用于检测阿尔兹海默症相关SNP位点的gRNA分型探针、标记引物、试剂盒及检测方法

用于检测阿尔兹海默症相关snp位点的grna分型探针、标记引物、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药的核酸检测和基因分型技术领域，具体地说，涉及一种从唾液中快速检测阿尔兹海默症相关snp位点的grna分型标记、标记引物、试剂盒及方法


背景技术：

2.阿尔兹海默症(alzheimer disease，ad)是一种神经退行性疾病，俗称老年痴呆，患者临床表现为记忆衰退、社交和认知功能障碍、行为异常等。65岁之后发病的ad被称为后发性ad，是最主要的ad类型，占所有ad病例的95％以上，因为其具有强烈的遗传性倾向，且目前尚未有治疗ad的有效手段，所以提前防控和相关基因检测具有重大意义。
3.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snps)是基因组水平上单个核苷酸变异，比如单碱基的转换、颠换、缺失或插入所造成的dna多态性。人类基因组上约有3x106个snps，其中某些位于基因或调控区域关键位点的snp对人体内代谢活动影响较大，进而引起疾病风险上升或下调。因此核酸检测和snp分型技术一直是科学界研究的热点，在风险预测、临床诊断、法医鉴定等领域的重要性也越来越明显。目前snp检测技术的发展主要呈现两个趋势：一种是操作复杂、低成本的实验室分子操作技术；另一种常用的高通量、自动化的snp分型技术，但成本和仪器费用较高，常用于测序或者检测公司。
4.因此，为了克服现有技术的壁垒，亟需一种检测时间短、操作便捷、准确性高、环保性好的技术来实现阿尔兹海默症相关snp的快速分型检测。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种用于检测分型阿尔兹海默症相关snp位点的引物组、应用、产品及方法。本发明利用crispr/cas13核酸检测技术对一系列与阿尔兹海默症疾病患病风险相关的重要单核苷酸多态性snp：rs671、rs7412、rs429358、rs7649121进行准确的分型，通过引入额外突变碱基的方法提高了分型区分度，利用rpa核酸恒温扩增技术代替pcr，完成前期靶标分子扩增，简化了操作流程并提高了检测灵敏度。
6.本发明涉及了额外碱基突变引入的最适位置和类型，对收集的唾液进行简单的热处理后即可直接进行检测操作，唾液基因组可以在单管中同时完成扩增、转录和检测三个反应，减少了操作中污染。
7.本发明的第一方面，提供了一种用于检测阿尔兹海默症相关snp位点的grna分型探针，所述snp位点包括rs671、rs7412、rs429358以及rs7649121；
8.其中，所述rs671位点grna分型探针的序列如seq id no：1和seq id no：2所示；
9.ggcttcacttttgacactcacaccctggac(seq id no：1)
10.ggtttcacttttgacactcacaccctggac(seq id no：2)
11.所述rs7412位点grna分型探针的序列如seq id no：3和seq id no：4所示；
12.tagcggaccgtcacatggtccggccccggg(seq id no：3)
13.taacggaccgtcacatggtccggccccggg(seq id no：4)
14.所述rs429358位点grna分型探针的序列如seq id no：5和seq id no：6所示；
15.atacgccggcggaccacgtcatggcgccgc(seq id no：5)
16.atgcgccggcggaccacgtcatggcgccgc(seq id no：6)
17.所述rs7649121位点grna分型探针的序列如seq id no：7和seq id no：8所示；
18.tctcccatcatatcttggggtccattaccc(seq id no：7)
19.tcacccatcatatcttggggtccattaccc(seq id no：8)。
20.进一步的，所述rs671位点grna分型标记的区分度为6.25，rs7412位点grna分型标记的区分度为4.80，rs429358位点grna分型标记的区分度为3.17，rs7412位点grna分型标记的区分度为6.85。
21.本发明的第二方面，提供了上述用于检测阿尔兹海默症相关snp位点的靶标扩增引物，所述snp位点包括rs671、rs7412、rs429358以及rs7649121；
22.所述rs671位点grna的靶标扩增引物序列如seq id no：9和seq id no：10所示；
23.f：ctgctatgatgtgtttggagcccagtcaccc(seq id no：9)；
24.r：gaaattaatacgactcactataggg cctgagtccccggcaggtcctgaacctctgg(seq id no：10)；
25.所述rs7412位点grna的靶标扩增引物序列如seq id no：11和seq id no：12所示；f：cggaactggaggaacaactgaccccggtggc(seq id no：11)；
26.r：gaaattaatacgactcactataggg aggcgctcgcggatggcgctgaggccgcgc(seq id no：12)；
27.所述rs429358位点grna的靶标扩增引物的序列如seq id no：13和seq id no：14所示；
28.f：gctgtccaaggagctgcaggcggcgcaggc(seq id no：13)；
29.r：gaaattaatacgactcactataggg cggtgctctggccgagcatggcctgcacct(seq id no：14)；
30.所述rs7649121位点grna的靶标扩增引物的序列如seq id no：15和seq id no：16所示；
31.f：gataaagatgaaagatgagttggatgtgcc(seq id no：15)；
32.r：gaaattaatacgactcactataggg tctggaatcccactcctatgccccaattacc(seq id no：16)。
33.本发明第三方面，提供了上述用于检测阿尔兹海默症相关snp位点的试剂盒，包括：grna分型探针、靶标扩增引物、rna报告分子，以及反应缓冲液。
34.本发明第四方面，提供了上述阿尔兹海默症相关snp位点的分型检测方法，包括：
35.1)从唾液中热提人类基因组
36.利用热提法简易提取唾液细胞中的人类基因组dna，提取过程不超过10min；
37.2)扩增待检测靶标分子
38.以步骤1)热提法的基因组为模板，利用pcr或者raa恒温扩增含有目的snp位点的靶标dna分子，使用的反向扩增引物5’端带有t7转录序列；
39.3)t7体外转录扩增后靶标分子
40.将扩增后的靶标dna分子直接加入到t7体外转录反应体系中，扩增产物和体外转录产物均直接进入下一步，无需进行纯化回收处理；
41.4)cas13检测snp反应
42.将转录后的靶标rna、grna、cas13蛋白、rna报告分子信标加入cas13反应体系中，利用荧光显示仪观察使用不同grna介导的荧光强度差异，确定强荧光信号下使用的grna种类进而确定snp类型。
43.进一步的，所述步骤2)中，扩增所用的引物序列如下：
44.rs671位点，扩增引物的序列如seq id no：9和seq id no：10所示；
45.f：ctgctatgatgtgtttggagcccagtcaccc(seq id no：9)；
46.r：gaaattaatacgactcactataggg cctgagtccccggcaggtcctgaacctctgg(seq id no：10)；
47.rs7412位点，扩增引物的序列如seq id no：11和seq id no：12所示；
48.f：cggaactggaggaacaactgaccccggtggc(seq id no：11)；
49.r：gaaattaatacgactcactataggg aggcgctcgcggatggcgctgaggccgcgc(seq id no：12)；
50.rs429358位点，扩增引物的序列如seq id no：13和seq id no：14所示；
51.f：gctgtccaaggagctgcaggcggcgcaggc(seq id no：13)；
52.r：gaaattaatacgactcactataggg cggtgctctggccgagcatggcctgcacct(seq id no：14)；
53.rs7649121位点，扩增引物的序列如seq id no：15和seq id no：16所示；
54.f：gataaagatgaaagatgagttggatgtgcc(seq id no：15)；
55.r：gaaattaatacgactcactataggg tctggaatcccactcctatgccccaattacc(seq id no：16)。
56.进一步的，所述步骤2)中，利用raa恒温扩增反应体系，包括：raa干粉1管(奇天基因试剂盒)、mix buffer缓冲体系29.4μl、扩增引物0.4μm、基因组模板10pm、乙酸镁2μl，总体积50ul；恒温扩增反应时间30-45min，反应温度42℃。
57.进一步的，所述mix buffer缓冲体系，包括：tris-hcl 30mm，mgcl2 4mm，nacl 20mm，dtt 1mm，ph＝7.5。
58.进一步的，所述步骤3)中，t7体外转录反应体系，包括：t7 rna聚合酶50u、rntps 5mm、rri 20u，总体积20ul；转录反应时间30-45min，反应温度37℃。
59.进一步的，所述步骤4)中，cas13反应体系，包括：lwacas13蛋白75nm、5x mix buffer4μl、grna 0.6nm、rna报告分子100nm，总体积20ul；cas13反应时间18-20min，反应温度37℃。
60.进一步的，所述步骤4)中rna报告分子信标的序列为5
’‑
fam-rururururu-bhq-3’。
61.根据ncbi上的信息为snp所有分型设计grna，grna和靶标分子的杂交配对区长度为30nt，将snp位点的分型标记设计在配对区3’端的第3个核苷酸处。grna的引物设计和引入额外突变类型如表1，检出最适合突变类型。
62.表1grna-n30序列和分型区分度
[0063][0064][0065]
注：斜体标记是检测snp的分型标记，小写标记是额外引入突变
[0066]
本发明对ad患病风险相关的4个snps位点：rs671、rs7412、rs429358、rs7649121进行了准确的分型，通过结合重组酶介导的核酸扩增技术(recombinase aided amplification，raa)、t7体外转录反应和crispr/cas13的特异性识别核酸错配能力，能够实现对相应snps的准确分型，兼具有操作简便、结果准确、灵敏度高和低成本的优点，为前期快速诊断ad患病风险提供可能性。
[0067]
本发明中，选取了4个与迟发性ad患病风险相关的snps。氧化应激是ad发病的重要因素之一，乙醛脱氢酶-2(aldh2)是酒精代谢过程中的关键酶，同时参与酒精代谢产物乙醛和心肌代谢中4-羟基-2-壬烯酸(4-hne)的氧化过程。rs671是位于aldh2第12个外显子的1510位碱基发生的t
→
c突变，造成了翻译中谷氨酸
→
赖氨酸的突变改变了酶构型，从而降低了aldh2反应活性。有研究表明低活性的aldh2会造成有毒醛4-hne积累，引起细胞死亡和氧化应激，所以rs671可能是ad的易感基因多态性。rs7649121位于脂联素基因adipoq上，被认为是迟发性ad的独立危险因素，at/aa基因型的患病风险是tt基因型的1.75倍。
[0068]
rs7412和rs429358这两个位点决定了载脂蛋白e编码基因apoe的分型如表1，其中ε4是最常见的ad遗传风险因素，存在于50％以上的迟发性ad患者基因组中。有研究表明apoe基因可以影响ad患者中大脑β-淀粉斑块、tau蛋白和tdp43蛋白表达水平以及大脑正常功能。其中ε4/ε4组成的apoe4基因型将会提高9-15倍的ad患病风险。
[0069]
cas13是ii型crispr系统的经典cas蛋白之一，包含2个hepn核糖核酸酶结构域和1个核糖核酸识别结构域。cas13能在一条人工设计的ssrna(guide rna，grna)的向导下特异性识别靶标分子，grna总长91nt，其中包括25nt的t7启动子、36nt的grna骨架和30nt的检测区(n30)。n30一般设计成与待检测靶标(含有snp)互补配对的序列，当grna-靶标分子核酸杂交后，grna骨架能够与cas13蛋白形成复合物，改变hepn结构域构型，从而不可逆的激发出cas13的特异性水解靶标分子活性和非特异性rna水解活性，即cas13会无差别的水解体系中的rna报告分子将荧光信号释放，利用简单的荧光分析仪即可检测出荧光信号。
[0070]
当grna的scaffold与lwacas13作用形成复合物，n30区域与靶标分子进行核酸杂
交配对，一旦配对成功cas13蛋白结构发生不可逆改变，激发核酸酶水解活性，将体系中的rna荧光报告基团水解，释放荧光信号。若grna-靶标分子的配对存在错配区，则cas13酶活性可能会受到影响，仅有部分荧光报告基团被水解，荧光信号减弱。
[0071]
cas13蛋白仅在grna-靶标分子rna完全杂交后显现核酸酶活性，且已有实验证实如果二元复合物中仅存在单碱基错配几乎不影响酶活性，所以为了实现利用cas13检测snp的可能，需要在人工设计的grna中引入一个额外错配来达到放大区分度的目的。同时，为了使得整个检测流程更加简便快捷，也需要降低样本的处理难度，理想状态下可以直接对原始样本(如唾液、尿液和血液等)进行分型。
[0072]
rna荧光报告分子(rna reporter)是核酸检测和snp分型的常用工具，一般情况下报告分子一端为荧光标记基团，另一端为淬灭标记基团，由于两种标记距离足够靠近发生能量共振作用，荧光基团产生的光子被淬灭基团淬灭而不能检测到荧光。当报告分子内部核酸被切开，淬灭基团和荧光基团分离而不能发生淬灭作用，荧光基团产生的荧光信号能够被荧光仪器检测到。在各类核酸检测方法中，rna荧光报告分子常被用于检测体系内核酸水解酶的存在，任何具有非特异性水解核酸活性的蛋白都能激活报告分子，不能用于特异性核酸检测。但在本发明中，通过将rna报告分子与一种兼具有特异性和非特异性水解能力的cas13蛋白结合使用，可以特异性检测人类基因组中的snp。
[0073]
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0074]
(1)确定了4个与ad疾病相关snps的grna序列类型和额外引入突变位点，提高了snp分型的区分度；
[0075]
(2)对唾液进行简单的热处理即可用于后续检测反应，且过程中无需任何产物回收处理，使snp分型过程更为简便快捷；
[0076]
(3)唾液样本可以在一管、45min内完成扩增、转录和cas13的检测，并优化了相关反应体系，避免了操作过程中移液造成的污染。
[0077]
本发明利用具有高特异性、高灵敏度的cas13作为核酸检测的核心蛋白，对grna的设计进行了改造和优化，扩大了snp分型的区分度和准确性；同时通过优化反应条件，达到直接对唾液进行snp检测的目的。利用这种检测方法测试了4种ad相关snps，可以简便、快速、低廉的对唾液样本的碱基分型并估计迟发性ad患病风险，为重要遗传病的分子检测提供新思路。
附图说明
[0078]
图1为本发明的基于crispr/cas13系统检测snp的基本原理图；
[0079]
图2为四个snp位点引入突变后荧光强度；其中，a.rs671引入突变后荧光强度；b.rs7412引入突变后荧光强度；c.rs429358引入突变后荧光强度；d.rs7649121引入突变后荧光强度；
[0080]
图3为rs671不同额外突变类型的区分度；
[0081]
图4为ad相关snps的分型结果；
[0082]
图5为本发明的一管法检测rs671结果曲线；
[0083]
图6为实施例6患者a的ad相关snps的分型检测结果。
具体实施方式
[0084]
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但下列实施例不应看作对本发明的限制。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0085]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0086]
如图1所示，首先设计一段ssrna荧光报告分子信标，序列为5
’‑
fam-rururururu-bhq-3’，一般情况下该分子信标荧光基团fam与淬灭基团bhq距离临近而不显示荧光信号，当cas13蛋白的非特异性核酸酶活性被激活后，ru序列中发生的任意断裂都能分离两种基团将荧光信号放出。
[0087]
然而实验结果表明靶标-grna配对区域的单碱基差异显示的荧光信号无法明显分型snp，为了提高本技术的区分度，通过引入额外突变的手段提高区分效果。
[0088]
实施例1:阿尔兹海默症rs671 snp位点的分型检测
[0089]
第一步，简易提取唾液中人类基因组。取实验人员1ml唾液样品于1.5ml ep管中，离心浓缩后在100℃水浴锅中反应5min，再次离心后收集上清液作为人类基因组dna模板，该过程不超过10min。
[0090]
第二步，grna设计。grna由t7启动子-grna骨架区-n30靶标配对区三部分组成，总长度为91nt，检测snp的分型标记一般位于n30右端的第3位，具体序列为：5
’‑
gaaattaatacgactcactataggg-gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaac-n30-3’[0091]
rs671在基因组中有t、c两种碱基类型，所以针对每个额外突变都需要设计一对grna分别作为t基因型和c基因型的分型标记，其仅在待检测的位点处有差异。在grna右端10nt区域内引入额外突变后，grna-靶标会因为出现连续错配和多个碱基不匹配而造成cas13酶活性差异放大，从而提高分型的区分度。
[0092]
因每条grna仅存在30nt差异而其余61nt都是保守的，所以设计一条统一的grna-cf引物，n30区域设计为grna-r端，grna经过pcr扩增、转录、rna纯化回收后分管保存。
[0093]
在预实验中缩小了额外突变的设计范围，具体设计序列如表2.根据实验结果最终选择rs671-a2g-u和rs671-a2g-c这2条引物分别作为rs671的2条分型探针的反向扩增引物(正向是通用引物sgrna-cf如seq id no：17所示)。
[0094]
表2rs671-grna额外突变引入引物设计
[0095]
[0096][0097]
注：斜体标记是snp位点，小写标记是额外引入错配位点，灰色标记是grna骨架区部分序列
[0098]
第三步，raa扩增靶标分子和体外转录。根据待检测snp位点设计扩增引物，snp位点尽量位于扩增出的靶标分子中间，扩增长度在100-300bp。需要在反向扩增引物5’端添加25nt长度的t7启动子(表中黑色小写)，扩增出的靶标分子反义链带有t7启动序列，本实验中rs671snp位点的具体扩增引物序列如表3所示。
[0099]
表3 rs671的扩增引物
[0100][0101][0102]
第四步，体外转录。以第1步热提法的基因组为模板加入raa扩增试剂盒(江苏奇天
基因生物科技有限公司)进行42℃30min恒温反应，取2ul扩增产物直接加入到t7体外转录体系37℃反应20min后即可进行cas13检测反应。
[0103]
第五步，cas13检测snp反应。利用带有不同额外突变和分型标记的grna进行rs671分型检测，本实验中使用的靶标snp类型为cc纯合子，其荧光信号如图2所示。
[0104]
由图2结果可以看出如果不在grna上引入额外突变(none)，两条grna(即第3位snp的分型标记分别为t和c)都表现出非常强的荧光信号，这说明单碱基差异都能激活lwacas13的核酸酶活性，对rs671基因型为cc个体的靶标显示相似的切割能力而无法进行准确分型。而在grna上引入额外突变后，两类检测体系都出现了不同程度的荧光损失，相较于正确的体系(c)，错配的体系(t)损失程度更大。因此将图2中引入额外突变后一对grna(c、t)所检测到的净荧光信号强度比值(c:t ratio)作为cas13对rs671位点的分型区分度，即在检测rs671的cc个体时，正确分型标记(c)和错配分型标记(t)荧光的比值大小如图3。
[0105]
在不引入额外突变的none组中，ct比值接近1，表明仅单碱基差异无法确切区分靶标snp类型。其中发生在snp相邻的a2g和t4g突变引入大大增加了cas13对rs671的分型能力，cc的荧光强度是tt的30倍以上，表明这两个突变使得cas13区分能力大幅度增强(如图4)。但是t4g突变在图3中荧光强度偏低，即使区分度更高，但是荧光损失过大，降低了检测灵敏度，所以选取a2g作为rs671的最适额外引入突变。
[0106]
实施例2:阿尔兹海默症rs7412 snp位点的分型检测
[0107]
第一步，简易提取唾液中人类基因组。取实验人员1ml唾液样品于1.5ml ep管中，离心浓缩后在100℃水浴锅中反应5min，再次离心后收集上清液作为人类基因组dna模板，该过程不超过10min。
[0108]
第二步，grna设计。设计原则与实施例1一致。在预实验中缩小了额外突变的设计范围，具体设计序列如表4.根据实验结果最终选择rs7412-c2a-g和rs7412-c2a-a这2条引物分别作为rs7412的2条分型探针的反向扩增引物(正向是通用引物sgrna-cf)。
[0109]
表4 rs7412-grna额外突变引入引物设计
[0110][0111]
注：斜体标记是snp位点，小写标记是额外引入错配位点
[0112]
第三步，raa扩增靶标分子和体外转录。根据待检测snp位点设计扩增引物，snp位点尽量位于扩增出的靶标分子中间，扩增长度在100-300bp。需要在反向扩增引物5’端添加25nt长度的t7启动子(表中黑色小写)，扩增出的靶标分子反义链带有t7启动序列，本实验中具体扩增引物序列如表5所示。
[0113]
表5 rs7412的扩增引物
[0114][0115]
第四步，体外转录。以第1步热提法的基因组为模板加入raa扩增试剂盒(江苏奇天基因生物科技有限公司)进行42℃30min恒温反应，取2ul扩增产物直接加入到t7体外转录体系37℃反应20min后即可进行cas13检测反应。
[0116]
第五步，cas13检测snp反应。利用第二步筛选出的一对分型探针进行rs7412分型检测，其结果如图4所示。
[0117]
实施例3:阿尔兹海默症rs429358snp位点的分型检测
[0118]
第一步，简易提取唾液中人类基因组。取实验人员1ml唾液样品于1.5ml ep管中，离心浓缩后在100℃水浴锅中反应5min，再次离心后收集上清液作为人类基因组dna模板，该过程不超过10min。
[0119]
第二步，grna设计。设计原则与实施例1一致。在预实验中缩小了额外突变的设计
范围，具体设计序列如表6.根据实验结果最终选择rs429358-c2t-a和rs429358-c2t-g这2条引物分别作为rs429358的2条分型探针的反向扩增引物(正向是通用引物sgrna-cf)。
[0120]
表6 rs429358-grna额外突变引入引物设计
[0121][0122]
注：斜体标记是snp位点，小写标记是额外引入错配位点
[0123]
第三步，raa扩增靶标分子和体外转录。根据待检测snp位点设计扩增引物，snp位点尽量位于扩增出的靶标分子中间，扩增长度在100-300bp。需要在反向扩增引物5’端添加25nt长度的t7启动子(表中黑色小写)，扩增出的靶标分子反义链带有t7启动序列，本实验中具体扩增引物序列如表7所示。
[0124]
表7 rs429358的扩增引物
[0125][0126][0127]
第四步，体外转录。以第1步热提法的基因组为模板加入raa扩增试剂盒(江苏奇天基因生物科技有限公司)进行42℃30min恒温反应，取2ul扩增产物直接加入到t7体外转录体系37℃反应20min后即可进行cas13检测反应。
[0128]
第五步，cas13检测snp反应。利用第二步筛选出的一对分型探针进行rs429358分型检测，其结果如图4所示。
[0129]
实施例4:阿尔兹海默症rs7649121 snp位点的分型检测
[0130]
第一步，简易提取唾液中人类基因组。取实验人员1ml唾液样品于1.5ml ep管中，
离心浓缩后在100℃水浴锅中反应5min，再次离心后收集上清液作为人类基因组dna模板，该过程不超过10min。
[0131]
第二步，grna设计。设计原则与实施例1一致。在预实验中缩小了额外突变的设计范围，具体设计序列如表8.根据实验结果最终选择rs7649121-t和rs7649121-a这2条引物分别作为rs7649121的2条分型探针的反向扩增引物(正向是通用引物sgrna-cf)。
[0132]
表8 rs7649121-grna额外突变引入引物设计
[0133][0134]
注：斜体标记是snp位点，小写标记是额外引入错配位点
[0135]
第三步，raa扩增靶标分子和体外转录。根据待检测snp位点设计扩增引物，snp位点尽量位于扩增出的靶标分子中间，扩增长度在100-300bp。需要在反向扩增引物5’端添加25nt长度的t7启动子(表中黑色小写)，扩增出的靶标分子反义链带有t7启动序列，本实验中具体扩增引物序列如表9所示。
[0136]
表9 rs7649121的扩增引物
[0137][0138]
第四步，体外转录。以第1步热提法的基因组为模板加入raa扩增试剂盒(江苏奇天基因生物科技有限公司)进行42℃30min恒温反应，取2ul扩增产物直接加入到t7体外转录体系37℃反应20min后即可进行cas13检测反应。
[0139]
第五步，cas13检测snp反应。利用第二步筛选出的一对分型探针进行rs7649121分型检测，其结果如图4所示。
[0140]
实施例5：一管法检测rs671位点
[0141]
本发明采用的一管法(one spot test)检测snp。将raa扩增、t7转录体系和lwacas13检测体系并于一管反应，即可简化实验操作又可避免液体转移过程中的污染。
[0142]
具体检测操作如下：
[0143]
1)从唾液中热提人类基因组
[0144]
利用热提法简易提取唾液细胞中的人类基因组dna，提取过程不超过10min；
[0145]
2)扩增待检测靶标分子
[0146]
以步骤1)热提法的基因组为模板，利用pcr或者raa恒温扩增含有目的snp位点的靶标dna分子，使用的反向扩增引物5’端带有t7转录序列；
[0147]
3)t7体外转录扩增后靶标分子
[0148]
将扩增后的靶标dna分子直接加入到t7体外转录反应体系中，扩增产物和体外转录产物均直接进入下一步，无需进行纯化回收处理；
[0149]
4)cas13检测snp反应
[0150]
将转录后的靶标rna、grna、cas13蛋白、rna报告分子信标加入cas13反应体系中，利用荧光显示仪观察使用不同grna介导的荧光强度差异，确定强荧光信号下使用的grna种类进而确定snp类型。
[0151]
上述反应中，各组分浓度如表10，反应条件为42℃，总反应时间78min，每2min在荧光显示器中采集一次荧光。
[0152]
表10一管分型反应体系
[0153][0154]
其中，mix buffer缓冲体系，包括：tris-hcl 30mm，mgcl2 4mm，nacl 20mm，dtt 1mm，ph＝7.5。
[0155]
利用优化后体系检测rs671结果如图5，分步操作法耗时raa反应30min+转录30min+cas13反应18min总计78min，一管法可以在45min内完成对简提基因组的snp分型反应，在时间成本、操作流程、污染控制上都优于分步多管操作，其检测灵敏度约为10pm。注意：前期检测额外突变、优化缓冲液等结果都是20ul体积；而在一管法操作中因为需要合并入不同的反应体系，所以其荧光反应总体积为50ul，阳性对照(pos)显示的荧光信号强度会高于前面。
[0156]
实施例6：患者a阿尔兹海默症风险筛查检测
[0157]
对患者a的唾液样本进行检测，取患者a1ml唾液样品于1.5ml ep管中，离心浓缩后在100℃水浴锅中反应5min，再次离心后收集上清液作为人类基因组dna模板。将模板等量加入8个检测管中，每个检测管标记对应的snp位点和碱基类型(共4个snp位点，每个位点有两种碱基多态性，共计8个检测管)。参照实施例5的检测方法进行检测，反应结束后利用荧光显示仪观测荧光信号。
[0158]
如图6所示，根据荧光结果确定样本患者a的4个snp位点的基因型为rs671 c:c,rs7412a:a,rs7649121t:t,rs429358a:a后，根据以下说明表确定患者a的ad患病风险。其中rs429358和rs7412对ad患病风险的检测最为重要，两个位点的共同作用能精确分型apoe基因，ad的患病风险与apoe4等位基因的相关性最高。rs7649121和rs671是ad的独立风险因素，单独调控ad的患病风险，其易感基因都是t。图6所示的基因型表明样本a在rs429358和rs7412两个位点处显示apoe2基因型，患有较低ad风险，在rs671和rs7649121位点处为正常风险，总体而言样本a的ad患病风险较低。
[0159]
表11rs429358、rs7412与ad患病风险
[0160][0161]
表12rs671、rs7649121与ad患病风险
[0162][0163]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。
[0164]
[0165]
[0166]
[0167]

技术特征：
1.一种用于检测阿尔兹海默症相关snp位点的grna分型探针，所述snp位点包括rs671、rs7412、rs429358以及rs7649121；其中，所述rs671位点grna分型探针的序列如seq id no：1和seq id no：2所示；所述rs7412位点grna分型探针的序列如seq id no：3和seq id no：4所示；所述rs429358位点grna分型探针的序列如seq id no：5和seq id no：6所示；所述rs7649121位点grna分型探针的序列如seq id no：7和seq id no：8所示。2.根据权利要求1所述的grna分型探针，其特征在于：所述rs671位点grna分型标记的区分度为6.25，rs7412位点grna分型标记的区分度为4.80，rs429358位点grna分型标记的区分度为3.17，rs7412位点grna分型标记的区分度为6.85。3.一种用于检测阿尔兹海默症相关snp位点的靶标扩增引物，所述snp位点包括rs671、rs7412、rs429358以及rs7649121；所述rs671位点grna的靶标扩增引物序列如seq id no：9和seq id no：10所示；所述rs7412位点grna的靶标扩增引物序列如seq id no：11和seq id no：12所示；所述rs429358位点grna的靶标扩增引物的序列如seq id no：13和seq id no：14所示；所述rs7649121位点grna的靶标扩增引物的序列如seq id no：15和seq id no：16所示。4.一种用于检测阿尔兹海默症相关snp位点的试剂盒，包含如权利要求1所述的grna分型探针和权利要求3所述的靶标扩增引物。5.一种阿尔兹海默症相关snp位点的分型检测方法，包括：1)从唾液中热提人类基因组利用热提法简易提取唾液细胞中的人类基因组dna，提取过程不超过10min；2)扩增待检测靶标分子以步骤1)热提法的基因组为模板，利用pcr或者raa恒温扩增含有目的snp位点的靶标dna分子，使用的反向扩增引物5’端带有t7转录序列；3)t7体外转录扩增后靶标分子将扩增后的靶标dna分子直接加入到t7体外转录反应体系中，扩增产物和体外转录产物均直接进入下一步，无需进行纯化回收处理；4)cas13检测snp反应将转录后的靶标rna、grna、cas13蛋白、rna报告分子信标加入cas13反应体系中，利用荧光显示仪观察使用不同grna介导的荧光强度差异，确定强荧光信号下使用的grna种类进而确定snp类型。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤2)中，扩增所用的引物序列如下：所述rs671位点grna的靶标扩增引物序列如seq id no：9和seq id no：10所示；所述rs7412位点grna的靶标扩增引物序列如seq id no：11和seq id no：12所示；所述rs429358位点grna的靶标扩增引物的序列如seq id no：13和seq id no：14所示；所述rs7649121位点grna的靶标扩增引物的序列如seq id no：15和seq id no：16所示。7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤2)中，利用raa恒温扩增反应
体系，包括：raa干粉1管(奇天基因试剂盒)、mix buffer缓冲体系29.4μl、扩增引物0.4μm、基因组模板10pm、乙酸镁2μl，总体积50ul；恒温扩增反应时间30-45min，反应温度42℃。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述mix buffer缓冲体系，包括：tris-hcl30mm，mgcl2 4mm，nacl 20mm，dtt 1mm，ph＝7.5。9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤3)中，t7体外转录反应体系，包括：t7 rna聚合酶50u、rntps 5mm、rri 20u，总体积20ul；转录反应时间30-45min，反应温度37℃。10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤4)中，cas13反应体系，包括：lwacas13蛋白75nm、5x mix buffer 4μl、grna 0.6nm、rna报告分子100nm，总体积20ul；cas13反应时间18-20min，反应温度37℃。11.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤4)中rna报告分子信标的序列为5
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fam-rururururu-bhq-3’。

技术总结
本发明涉及一种用于检测阿尔兹海默症相关SNP位点的gRNA分型探针、标记引物、试剂盒及检测方法。该SNP位点包括rs671、rs7412、rs429358以及rs7649121；每个位点对应的gRNA分型探针分型探针序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8所示；以及每个位点gRNA的靶标扩增引物序列如SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：16所示。本发明利用CRISPR/Cas13核酸检测技术对一系列与阿尔兹海默症疾病患病风险相关的重要单核苷酸多态性SNP：rs671、rs7412、rs429358、rs7649121进行准确的分型，通过引入额外突变碱基的方法提高了分型区分度，利用RPA核酸恒温扩增技术代替PCR，完成前期靶标分子扩增，简化了操作流程并提高了检测灵敏度。并提高了检测灵敏度。并提高了检测灵敏度。


技术研发人员：刘喜朋 雷瑞
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/23