一种响应肉桂醛的下调启动子及其筛选方法应用

1.本发明属于基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一种响应肉桂醛的下调启动子及其筛选方法应用。


背景技术：

2.芳香族或杂环族伯胺(aromatic or heterocyclic primary amines,ahpas)是一类重要的医药中间体、有机合成中间体，在医药、农药、聚合物、染料和洗涤剂的制造中有着广泛的应用(selective hydrogenation of nitriles to primary amines by using a cobalt phosphine catalyst[j].chemsuschem 2017,10,842-846.)。目前ahpas的工业合成方法主要是化学合成法。这类反应的特点是使用贵金属催化剂(ru、pd等)、有机溶剂(水合肼、甲醇等)或需要苛刻的反应条件(高温或高压)及昂贵的安全防护设备(efficient and mild reductive amination of carbonyl compounds catalyzed by dual-function palladium nanoparticles[j].acs sustainable chemistry and engineering,2020,8(3):1618-1626.)。这导致生产危险性高，生产成本高，而且会造成严重环境污染。因此，环境友好、反应条件温和的生物合成法是对化学合成法的很好补充。
[0003]
目前，ahpas的生物合成法研究较少。本实验室之前报导了以羧酸为底物，在来自neurospora crassa的car(nccar)和来自ochrobactrum anthropi的ω-ta(oata)的催化下，生物合成3-氨甲基吡啶、苄胺、肉桂胺等ahpas的生物合成新途径(self-sufficient whole-cell biocatalysis for 3-(aminomethyl)pyridine synthesis.biochemical engineering journal 2022,183.)。该方法存在一些缺点，如ahpas的生物催化合成过程中，2个酶的代谢失衡容易导致毒性中间体醛的积累，影响菌体生长；且醛容易被内源酶还原生成醇，或被氧化生成酸，这导致ahpas的产率、产量降低。
[0004]
动态调控是指特定的生物识别元件，通过响应细胞内外环境的变化，调控下游蛋白的表达水平，使蛋白的表达水平随着环境的变化而变化。动态调控分为3类，分别是响应代谢物的启动子、响应代谢物的转录调控因子及响应细胞密度的群体感应。其中，使用响应代谢物的启动子调控胞内代谢物水平的报导很多。例如，使用响应香草醛(儿茶酚合成过程中的中间体)的启动子动态调控儿茶酚合成途径中所需酶的表达水平及香草醛通道蛋白的表达水平，使得儿茶酚的产量提高40％(toward engineering e.coli with an autoregulatory system for lignin valorization.pnas 2018,115,2970-2975.)；使用响应法呢基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，fpp，麦角固醇合成过程中的中间体)的启动子，动态调控合成紫穗槐二烯合成途径中所需酶的表达水平，使得产物紫穗槐二烯的产量提高1倍(engineering dynamic pathway regulation using stress-response promoters.nat biotechnol2013,31,1039-46.)。这些报导表明，动态调控是解决胞内代谢物积累、提高产物产量的好方法。
[0005]
因此，在肉桂胺的生物合成中，为了解决毒性中间体醛积累的问题，利用响应代谢物的启动子，通过响应胞内代谢物(醛)的变化，调控下游蛋白的表达水平将具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
为了解决肉桂胺的生物合成过程中存在的毒性中间体积累的问题，本发明提供了用于筛选响应肉桂醛积累的启动子的方法。筛选响应肉桂醛积累的启动子是为了利用启动子响应肉桂醛浓度，从而调节肉桂胺合成途径中的酶的表达水平，降低中间体肉桂醛的积累水平，以降低肉桂醛对工程菌活性的抑制，进而提高肉桂胺的产量。
[0007]
为实现上述技术效果，本发明提供了如下技术方案：
[0008]
本发明的第一个目的是提供一种响应肉桂醛的下调启动子的筛选方法，包括以下步骤：
[0009]
1)用0mm和1mm肉桂醛分别处理e.coli rare(de3)，获得2组菌株；
[0010]
2)转录组分析步骤1)获得的2组菌株rna水平的表达差异，挑出明显差异表达基因对应的启动子p
x
；
[0011]
3)将绿色荧光蛋白基因vgfp连接到pet28a载体上，得到重组质粒pet28a-vgfp；
[0012]
4)将重组质粒pet28a-vgfp上的t7启动子和laco序列替换成转录组分析后挑出的启动子p
x
得到重组质粒pet28a-p
x-vgfp，将重组质粒转化进e.coli rare(de3)感受态，得到基因工程菌株rare(de3)/pet28a-p
x-vgfp；
[0013]
5)通过荧光强度检测p
x
是否响应肉桂醛。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，步骤1)所述e.coli rare(de3)为敲除醛酮还原酶基因和醇脱氢酶基因的大肠杆菌k-12mg1655；所述醛酮还原酶基因为dkgb基因、yeae基因和dkga基因；所述醇脱氢酶基因为yqhd基因、yahk基因和yjgb基因。
[0015]
在本发明的一种实施方式中，所述1mm肉桂醛为肉桂醛的亚致死剂量。
[0016]
进一步地限定，所述亚致死剂量为尚未出现死亡但能引起行为、生理、生化和组织等方面的某种效应的毒物剂量。
[0017]
在本发明的一种实施方式中，步骤1)所述处理是指利用lb培养基于37℃，200rpm条件下摇瓶培养菌株e.coli rare(de3)，当菌液od
600nm
达到0.5-0.7时，分别添加终浓度为0mm和1mm的肉桂醛，于1h和2.5h后分别收集菌体。
[0018]
在本发明的一种实施方式中，步骤2)所述转录组分析前还包括对步骤1)获得的菌株进行总rna的提取和rna质量检测。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，步骤2)所述转录组分析为对1h和2.5h收集到的两组菌株进行转录组分析，分别找到1h和2.5h的差异基因取交集，然后找出log2fold change小于-5的基因，所述基因上游前300bp为启动子p
x
。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，步骤2)挑出的启动子p
x
为pa、pb、pc、pd、pe、pf、pg和ph；pa是饥饿脂蛋白slp对应基因的上游前300bp核苷酸序列(如seq id no.1所示)，pb为内膜蛋白yhid对应基因的上游前300bp核苷酸序列(如seq id no.2所示)，pc为乙醇酸脱氢酶glcd对应基因的上游前300bp核苷酸序列(如seq id no.3所示)，pd为dna结合转录激活子gade对应基因的上游的前300bp核苷酸序列(如seq id no.4所示)，pe是周质酸应激分子伴侣hdea对应基因的上游前300bp核苷酸序列(如seq id no.5所示)，pf为nad依赖的二氢嘧啶脱氢酶亚基pret对应基因的上游前300bp核苷酸序列(如seq id no.6所示)，pg为周质酸应激分子伴侣hdeb对应基因的上游前300bp核苷酸序列(如seq id no.7所示)，ph为推测的dna结合转录调节因子dctr对应基因的上游的前300bp核苷酸序列(如seq id no.8所示)；
ibpb、nema、frmr和marr在ncbi中的accession no.分别是948192、948192、944986和945825。上述slp、yhid、glcd、gade、hdea、pret、hdeb和dctr的ncbi accessionno.分别是948022、948019、947353、948023、948025、949049、948026和948021。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，步骤3)所述绿色荧光蛋白基因vgfp来源于aequorea victoria，其核苷酸序列如seq id no.9所示。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，步骤5)所述通过荧光强度检测p
x
是否响应肉桂醛的具体方法如下：
[0023]
(1)活化：将步骤4)获得的基因工程菌株rare(de3)/pet28a-p
x-vgfp接种于lb培养基(含50μg/mlkan)，37℃，220rpm，活化过夜获得种子液；
[0024]
(2)取步骤(1)获得的种子液0.2ml接种于20ml lb培养基(50μg/ml kan)，37℃，220rpm培养；
[0025]
(3)待菌株长至od
600nm
为0.5-0.7时，加入1mm肉桂醛进行诱导(实验组)，诱导温度为37℃，诱导时间为2.5h，以经0mm肉桂醛诱导的菌株作为对照组；
[0026]
(4)取样：诱导后取样，离心取沉淀，用pbs洗1次，再稀释至od
600nm
为1；
[0027]
(5)检测荧光：利用酶标仪检测样品荧光强度，激发光/发射光＝480/525nm，判断标准为od
600nm
下实验组荧光强度/对照组荧光强度≤50％定为有响应。
[0028]
本发明的第二个目的是提供由上述筛选方法获得的响应肉桂醛的下调启动子pd，所述下调启动子pd为dna结合转录激活子gade对应基因的上游前300bp序列，所述序列如seq id no.4所示。
[0029]
本发明的第三个目的是提供由上述筛选方法获得的响应肉桂醛的下调启动子pe，所述下调启动子pe为周质酸应激分子伴侣hdea对应基因的上游前300bp序列，所述序列如seq id no.5所示。
[0030]
本发明的第四个目的是提供由上述筛选方法获得的响应肉桂醛的下调启动子pf，所述下调启动子pf为nad依赖的二氢嘧啶脱氢酶亚基pret对应基因的上游前300bp序列，所述序列如seq id no.6所示。
[0031]
本发明的第五个目的是提供由上述筛选方法获得的基因工程菌株rare(de3)/pet28a-p
d-vgfp，其特征在于，所述pd为dna结合转录激活子gade对应基因的上游前300bp序列，所述序列如seq id no.4所示。
[0032]
本发明的第六个目的是提供上述基因工程菌株rare(de3)/pet28a-p
d-vgfp在作为肉桂醛的生物传感器，用来筛选提高肉桂醛产量的酶或菌株，或检测环境中的肉桂醛中的应用。
[0033]
本发明的有益效果：
[0034]
本发明通过筛选获得了响应肉桂醛的下调启动子pd、pe和pf，其中，pd的响应最为明显，荧光强度为对照组荧光强度的12％；pd没有响应3mm肉桂酸、1mm肉桂醇、3mm肉桂胺，说明pd强度不受体系中肉桂酸、肉桂醇、肉桂胺的干扰；肉桂醛在0-1mm之间时，pd强度与肉桂醛浓度成正比，说明pd适合做响应肉桂醛的下调启动子。此外，含有下调启动子pd的重组工程菌株rare(de3)/pet28a-p
d-vgfp可以作为响应肉桂醛的生物传感器，用来筛选提高肉桂醛产量的酶或菌株，也可以用来检测环境中的肉桂醛。
附图说明
[0035]
图1为不同浓度肉桂醛处理下菌株e.coli rare(de3)的生长曲线图；
[0036]
图2为肉桂醛对e.coli rare(de3)的毒力回归方程；
[0037]
图3为rnaseq分析肉桂醛处理/未处理的e.coli rare(de3)的差异基因图；
[0038]
图4为启动子筛选的结果图；其中，图4中的a为pa、pb、pc、pd、pe、pf、pg和ph对1mm肉桂醛的响应结果图，
“‑”
表示未加肉桂醛(对照组)，“+”表示添加1mm肉桂醛(实验组)，图4中的b为其他物质对pd的干扰效果图，图4中的c为pd对肉桂醛的响应范围结果图。
具体实施方式
[0039]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式及说明书附图对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
[0040]
本发明所用e.coli rare(de3)：mg1655(de3)δdkgbδyeaeδ(yqhc-dkga)δyahkδyjgb，购买自美国addgene公司，该菌株为敲除醛酮还原酶基因和醇脱氢酶基因的大肠杆菌k-12mg1655；所述醛酮还原酶基因为dkgb基因、yeae基因和dkga基因；所述醇脱氢酶基因为yqhd基因、yahk基因和yjgb基因。
[0041]
本发明所用质粒提取试剂盒购自美国omega公司，操作步骤按照产品说明书进行。
[0042]
本发明所用pbs缓冲液购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
[0043]
本发明所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
[0044]
lb培养基配方：酵母粉5g/l，nacl 10g/l，蛋白胨10g/l，接种时补加氯霉素50μg/ml。
[0045]
本发明涉及的定义和缩写如下：
[0046]
芳香族或杂环族伯胺：ahpas；
[0047]
来自neurospora crassa的羧酸还原酶：nccar；
[0048]
来自ochrobactrum anthropi的转氨酶：oata；
[0049]
异丙基硫代半乳糖苷：iptg；
[0050]
卡那霉素：kan；
[0051]
绿色荧光蛋白基因：vgfp；
[0052]
大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)：e.coli。
[0053]“过量表达”或“过表达”指细胞内特定基因受到各种信号调控后，在生物体中超过原有水平表达，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
[0054]
实施例1：筛选可能响应肉桂醛的下调启动子
[0055]
利用lb培养基于37℃，200rpm条件下摇瓶培养菌株e.coli rare(de3)，当菌液od
600nm
达到0.5-0.7时，分别添加终浓度为0mm，0.5mm，1.0mm，1.5mm，2mm，2.5mm，3mm，3.5mm，4mm和4.5mm的肉桂醛进行处理，检测不同浓度肉桂醛处理下，菌株e.coli rare(de3)的生长曲线(见图1)。根据生长曲线，做出毒力回归方程(肉桂醛浓度对od
600nm
)(见图2)。
[0056]
根据毒力回归方程，计算肉桂醛对e.coli rare(de3)的亚致死剂量(亚致死剂量是一个范围，一般选择ld
10-ld
25
，ld
25
是指杀死25％的个体时的药剂用量)。
[0057]
ld
25
的计算：ld
25
：4.09
×
(1-25％)＝-0.9472x+4.1284；ld
25
＝x＝1mm。
[0058]
因此，肉桂醛对e.coli rare(de3)的亚致死剂量为1mm。
[0059]
利用lb培养基于37℃，200rpm条件下摇瓶培养菌株e.coli rare(de3)，当菌液od
600nm
达到0.5-0.7时，分别用0mm肉桂醛和1mm肉桂醛处理菌株e.coli rare(de3)，并在处理后的1h和2.5h收集菌体，对1h和2.5h收集到的两组菌株进行总rna的提取和rna质量检测，通过转录组分析分别找到1h和2.5h的两组菌株的差异基因(见图3)。转录组分析结果表明，1h后，肉桂醛处理/未处理样品的差异基因共1164个，其中上调基因有597个，下调基因有567个；2.5h后，肉桂醛处理/未处理样品的差异基因共1316个，其中上调基因有663个，下调基因有653个(见表1)。
[0060]
表1肉桂醛处理/未处理样品的差异基因
[0061][0062]
随后，对1h和2.5h的下调差异基因取交集，然后挑选出log2fold change＜-5(fold change表示两样品(组)间rna表达量的比值)的基因对应的启动子(见表2)。
[0063]
表2log2fold change＜-5的基因的对应的启动子
[0064][0065]
seq id no.1：
[0066]
tattgattattagcactttataatcattgaataaaaatagattttatgtacttttaaaacaatgcactatattatggggtgatggatattcatgtcacgccccaaaattaactga gttcacctaaacagaaaggatataaacatcagacaggtttacgttactatcaggcatatcacctcagaatcagatgaaaactataaagaaatatctattatggttttaatatttgttgataaggatagtaac
[0067]
seq id no.2：
[0068]
tgaggtgcaagtaaaaaggagtagcaagttgagccatcttgctgctcctttttgcatttttat
[0069]
seq id no.3：
[0070]
acgaacccggtgaatttgcccgcgcggaagagctgggcgggaagatcctcgaactctgcgttgaagttggcggcagcatcagtggcgaacatggcatcgggcgagaaaaaatcaatcaaatgtgcgcccagttcaacagcgatgaaatcacgaccttccatgcggtcaaggcggcgtttgaccccgatggtttgctgaaccctgggaaaaacattcccacgctacaccgctgtgctgaatttggtgccatgcatgtgcatcacggtcatttacctttccctgaactggagcgtttctg
[0071]
seq id no.4：
[0072]
agtaatattcttcagagatcacaaactggttattgataacttattcttgggcagtaatccgcaaacgttaactttttgtttgctatttacaagctgataacaaccaggaatcttacttaggatcaatatatggagtgcgtgatggataaatctgaagtattgattagtgttaatagacgtattagttcacgaagggtaaagttcttataggcgtttactatattgaacaacgattcggacaaggatgtaaataatgaaaaggatgacatattcgaaacgataacggctaaggagcaagtt
[0073]
seq id no.5：
[0074]
agaaccaccctataaaattaagaagaaaatcccctgctatcaatctatgccaaaaacgcgtctaagaatgcagtcgatttaataaaaatttcctaattgcagtatctgatgcatctgtaactcattgtattgaaataaaaatatctgattttgatattttccatcaacatgacatatacagaaaaccaggttataacctcagtgtcgaaattgattcgtgacggctctttcactttatagttgaggatattacg
[0075]
seq id no.6：
[0076]
tattcccctctccagttaattattgagaataattattacttcacctgataagctgcggatatcacattcctaaccgcagctatttgtgaatcttttcacagtttaaattcccccgcacgcttagccttaatatcagtacattattatttactaaacgctcgccttaat tacctatagcattaaggaagatcac
[0077]
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[0078]
ttccgggaatgcgttacatcgtacttccttgcatattgaacaggccggaatatcttctttaaaagcagctattcctcctgttcatatataatctctatattgaatgggttacaaa
[0079]
seq id no.8：
[0080]
caccaccgaaagatgcagatgctttctcagcatctgcatcatgcattacatcaaattaatacacagtaagctaactattattattataagccctgtcctgttaattacctttggcaaactgattataaagttaatgtccgcaccaggagtcggtt
[0081]
实施例2：含有响应肉桂醛的下调启动子的重组工程菌株的构建
[0082]
vgfp基因被华大基因合成，其核苷酸序列如seq id no.9所示。将vgfp基因通过ndei和sali连接到pet28a载体上，得到重组质粒pet28a-vgfp；利用p
x
(pa、pb、pc、pd、pe、pf、pg和ph)序列替换pet28a-vgfp的p
t7
及laco序列，酶切位点为bglii和ncoi，得到相应的重组质粒pet28a-p
x-vgfp；将重组质粒转化进e.coli rare(de3)感受态，得到重组工程菌株rare(de3)/pet28a-p
x-vgfp(包括rare(de3)/pet28a-p
a-vgfp，rare(de3)/pet28a-p
b-vgfp，rare(de3)/pet28a-p
c-vgfp，rare(de3)/pet28a-p
d-vgfp，rare(de3)/pet28a-p
e-vgfp，rare(de3)/pet28a-p
f-vgfp，rare(de3)/pet28a-p
g-vgfp和rare(de3)/pet28a-p
h-vgfp。获得的重组质粒pet28a-p
d-vgfp的核苷酸序列见seq id no.10所示。
[0083]
seq id no.9：
[0084]
atgggcagtaaaggtgaagaactgtttaccggcgttgtgccaattctggttgaactggatggtgatgttaatggtcataaatttagcgttcgcggtgaaggtgaaggcgatgcaacaaatggtaaactgacactgaaatttatctgcacaaccggtaaactgcctgtgccgtggcctacactggtgacaacactgacatacggtgttcagtgttttagtcgttatccggatcacatgaaacgccatgatttttttaaaagcgccatgccagaaggctatgtccaggaacgtaccatctcttttaaagatgatggcacctataaaacccgtgcagaagttaaatttgaaggcgataccctggttaatcgtattgaactgaaaggtattgattttaaagaagatggtaacatcctgggtcataaactggaatataattttaacagccataacgtgtatatcactgccgataaacagaaaaatggtattaaagcaaactttaaaatccgccataacgtggaagatggcagcgttcagctggcagatcattatcagcagaacaccccgatcgg tgatggtccagttctgctgccagataaccattatctgagtacccagagcgttctgagcaaagatccgaatgaaaaacgtgatcacatggttctgctggaatttgtg
acagccgccggtattgcgcaggttcagctggttgaaagcggtggtgccctggttcagccaggtggtagtctgcgtctgagctgtgctgctagtggttttccggttaatcgttatagtatgcgttggtatcgtcaggcaccgggtaaagaacgtgaatgggttgcaggtatgtcttctgcgggtgatcgtagctcttatgaagatagtgttaaaggtcgttttaccattagccgtgatgatgcgcgtaataccgtttatctgcaaatgaatagcctgaaaccggaagataccgccgtttattattgtaatgttaatgtgggttttgaatattggggtcagggcacccaggttaccgttagtcatcattaa
[0085]
seq id no.10：
[0086]
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaatt
[0087]
ccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctaccttt
[0088]
gccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgt
[0089]
cgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatcca
[0090]
tgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataac
[0091]
accccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatccct
[0092]
taacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatc
[0093]
ttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
[0094]
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggt
[0095]
aactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagtt
[0096]
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[0097]
gttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaag
[0098]
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[0099]
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[0100]
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[0101]
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[0102]
tctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgc
[0103]
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[0104]
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[0105]
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[0106]
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[0107]
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[0108]
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[0109]
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[0110]
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[0111]
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[0112]
agcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgtt
[0113]
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[0114]
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[0115]
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[0116]
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[0117]
ggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtag
[0118]
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[0119]
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[0120]
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[0121]
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[0122]
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[0123]
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[0137]
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[0158]
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[0159]
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[0160]
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[0161]
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[0163]
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[0165]
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[0166]
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[0167]
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[0169]
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[0170]
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[0171]
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[0173]
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[0174]
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[0175]
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[0176]
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[0177]
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[0178]
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[0179]
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[0180]
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[0181]
gctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtc
[0182]
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[0183]
实施例3：筛选响应肉桂醛的下调启动子
[0184]
摇瓶培养rare(de3)/pet28a-p
x-vgfp，od
600nm
达到0.5-0.7时，实验组加1mm肉桂醛，对照组不加肉桂醛。然后，利用gfp的荧光强度表征启动子的强度，从而筛选响应1mm肉桂醛的启动子。具体方法如下：
[0185]
(1)活化：将实施例2获得的基因工程菌株rare(de3)/pet28a-p
x-vgfp接种于lb培养基(含50μg/mlkan)，37℃，220rpm，活化过夜获得种子液；
[0186]
(2)取步骤(1)获得的种子液0.2ml接种于20ml lb培养基(含50μg/ml kan)，37℃，220rpm培养；
[0187]
(3)待菌株长至od
600nm
为0.5-0.7时，加入1mm肉桂醛进行诱导(实验组)，诱导温度为37℃，诱导时间为2.5h，以经0mm肉桂醛诱导的菌株作为对照组；
[0188]
(4)取样：诱导后取样，离心取沉淀，用pbs洗1次，稀释至od
600nm
为1；
[0189]
(5)检测荧光：利用酶标仪检测样品荧光强度，激发光/发射光＝480/525nm，判断标准为od
600nm
下实验组荧光强度/对照组荧光强度≤50％定为有响应。
[0190]
结果显示，含有pd的重组工程菌株rare(de3)/pet28a-p
d-vgfp，含有pe的重组工程菌株rare(de3)/pet28a-p
e-vgfp和含有pf的重组工程菌株rare(de3)/pet28a-p
f-vgfp响应1mm肉桂醛，荧光强度分别降为对照组的12％，13％和28％，而含有pa的重组工程菌株rare(de3)/pet28a-p
a-vgfp，含有pb的重组工程菌株rare(de3)/pet28a-p
b-vgfp，含有pc的重组工程菌株rare(de3)/pet28a-p
c-vgfp，含有pg的重组工程菌株rare(de3)/pet28a-p
g-vgfp和含有ph的重组工程菌株rare(de3)/pet28a-p
h-vgfp对1mm肉桂醛无明显响应(见图4中的a)。即，pd，pe和pf是响应1mm肉桂醛的下调启动子。
[0191]
2)评估pd是否受体系内其他物质的干扰
[0192]
pd是最明显响应肉桂醛的下调启动子，验证pd是否受底物肉桂酸、副产物肉桂醇和产物肉桂胺的干扰，检测方法同步骤1)。菌株rare(de3)/pet28a-p
d-vgfp分别经3mm肉桂酸、1mm肉桂醇、3mm肉桂胺处理后，荧光强度没有明显变化(见图4中的b)，说明pd不受3mm肉桂酸、1mm肉桂醇、3mm肉桂胺的干扰。
[0193]
3)检测肉桂醛浓度与pd强度是否成正比
[0194]
接下来，检测肉桂醛浓度与pd强度是否成正比，检测方法同步骤1)。以gfp的荧光强度表征pd强度。结果显示，当肉桂醛浓度为0-1mm时，pd的强度与肉桂醛浓度成正比(见图4中的c)。
[0195]
综上所述，pd、pe和pf可以响应肉桂醛，其中pd的响应最明显，荧光强度为对照组荧光强度的12％；pd没有响应3mm肉桂酸、1mm肉桂醇、3mm肉桂胺，说明pd强度不受体系中肉桂酸、肉桂醇、肉桂胺的干扰；肉桂醛在0-1mm之间时，pd强度与肉桂醛浓度成正比，说明pd适合做响应肉桂醛的下调启动子，即，菌株rare(de3)/pet28a-p
d-vgfp适合做响应肉桂醛的生物传感器。
[0196]
本实施例所列数据均为多次重复试验的平均数值。
[0197]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种响应肉桂醛的下调启动子的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)用0mm和1mm肉桂醛分别处理e.colirare(de3)，获得2组菌株；2)转录组分析步骤1)获得的2组菌株rna水平的表达差异，挑出明显差异表达基因对应的启动子p
x
；3)将绿色荧光蛋白基因vgfp连接到pet28a载体上，得到重组质粒pet28a-vgfp；4)将重组质粒pet28a-vgfp上的t7启动子和laco序列替换成转录组分析后挑出的启动子p
x
得到重组质粒pet28a-p
x-vgfp，将重组质粒转化进e.colirare(de3)感受态，得到基因工程菌株rare(de3)/pet28a-p
x-vgfp；5)通过荧光强度检测p
x
是否响应肉桂醛。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)所述e.colirare(de3)为敲除醛酮还原酶基因和醇脱氢酶基因的大肠杆菌k-12mg1655；所述醛酮还原酶基因为dkgb基因、yeae基因和dkga基因；所述醇脱氢酶基因为yqhd基因、yahk基因和yjgb基因。3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)所述处理是指利用lb培养基于37℃，200rpm条件下摇瓶培养菌株e.colirare(de3)，当菌液od
600nm
达到0.5-0.7时，分别添加终浓度为0mm和1mm的肉桂醛进行处理，于1h和2.5h后分别收集菌体。4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)所述转录组分析为对1h和2.5h收集到的两组菌株进行转录组分析，分别找到1h和2.5h的差异基因取交集，然后找出log2foldchange小于-5的基因，所述基因上游前300bp为启动子p
x
。5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)所述绿色荧光蛋白基因vgfp的核苷酸序列如seq id no.9所示。6.一种由权利要求1-5任意一项所述筛选方法获得的响应肉桂醛的下调启动子p
d
，其特征在于，所述下调启动子p
d
为dna结合转录激活子gade对应基因的上游的前300bp序列，所述序列如seq id no.4所示。7.一种由权利要求1-5任意一项所述筛选方法获得的响应肉桂醛的下调启动子p
e
，其特征在于，所述下调启动子p
e
为周质酸应激分子伴侣hdea对应基因的上游前300bp序列，所述序列如seq id no.5所示。8.一种由权利要求1-5任意一项所述筛选方法获得的响应肉桂醛的下调启动子p
f
，其特征在于，所述下调启动子p
f
为nad依赖的二氢嘧啶脱氢酶亚基pret对应基因的上游前300bp序列，所述序列如seq id no.6所示。9.一种由权利要求1-5任意一项所述筛选方法获得的基因工程菌株rare(de3)/pet28a-p
d-vgfp，其特征在于，所述p
d
为dna结合转录激活子gade对应基因的上游前300bp序列，所述序列如seq id no.4所示。10.权利要求9所述的基因工程菌株在作为肉桂醛的生物传感器，用来筛选提高肉桂醛产量的酶或菌株，或检测环境中的肉桂醛中的应用。

技术总结
一种响应肉桂醛的下调启动子及其筛选方法应用，属于基因工程及发酵工程技术领域。本发明为了解决肉桂胺的生物合成过程中存在的毒性中间体(肉桂醛)积累的问题，筛选响应肉桂醛积累的启动子，获得了肉桂醛的下调启动子P


技术研发人员：刘炜 咸漠
受保护的技术使用者：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/9/23