生物学方法(current protocols in molecular biology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(current protocols in immunology)》(j.e.coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
47.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
48.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
49.实施例1
50.本实施例构建携带egfr(del/t790m/c797s)或egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的nsclc细胞株，采用慢病毒质粒构建了生长高度依赖于这两种耐药突变的靶点等效基因
细胞模型。
51.所涉及的材料：
52.pcdh-cmv-mcs-ef1-puro egfr
t790m/del19,t790m/l858r,l798i/t790m/del19,l798i/t790m/l858r
质粒、pspax2、vsvg慢病毒包装载体由实验室委托长沙优宝生物科技有限公司构建，质粒小量抽提取试剂盒购买自biomiga公司，lipofectamine 2000转染试剂盒购买自invitrogen公司，嘌呤霉素、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hydroxyethyl，hepes)购买自sigma-aldrich公司，opti-mem培养基购于gibco公司，酵母提取物、蛋白胨购买自英国索莱宝公司，甘油和琼脂粉购买自上海生工生物有限公司。载体信息如图1所示。
53.1.egfr突变质粒的扩增
54.pcdh-cmv-mcs-ef1-puro egfr
t790m/del19,t790m/l858r,l798i/t790m/del19,l798i/t790m/l858r
质粒、pspax2、vsvg慢病毒包装载体由实验室委托长沙优宝生物科技有限公司构建，将提供的穿刺菌用于egfr突变质粒的扩增。
55.在细菌操作台上将50μl穿刺菌用准备好的一次性涂布器均匀涂布于氨苄(1:1000)抗性lb固体培养基上(表1所示)，将培养皿倒置放于37℃恒温培养箱中，过夜培养，约16h；
56.用灭过菌的小枪尖在平板上挑取一个单克隆菌落，将其接种到含有5ml氨苄霉素(1:1000)的lb液体培养基(表1所示)中，遂放在37℃恒温摇床中过夜约16h，摇床转速设置为250rpm；
57.将上述菌液分装在3-4支1.5ml塑料离心管中，室温下10000rpm离心1min之后菌体会沉降在离心管底部，此时将废弃的上清培养基尽可能除去，按照biomiga质粒小提取试剂盒i进行后续步骤。注意：务必使细菌细胞充分混匀在buffer a1中，否则将导致菌体的不完全裂解，降低产量。将得到的各个组分质粒，吸取1-2μl于nanodrop 2000c超微量分光光度计测试提取的质粒浓度，并将剩余的质粒组分放置于4℃冰箱备用，部分采用灭菌的50％甘油：质粒＝1:1对质粒进行保种，放置在-80℃冰箱中长期保存。(为了确保质粒的准确性，将提取好的质粒送入擎科公司测序)。
58.表1lb培养基配制方法
59.60.2.egfr突变重组慢病毒质粒的包装
61.采用293t作为慢病毒包装细胞。用胰酶轻微消化处于对数生长期的293t细胞，用新鲜培养基终止消化，800rpm离心3min，再将细胞重悬于适量的培养基中，根据需要把相应的细胞重悬液接种于10cm的细胞培养皿中，于37℃、5％co2培养箱内培养，待细胞量达到70-80％即可进行转染；
62.(1)制备plasmid dna-lipid复合物1ml，包括两部分组成：
63.①
稀释dna:将步骤1制备的egfr突变质量(8μg)、pspax2(8μg，慢病毒包装辅助质粒)和vsvg(4μg，表达水泡性口炎病毒的融合性外壳g糖蛋白的质粒)混合于500μl opti-mem培养基中，室温静置5min，
64.②
稀释lipofectamine 2000:向50μl lipofectamine 2000中加入500μlopti-mem培养基中，
65.(2)将上述步骤中
①
缓缓加入
②
中，室温孵育20min；
66.(3)将此复合物1ml加入含有10ml无血清培养基换液的293t细胞中，充分孵育；
67.(4)转染后16h，将293t细胞的培养基转换成完全培养基；
68.(5)转染后48h，收集培养基上清，并用0.45μm滤头过滤去除细胞碎片，选取一部分感染靶细胞，剩余的慢病毒包装液保存于-80℃冰箱中。
69.3.慢病毒感染并筛选稳转细胞
70.pc9和hcc827细胞是egfr成瘾的nsclc细胞，生长高度依赖于egfr活性。实验时，提前将待感染的目标细胞接种到5cm细胞培养皿中，当细胞数目达到70-80％后，用2ml正常培养基换液，再向其中加入2ml慢病毒，40μlhepes(1m)和8μl聚戊二烯(polyprene，1mg/ml)的辅助试剂；将上述细胞培养皿置于37℃孵箱孵育过夜(12h-16h)后换液培养；48h后将培养基转换成含有2μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的完全培养基筛选反复筛选，以获得生长依赖于egfr
d3,l3,d2,l2
耐药突变的稳转细胞株(t790m/del19对应d2，t790m/l858r对应l2，c797s/t790m/del19对应d3，c797s/t790m/l858r对应l3)；将筛选后的细胞尽快保种，余下细胞发明人将其继续培养在10cm细胞培养皿中。
71.4.突变系列细胞的鉴定
72.为了进一步验证含各种突变体的egfr基因已成功转入宿主细胞，初步测验了不同细胞株对gefitinib、azd9291、egfr-2c药物的敏感性。具体方法如下：需收集对数生长期的突变细胞，将其按照3000/孔的细胞数充分混匀接种于96孔板中(由于边孔效应，外围边孔用无菌生理盐水覆盖)，每孔100μl培养基。待细胞贴壁后，向其中加入不同浓度的100μl待测化合物(gefitinib、azd9291、egfr-2c)。按照30μm或者10μm的初始浓度，每个浓度设置三个复孔(为了保证数据的可重复性)，3倍稀释，共设置9个浓度梯度。并且需要设置相应的对照组(不含药物)和空白培养基组。将加入含药培养基的96孔板置于37℃、5％co2的细胞培养箱内培养72h后，用显微镜观察对照组细胞(达到80-90％)，用排枪向每孔加入20μl 5mg/ml mtt(对活细胞的线粒体进行染色)溶液(无菌生理盐水配制，避光保存)，置于细胞培养箱中染色2-4h后，再用20％sds(用超纯水配制，sds很难溶解，需要在超声仪中进行超声，将其定容至固定体积后，向其中加入千分之一的浓盐酸)将上述染色产生的结晶紫溶解，遂置于细胞培养箱中孵育过夜，翌日将96孔板置于酶标仪中测试od值(od值0.8-1.2表示细胞数目合适，结果准确)，测试波长为570nm。按照公式：细胞相对存活率％＝[(对照组od值-给药
组od值)/(对照组od值-空白组od值)]
×
100，颜色越深，od值越大，活细胞数目越多，将所得结果键入graphpad prism5.0软件中，计算相应的ic50值，并与文献报道的数值对比。
[0073]
以hcc827-del和pc-9-del代表转染了egfr(del/t790m/c797s)突变的耐药细胞，以hcc827-lrtm和pc-9-lrtm代表转染了egfr(l858r/t790m/c797s)突变的耐药细胞。如图2所示，azd9291对hcc827、hcc827-del和hcc827-lrtm的抑制活性分别为0.004μm、0.32μm和0.56μm，对pc-9、pc-9-del和pc-9-lrtm的ic50分别为0.006μm、1.2μm和2.8μm，该数据结合测序结果(此处未展示)表明本发明成功构建了生长依赖于两种耐药突变的细胞。考虑到采用pc-9构建的耐药细胞耐药性更强，故后续主要采用pc-9-del和pc-9-lrtm进行egfr(c797s)抑制剂筛选及药效学研究(图3为重复验证结果)。
[0074]
图3结果显示，pc-9(l858r/t790m/l798i)三突变细胞比pc-9(l858r/t790m)双突变细胞具有更高的耐(gefitinib)药性，pc-9(del/t790m)双突变细胞比pc-9(del/t790m/l798i)三突变细胞具有更高的耐(gefitinib)药性。
[0075]
实施例2
[0076]
针对egfr(c797s)耐药突变的小分子抑制剂筛选
[0077]
以egfr(l858r/t790m/c797s)晶体结构为基础，采用分子对接gold软件对specs、enamine化合物库以及实验室自建库中的6万多个化合物进行虚拟筛选，根据打分函数和成药性预测挑选化合物，再采用构建的pc-9-del和pc-9-lrtm细胞进一步筛选egfr(c797s)抑制剂。
[0078]
如图4所示，通过筛选发现了具有潜在活性的egfr(c797s)抑制剂czc-54252。在筛选过程中，为了提高筛选命中率，发明人同时检测了化合物对多种不同类型肿瘤细胞的抑制活性，尽量排除脱靶和细胞毒类药物的干扰。
[0079]
实施例3
[0080]
czc-54252体外抗nsclc药效学及作用机制研究。
[0081]
按照实施例1的检测药物对于耐药细胞的抑制活性的方法，分别检测czc-54252以及阳性对照药物(azd9291和egfr-2c)对耐药细胞的抑制活性。检测czc-54252对于egfr野生型nsclc细胞、多种人源细胞株的抑制活性。
[0082]
如图5所示，czc-54252对pc-9、pc-9-del和pc-9-lrtm的ic
50
分别为0.231μm，0.223μm和0.258μm，其对携带egfr(c797s)突变的nsclc细胞的抑制活性显著高于azd9291和阳性对照egfr-2c。
[0083]
此外，czc-54252对a549、nci-h23和nci-h358等egfr野生型nsclc细胞的ic
50
分别为1.801μm、3.736μm和5.396μm，对其它类型肿瘤细胞的ic
50
大多数超过3μm(表2)，显示了一定的选择性。
[0084]
表2czc54252对多种人源细胞株的抑制活性
[0085][0086][0087]
实施例4
[0088]
对czc-54252靶向egfr酶水平测试。
[0089]
测试方法与步骤如下：czc54252的体外激酶抑制活性检测由上海睿智化学研究有限公司按照已建立的激酶平台，利用lanthascreen assay方法进行ic
50
的测试。
[0090]
酶水平测试结果显示，czc-54252对egfr(l858r/t790m/c797s)突变体的ic
50
为9.8nm(图6)，进一步证实了czc-54252可靶向egfr(c797s)耐药突变。
[0091]
为了验证czc-54252对egfr(c797s)耐药突变的抑制作用是否依赖于其原靶点lrrk2，发明人还检测了多种lrrk2抑制剂对几种nsclc细胞的抑制活性，结果如表3所示，仅czc-54252对pc-9-del和pc-9-lrtm两种携带egfr(c797s)耐药突变的nsclc细胞具有抑制作用，其他6种lrrk2抑制剂均无此功能，表明czc-54252通过直接靶向egfr(c797s)发挥抗肿瘤作用，与其原靶点lrrk2无相关性。
[0092]
表3lrrk2靶点相关化合物对不同细胞的ic50数值(μm)
[0093][0094]
综上，本发明采用基因工程技术(慢病毒质粒)构建了生长高度依赖于egfr(del/t790m/c797s)或egfr(l858r/t790m/c797s)这两种耐药突变的靶点基因的耐药细胞模型。此类细胞兼具基于靶点和表型筛选的优势，通过寻找抑制细胞增殖的化合物即为该耐药突变靶点的潜在抑制剂，显著提高了药物发现的效率。因此，耐药细胞模型的提出大幅提升了egfr耐药突变的小分子抑制剂的研发速率。
[0095]
本发明提供的耐药细胞模型的建立可以为以非小细胞肺癌的egfr通路相关药物筛选及耐药研究提供细胞模型，提高筛选的特异性及灵敏性；也可应用于egfr影响的相关通路蛋白的差异性比较研究。
[0096]
czc-54252除了表现出对egfr(del/t790m/c797s)和egfr(l858r/t790m/c797s)耐药三突变细胞有较高抑制活性，本发明还发现其czc-54252对a549、nci-h23和nci-h358等egfr野生型nsclc细胞的ic50分别为1.801μm、3.736μm和5.396μm，对其它类型肿瘤细胞的ic50大都》3μm，显示了一定的选择性，避免了第二代egfr抑制剂选择性差多的缺点。并且czc-54252通过直接靶向egfr(c797s)发挥抗肿瘤作用，与其原作用靶点lrrk2无相关性。
[0097]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型，其特征在于，所述细胞内包括带有egfr(del/t790m/c797s)三突变的质粒或带有egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的质粒；带有egfr(del/t790m/c797s)三突变的质粒表达突变型egfr，突变型egfr蛋白e746-a750缺失突变、第790位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸且第797位半胱氨酸突变为丝氨酸，其cds序列具有如seq id no.1所示；带有egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的质粒表达突变型egfr，突变型egfr蛋白第858位氨基酸由亮氨酸突变为精氨酸、第790位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸且第797位半胱氨酸突变为丝氨酸，其cds序列具有如seq id no.2所示；所述细胞为对egfr抑制剂成瘾的非小细胞肺癌细胞。2.根据权利要求1携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型，其特征在于，所述对egfr抑制剂成瘾的非小细胞肺癌细胞选自pc9或hcc827细胞。3.一种携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：将带有egfr(del/t790m/c797s)或egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的质粒、慢病毒包装辅助质粒、表达水泡性口炎病毒的融合性外壳g糖蛋白的质粒共同转染宿主细胞以包装重组慢病毒，然后将重组慢病毒感染对egfr抑制剂成瘾的非小细胞肺癌细胞，筛选获得携带egfr(del/t790m/c797s)或egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的非小细胞肺癌细胞株；带有egfr(del/t790m/c797s)三突变的质粒表达突变型egfr，突变型egfr蛋白e746-a750缺失突变、第790位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸且第797位半胱氨酸突变为丝氨酸，其cds序列具有如seq id no.1所示；带有egfr(l858r/t790m/c797s)三突变的质粒表达突变型egfr，突变型egfr蛋白第858位氨基酸由亮氨酸突变为精氨酸、第790位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸且第797位半胱氨酸突变为丝氨酸，其cds序列具有如seq id no.2所示。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，，所述对egfr抑制剂成瘾的非小细胞肺癌细胞选自pc9或hcc827细胞。5.如权利要求1或2所述的携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型在筛选egfr耐药突变的小分子抑制剂中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述egfr耐药突变选自egfr(c797s)耐药突变、egfr(t790m)耐药突变、egfr(l858r)耐药突变、egfr(l798i)耐药突变、egfr(t790m/del19)耐药突变、egfr(t790m/l858r)耐药突变、egfr(del/t790m/c797s)耐药突变、egfr(l858r/t790m/c797s)耐药突变、egfr(del/t790m/l798i)耐药突变和egfr(l858r/t790m/l798i)耐药突变中的任意一种。7.一种筛选egfr耐药突变的小分子抑制剂的方法，其特征在于，其包括：以egfr(l858r/t790m/c797s)蛋白晶体结构为基础，采用分子对接gold软件对specs、enamine化合物库中的化合物进行虚拟筛选，根据打分函数和成药性预测挑选化合物，再采用权利要求1或2所述的携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型或权利要求3-4任一项所述的构建方法获得的耐药细胞模型筛选egfr耐药突变的小分子抑制剂；优选地，采用分子对接gold软件对specs、enamine化合物库以及自建库中的化合物进行虚拟筛选。
8.如权利要求1或2所述的携带egfr三突变靶点基因的耐药细胞模型在制备抗肿瘤药物中的应用；优选地，所述肿瘤为非小细胞肺癌。9.czc-54252在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物用于：靶向egfr(c797s)耐药突变。

技术总结
本发明公开了一种携带EGFR三突变靶点基因的耐药细胞模型、构建方法及其应用，涉及生物技术领域。耐药细胞模型内包括带有EGFR(DEL/T790M/C797S)三突变的质粒或带有EGFR(L858R/T790M/C797S)三突变的质粒。此类细胞兼具基于靶点和表型筛选的优势，通过寻找抑制细胞增殖的化合物即为该耐药突变靶点的潜在抑制剂，显著提高了药物发现的效率。因此，耐药细胞模型的提出大幅提升了EGFR耐药突变的小分子抑制剂的研发速率。分子抑制剂的研发速率。分子抑制剂的研发速率。


技术研发人员：钟磊 赵志鹏 师健友 童荣生 马汀楠
受保护的技术使用者：四川省医学科学院
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/23