一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置

1.本发明属于免疫分析材料技术领域，涉及一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置。


背景技术：

2.异相免疫反应是将抗体(或抗原)固定在固相载体表面，抗原(或抗体)通过特异性免疫反应与之结合，经洗涤操作可实现抗原抗体复合物与游离的抗原、抗体之间的分离。同时，当目标分子(目标分子是指需要检测的物质，比如核酸、传染病毒、细菌、心脏标记物、毒品以及蛋白质和小分子化合物等)被抗体或其它识别试剂捕获后，会在固相载体上发生可测的颜色信号变化，这主要通过酶与底物的显色反应或者识别元件的凝聚来实现。基于这种显色机理的检测方法包括：胶体金侧流免疫层析、光度酶联免疫分析(elisa)、荧光免疫分析，异相免疫分析能够将抗原从稀溶液中富集至固相载体表面，与抗原抗体同在液相反应的均相免疫分析相比，异相免疫分析展现出了更高的灵敏度。
3.以往的异相免疫分析中所使用的固相载体大多为：聚苯乙烯微孔板、纤维素纤维滤纸以及硝化纤维素(nc)膜等。
4.以聚苯乙烯微孔板作为固相载体时，生物试剂的用量约为30～50μl/孔/次，检测过程耗时(为保证溶液中的蛋白质充分扩散，生物分子的孵育和封闭时间大约是1h，整个检测过程通常需要3h以上)，同时还需要配备价格不菲的酶标仪作为信号分析设备。
5.纤维素纤维滤纸作为固相载体，则需要繁琐的预处理步骤，首先在滤纸上打造疏水隔离带，以控制待测溶液按照需要的方向在限定区域内流动，进而再将生物试剂修饰在亲水区域中。然而，在纸基载体表面修饰抗体(抗原)时主要依靠非特异性吸附，即通过非晶形纤维素和半纤维素在水中溶胀并微弱电离产生的负电荷来与正电性微粒结合。在这种情况下，中性或负电性微粒难以被稳定吸附，其他结合力较弱的分子也很容易在洗涤过程中损失，使得纸基免疫分析的检测限和灵敏度逊于传统聚苯乙烯微孔板。而且由于纤维素滤纸对抗原、抗体和封闭试剂(牛血清蛋白)等不同蛋白质的结合能力没有显著差别，导致测定时封闭效果不够理想，检测背景信号较高，信噪比低。
6.nc膜生产工艺复杂且极易引发火灾风险，所制备的nc膜透光性弱、力学性能差、比表面积低、孔径大小不均匀一，影响了生物分子在其上分布的均一性以及目标分子的可及性(nc膜上的结合位点无法暴露出来，使得多数生物分子无法与目标分子结合)，造成了检测结果普遍存在灵敏度低、信号波动大和背景信号高等缺点。
7.相较于传统固相载体材料，静电纺纳米纤维膜具有制备工艺简单、原料范围广、易于功能化修饰的优点，尤其是具有更高的孔隙率(可达80％及以上)，可调的孔径大小及分布，更大的比表面积，较聚苯乙烯微孔板提升了3个数量级，理论上可以固定更多的捕获分子，增大目标分子与载体的反应机率从而提升灵敏度，因而已有研究尝试将纳米纤维作为固相载体用于侧流免疫层析试纸。例如，文献1(anal bioanal chem 2014,406,3297-3304)基于聚乳酸/聚乙二醇纳米纤维开发的侧流层析试纸取得了与nc膜相当的大肠杆菌检测效
果。文献2(microchimica acta,2020,187,644.)以硝化纤维素纳米纤维膜作为固相载体，构建了一种用于人绒毛膜促性腺激素的侧流免疫层析试纸，检出限为10miu/ml，是市售试纸的2.5倍。然而，前期研究也表明了以纳米纤维膜为固相载体时，检测体系的灵敏度并没有表现出高比表面积所应带来的提升效应，与传统载体相比并无显著性优势。
8.因此，研究一种检测限、检测灵敏度以及检测准确性均显著提升的异相免疫分析装置具有十分重要的意义。


技术实现要素：

9.为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置；
10.为达到上述目的，本发明采用的方案如下：
11.一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，包括正交取向型纳米纤维膜、微量注射泵、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器；
12.无菌螺口注射器与微量分析换膜过滤器通过螺纹连接阀相连；微量分析换膜过滤器中具有两个o型环硅胶密封圈组成的夹具，将正交取向型纳米纤维膜夹持于其中，从而密封正交取向型纳米纤维膜的周边，允许液体流过膜而不会泄露；正交取向型纳米纤维膜孔径结构均匀，需要在膜的上下表面加有o型环硅胶密封圈以保持液体通道密封，再通过无菌螺口注射器精确控制纳米纤维膜孔道的流速使免疫反应更充分稳定，从而实现高灵敏度检测；由正交取向型纳米纤维膜、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器构成的组件组装到微量注射泵上，以控制流速推动液体通过膜；正交取向型纳米纤维膜的形状为圆形，o型环硅胶密封圈外径与正交取向型纳米纤维膜的直径相等；
13.正交取向型纳米纤维膜为经官能化处理的正交取向型纳米纤维膜，正交取向型纳米纤维膜上的官能团能共价偶联蛋白分子；
14.正交取向型纳米纤维膜由多层纤维构成，每层中的所有纤维取向排列，任意相邻两层中纤维的排列方向相互垂直。
15.作为优选的技术方案：
16.如上所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为100～300层，每层纤维的单向取向参数s＞0.97(s＝2cos2θ-1，θ为单向排列纳米纤维间的角度，若平行排列则θ为0，单向取向参数为1)(separation and purification technology,2021,260,118246)。
17.如上所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，正交取向型纳米纤维膜为直径13～25mm的圆形膜；正交取向型纳米纤维膜的厚度为0.1～0.3μm，平均孔径为0.5～4μm，孔隙率＞90％，通孔率＞80％。
18.如上所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，正交取向型纳米纤维膜上的官能团为羧基、醛基、氨基、磺酸基、仲胺基、叔胺基、nhs酯基、马来酰亚胺基、碳二亚胺基、亚氨酸酯基。
19.如上所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，正交取向型纳米纤维膜是将纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理得到，接收方法为高速滚筒接收、辅助电极接收或附加磁场接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，
第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积。
20.如上所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，纺丝液是将聚合物溶解到溶剂中获得的均相溶液，聚合物为聚偏氟乙烯、聚(乙烯醇-co-乙烯)、聚碳酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚乳酸、尼龙6、聚环氧乙烷、聚丙烯腈、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯胺、聚氨基甲酸酯、聚羟基丁酸酯、聚己内酯、聚醚砜、壳聚糖、胶原和纤维素的一种以上，溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、六氟异丙醇、四乙二醇、三乙二醇、甲酸、乙酸、苯酚、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲基正丙酮、二异丙酮、二异丁酮、丙酮、六氟丙酮、氯甲烷、氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、对氯甲苯、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、二氯丙烷、三氯甲烷、三氯乙烷、二溴乙烷、二溴丙烷、溴甲烷、溴乙烷、溴丙烷、醋酸、苯、甲苯、己烷、环己烷、环己酮、环戊烷、邻二甲苯、对二甲苯、乙腈、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、吡啶和水的一种以上。
21.如上所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，纺丝液的浓度为5～30wt％。
22.如上所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压8～30kv，纺丝液流速0.5～5ml/h，湿度30～70％，温度25～40℃，喷丝头与接收装置的距离5～30cm，接收速度1000～3000rpm。
23.如上所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，每层纤维的沉积时间为2～5min。
24.如上所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，正交取向型纳米纤维膜上固载有可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质，固载区域为一个以上圆点或条带状，圆点或条带状的具体数量可根据待测目标数量灵活选择和排布。将第一识别物质固定在纳米纤维膜上的方法可根据纳米纤维所选用高聚物材料适宜选择，可通过官能团间的化学结合，生物素与亲和素偶联结合，疏水作用力结合，但不限定于这些形式，具体固定方法可被本领域的技术人员适当选择。
25.如上所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，现有的异相免疫分析技术包括侧流层析免疫分析和斑点金免疫分析，在衡量免疫分析技术时常用的指标包括检出限、灵敏度、特异性、假阳性率和假阴性率。采用所述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析，检测限为0.1～100ng/ml，相较于现有的异相免疫分析技术提升10～1000倍，由nm提升至pm级别，灵敏度为90％以上，假阳性率和假阴性率均低于5％。
26.组装基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置以及采用所述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析的具体步骤如下：
27.步骤1：制备正交取向型纳米纤维膜，并进行官能化处理；
28.步骤2：在上述正交取向型纳米纤维膜的部分区域固载可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质，固载区域是一个以上圆点或条带状，具体区域数量可根据待测目标数量灵活选择和排布；
29.步骤3：将纳米纤维膜切割成圆片，组装至异相免疫分析装置中；
30.步骤4：将显色标签与第二识别物质结合后加入到待测溶液中孵育，随后将待测溶液转移至异相免疫分析装置中的无菌螺口注射器中；
31.步骤5：根据被标记的第二识别物的大小选择固相载体的孔径，选择原则为目标物质与被标记的第二识别物质的复合物不通过、未与目标物质结合的被标记的第二识别物质可通过即可；
32.步骤6：控制无菌螺口注射器的流速为0.5～5ml/h，使得待测溶液通过固相载体完成免疫反应，反应时间根据识别物质的亲和力、纤维膜比表面积、孔结构而不同，通常为10分钟以下，优选为3分钟以下，洗涤后通过信号采集实现高灵敏检测。
33.基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置的检测目标物质无特殊限定，可用于针对核酸、传染病毒、细菌、心脏标记物、毒品以及蛋白质和小分子化合物的免疫检测，但不限定于此，可广泛应用于本领域一般免疫测定方法中有关人类、动植物医学临床检测以及环境监测、食品安全检测中的测定对象；第一识别物质和第二识别物质，一般是抗原、抗体或者适配体(适配体是核酸的一个单链)，第一识别物质和第二识别物质均可与目标物质特异性结合，只要它们可同时与检测对象物质成为结合状态，它们可以相同也可以不同；显色标签包括胶体金、胶体硒、碳纳米管、碳纳米颗粒、乳胶微球、纤维素微球、磁纳米颗粒或量子点。
34.本发明的原理是：
35.在分析了侧流免疫层析试纸原理及纳米纤维膜的结构特征后可知，当纳米纤维被应用于侧流免疫分析时，待测液体是基于层析作用的横向流动，即发挥的是纳米纤维膜水平方向孔道的毛细管虹吸作用。静电纺纳米纤维膜是由随机的水平纳米纤维网逐层无序堆积而成，因此在膜水平和垂直方向上的孔结构特征是完全不同的。常规阐述的孔结构可调性，主要是指在膜的垂直方向，膜水平方向上的孔尺寸小且结构调控困难，难以通过孔结构调控来变更待测溶液的移动路径，目标物质在水平方向的孔道内向活性中心迁移过程中的扩散速率势必会受阻。而在纤维膜垂直方向，发挥的是识别分子固定化的作用。由于顶层纤维网的孔结构会被随后堆积的纤维网堵塞，使得纤维膜中可发挥传质作用的有效孔径要明显小于测得的孔径，进而导致生物识别分子扩散受阻，大多只被结合到纳米纤维膜的外层，膜表面配体密度增加，空间拥挤效应显著，目标物质结合效率低下。此外，垂直方向上由纤维无序堆积所形成的三种孔结构中只有通孔是有利于蛋白质分子扩散，盲孔和闭孔则对于生物分子扩散或分配到膜中无贡献。因此，由文献3(acs applied polymer materials 2021 3,1618-1627)可知，高孔隙率的结构优势也未对识别分子的传质扩散发挥正向作用。综上可知，以往的固相载体均不能被认定为异相免疫检测所需的理想材料。
36.本发明一方面涉及对纳米纤维固相载体的本体结构的优化，另一方面又涉及一种特殊匹配纳米纤维结构的异相免疫检测装置的设计，其是对待测溶液中的目标物质进行定量或定性检测的工具，从而充分发挥纳米纤维大比表面积、高孔隙率的结构性能，大幅提升灵敏度，对体外即时诊断领域的实际应用具有重要意义。
37.本发明的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，以正交取向型纳米纤维膜作为固相载体，正交取向型纳米纤维膜通过沿两个正交方向交替沉积具有单向有序结构的纳米纤维来制备的，以第1层纤维层为0
°
作为参考，第2层纤维与第1层纤维呈90
°
夹角，依次进行0
°
、90
°
逐渐沉积。与常规无序纳米纤维组成的多孔膜不同，正交取向型纳米纤维的垂直方向纤维间的间隙有规律，网孔结构被堵塞的概率降低，通孔率高，孔径结构均匀度提升且可调，在该载体上固定与目标物质具有结合能力的物质(以下采用抗体作为示例)
时，将有利于抗体扩散或分配到膜中，提升目标物质结合效率。
38.提升目标物质结合效率的具体原因为：纳米纤维膜是一种层层堆叠的3维结构，当在表面进行第一识别物质的涂敷时，由于纤维膜通孔率高使得识别分子会在垂直方向分布在纤维膜上并不仅仅在膜表面分布，避免了由于识别物质只在表面分布造成的空间拥挤效应，纤维膜的孔隙率高自然就可以固定更多的识别物质，孔径结构的均匀可以保持样品流的稳定，这样就可以使得样品中的目标分子与纤维膜上的识别物质稳定的反应，从而提高了结合效率。
39.此外，本发明的一种特殊匹配纳米纤维固相载体的异相免疫分析装置，需将上述纳米纤维夹持于装置中，目标物质试样将以一定流速垂直注入到固相载体中，利用高孔隙率纳米纤维膜的可滤过性，发挥亲和层析的浓缩的作用，使得待测液中的目标物质与膜上的抗体紧密接触，颜色信号更为集中，洗涤后即可测定信号，达到高灵敏检测的目的。
40.有益效果
41.(1)以正交取向型纳米纤维膜作为异相免疫检测的固相载体，可有效解决传统纳米纤维膜在作为载体时，因沿纤维膜垂直方向存在层间网孔结构阻塞，通孔率低等结构特征而导致的固载于膜上的识别分子空间拥挤效应显著，目标物质结合率低的问题，通过将单向有序的纳米纤维沿两个正交方向形成周期性受控沉积，可在不损失纳米纤维膜高比表面积特性的同时，有效提高孔径均匀度和通孔率，孔结构特征可通过单层沉积时间和沉积层数灵活调控，能够改善异相免疫反应的结合动力学，从而提高目标物质与固相载体的反应效率。
42.(2)通过设计一种特殊匹配正交取向型纳米纤维膜的异相免疫分析装置，将待测液体以一定流速垂直注入到固相载体中，解决了以往纳米纤维膜在作为固相载体时通过横向流动输送待测目标物质传质受阻，反应过程不可控的问题，利用该装置正交取向型纳米纤维膜发挥了亲和层析的浓缩作用，使得待测液中的目标物质与膜上的抗体紧密接触，颜色信号更为集中。同时由于正交取向型纳米纤维膜具有较高的机械强力和可调的孔径及孔隙率，在该装置中还能发挥出可过滤性，排除干扰信号，进一步提升检测的准确性。
附图说明
43.图1为正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置的整体示意图；
44.图2为正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置的局部示意图；
45.其中，1-微量注射泵，2-无菌螺口注射器，3-微量分析换膜过滤器，4-o型环硅胶密封圈，5-正交取向型纳米纤维膜。
具体实施方式
46.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
47.实施例中采用的测试方法/计算方法如下：
48.(1)单向取向参数s：根据文献(separation and purification technology[j],
2021,260,118246)，计算公式为：s＝2cos2θ-1；本发明具体测量过程为：先用扫描电镜观察最上层纤维膜的形貌，利用image pro-plus软件从扫描电镜图像中测量纤维的取向角，测量单根纤维与垂直方向的夹角为纤维取向角θ；每一次测量50根纤维，根据纤维取向角的频率分布可得到一层纤维的平均取向角，代入计算公式则为纤维膜的单向取向参数；
[0049]
(2)孔隙率：根据文献(journal of the korean wood science and technology[j],2019,47(1):8-20)，孔隙率ε计算公式为：其中，v
实
为实际测量的体积(样品质量与聚合物的标准密度比)，v
测
为使用气体比重瓶测量得到的体积；
[0050]
(3)通孔率：将纳米纤维膜样品浸入烧杯中的galwick(浸润液，一种全氟烷类液体化合物)溶液中，并将其放入真空室中，此时，样品中通孔和盲孔允许液体流入。然后对浸润液完全穿透的膜进行加压，随着压力的增加，润湿的液体被缓慢挤出，然而，由于盲孔的一端闭合，盲孔内的液体没有被挤出。浸渍盲孔的液体重量m
盲
是通过压制后试样的重量m1减去初始试样的重量m0来计算的，通过已知的液体密度ρ
液
，可以获得盲孔体积，盲孔孔隙率，可以获得盲孔体积，盲孔孔隙率通孔率为孔隙率减去盲孔孔隙率的差值，通孔率通孔率为孔隙率减去盲孔孔隙率的差值，通孔率其中，v
实
为实际测量的体积，v
测
为使用气体比重瓶测量得到的体积。
[0051]
(4)检测限(lod)：根据专利cn201520796221.4(一种荧光免疫层析检测试纸)中的方法测试试纸条的检测限，lod使用标准差法确定，lod＝3σ/s，其中σ是标准曲线y截距的标准偏差，s表示标准曲线的斜率。误差棒是通过进行三次平行试验获得的，以确认获得的结果；
[0052]
标准曲线的确立：首先通过智能手机、数码相机或者桌面扫描仪对颜色强度进行量化得到光电信号值(可以为rgb中的r值、g值或者b值，也可以为灰度值)，以目标物质浓度为x轴，光电信号值为y轴，根据目标物质浓度与光电信号值在一定范围内成线性关系建立拟合标准曲线y＝sx+b，x介于x0和x1之间(x0为标准曲线中的目标物质浓度最小值，x1为标准曲线中的目标物质浓度最大值)，s为标准曲线的斜率，b为标准曲线的截距，通过三次平行试验得到y截距的标准偏差σ，检测限lod＝3σ/s。
[0053]
(5)灵敏度：根据gb/t 40369-2021在试验条件下的检出限水平时，检出阳性结果的阳性样品数占总阳性样品数的百分比，测试样品数为120。
[0054]
(6)假阳性率：根据gb/t 40369-2021在试验条件下的检出限水平时，阴性样品中检出阳性结果的百分比，测试样品数为120。
[0055]
(7)假阴性率：根据gb/t 40369-2021在试验条件下的检出限水平时，阳性样品中检出阴性结果的百分比，测试样品数为120。
[0056]
(8)平均孔径：采用毛细管流动孔径分析仪测量纤维膜的平均孔径。测试原理是：在一定压力下，通过计算气体通过干态试样和湿态试样中的气流变化，计算机会自动整合出样品的孔径及分布曲线，从而得到平均孔径。测试过程将样品用galwick浸润液完全润湿以后放入测试仓中，测试之前应预先估算样品的孔径尺寸选择测试范围，具体过程为：使用毛细管流动孔径分析仪对纳米纤维进行孔径分布选择时，可以先在计算机中选择“1μm及以上”进行测试，若计算机导出的数据大部分孔径分布在1μm以下，则需要选择孔径范围“0.1
～1μm”进行测量，在计算机中点击开始，一定时间后即可测出样品的孔径尺寸分布。
[0057]
聚合物的厂商、分子量/纯度
[0058][0059][0060]
实施例1
[0061]
一种的正交取向型纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
[0062]
(1)原料的准备：
[0063]
聚合物：聚偏氟乙烯；
[0064]
溶剂：丙酮；
[0065]
(2)将聚偏氟乙烯溶解到丙酮中获得的均相溶液，即浓度为5wt％的纺丝液；
[0066]
(3)将步骤(2)的纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理后经切割得到接枝有醛基的圆形正交取向型纳米纤维膜；
[0067]
其中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压8kv，纺丝液流速0.5ml/h，湿度30％，温度25℃，喷丝头与接收装置的距离5cm，接收速度1000rpm，接收方法为高速滚筒接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积；每层纤维的沉积时间为2min；
[0068]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为100层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.973；正交取向型纳米纤维膜为直径13mm的圆片，厚度为0.1μm，平均孔径为0.5μm，孔隙率为90.2％，通孔率为80.2％。
[0069]
实施例2
[0070]
一种的正交取向型纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
[0071]
(1)原料的准备：
[0072]
聚合物：聚(乙烯醇-co-乙烯)；
[0073]
溶剂：异丙醇；
[0074]
(2)将聚(乙烯醇-co-乙烯)溶解到异丙醇中获得的均相溶液，即浓度为7.5wt％的纺丝液；
[0075]
(3)将步骤(2)的纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理后经切割得到接枝有nhs酯基的圆形正交取向型纳米纤维膜；
[0076]
其中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压10kv，纺丝液流速1ml/h，湿度35％，温度27℃，喷丝头与接收装置的距离10cm，接收速度1200rpm，接收方法为辅助电极接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积；每层纤维的沉积时间为2.4min；
[0077]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为120层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.976；正交取向型纳米纤维膜为直径13mm的圆片，厚度为0.12μm，平均孔径为0.55μm，孔隙率为90.3％，通孔率为82％。
[0078]
实施例3
[0079]
一种的正交取向型纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
[0080]
(1)原料的准备：
[0081]
聚合物：聚苯乙烯；
[0082]
溶剂：n,n-二甲基甲酰胺；
[0083]
(2)将聚苯乙烯溶解到n,n-二甲基甲酰胺中获得的均相溶液，即浓度为10wt％的纺丝液；
[0084]
(3)将步骤(2)的纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理后经切割得到接枝有磺酸基的圆形正交取向型纳米纤维膜；
[0085]
其中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压12kv，纺丝液流速1.5ml/h，湿度40％，温度30℃，喷丝头与接收装置的距离15cm，接收速度1400rpm，接收方法为附加磁场接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积；每层纤维的沉积时间为2.8min；
[0086]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为160层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.978；正交取向型纳米纤维膜为直径14mm的圆片，厚度为0.16μm，平均孔径为0.6μm，孔隙率为90.6％，通孔率为82.4％。
[0087]
实施例4
[0088]
一种的正交取向型纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
[0089]
(1)原料的准备：
[0090]
聚合物：聚己内酯；
[0091]
溶剂：三氯甲烷；
[0092]
(2)将聚己内酯溶解到三氯甲烷中获得的均相溶液，即浓度为12.5wt％的纺丝液；
[0093]
(3)将步骤(2)的纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理后经切割得到接枝有nhs酯基的圆形正交取向型纳米纤维膜；
[0094]
其中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压14kv，纺丝液流速2ml/h，湿度45％，温度32℃，喷丝头与接收装置的距离20cm，接收速度1600rpm，接收方法为高速滚筒接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积；每层纤维的沉积时间为3min；
[0095]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为180层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.981；正交取向型纳米纤维膜为直径15mm的圆片，厚度为0.18μm，平均孔径为0.8μm，孔隙率为90.8％，通孔率为83％。
[0096]
实施例5
[0097]
一种的正交取向型纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
[0098]
(1)原料的准备：
[0099]
聚合物：聚乙烯醇；
[0100]
溶剂：二甲基亚砜；
[0101]
(2)将聚乙烯醇溶解到二甲基亚砜中获得的均相溶液，即浓度为15wt％的纺丝液；
[0102]
(3)将步骤(2)的纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理后经切割得到接枝有醛基的圆形正交取向型纳米纤维膜；
[0103]
其中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压16kv，纺丝液流速2.5ml/h，湿度50％，温度35℃，喷丝头与接收装置的距离25cm，接收速度1800rpm，接收方法为辅助电极接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积；每层纤维的沉积时间为3.2min；
[0104]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为200层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.983；正交取向型纳米纤维膜为直径17mm的圆片，厚度为0.2μm，平均孔径为1.2μm，孔隙率为91％，通孔率为84.5％。
[0105]
实施例6
[0106]
一种的正交取向型纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
[0107]
(1)原料的准备：
[0108]
聚合物：聚醚砜；
[0109]
溶剂：n,n-二甲基甲酰胺；
[0110]
(2)将聚醚砜溶解到n,n-二甲基甲酰胺中获得的均相溶液，即浓度为17.5wt％的纺丝液；
[0111]
(3)将步骤(2)的纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理后经切割得到接枝有羧基的圆形正交取向型纳米纤维膜；
[0112]
其中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压18kv，纺丝液流速3ml/h，湿度55％，温度38℃，喷丝头与接收装置的距离30cm，接收速度2000rpm，接收方法为附加磁场接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积；每层纤维的沉积时间为3.6min；
[0113]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为220层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.985；正交取向型纳米纤维膜为直径19mm的圆片，厚度为0.22μm，平均孔径为1.8μm，孔隙率为91.3％，通孔率为84.8％。
[0114]
实施例7
[0115]
一种的正交取向型纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
[0116]
(1)原料的准备：
[0117]
聚合物：聚乳酸；
[0118]
溶剂：二氯甲烷；
[0119]
(2)将聚乳酸溶解到二氯甲烷中获得的均相溶液，即浓度为20wt％的纺丝液；
[0120]
(3)将步骤(2)的纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理后经切割得到接枝有nhs酯基的圆形正交取向型纳米纤维膜；
[0121]
其中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压20kv，纺丝液流速3.5ml/h，湿度60％，温度40℃，喷丝头与接收装置的距离5cm，接收速度2200rpm，接收方法为高速滚筒接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积；每层纤维的沉积时间为4min；
[0122]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为240层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.986；正交取向型纳米纤维膜为直径21mm的圆片，厚度为0.24μm，平均孔径为2.4μm，孔隙率为91.5％，通孔率为85％。
[0123]
实施例8
[0124]
一种的正交取向型纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
[0125]
(1)原料的准备：
[0126]
聚合物：尼龙6；
[0127]
溶剂：甲酸；
[0128]
(2)将尼龙6溶解到甲酸中获得的均相溶液，即浓度为22.5wt％的纺丝液；
[0129]
(3)将步骤(2)的纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理后经切割得到接枝有氨基的圆形正交取向型纳米纤维膜；
[0130]
其中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压25kv，纺丝液流速4ml/h，湿度65％，温度25℃，喷丝头与接收装置的距离10cm，接收速度2400rpm，接收方法为辅助电极接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积；每层纤维的沉积时间为4.2min；
[0131]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为260层，由于纤维膜制备
工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.988；正交取向型纳米纤维膜为直径23mm的圆片，厚度为0.26μm，平均孔径为2.8μm，孔隙率为92％，通孔率为85.4％。
[0132]
实施例9
[0133]
一种的正交取向型纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
[0134]
(1)原料的准备：
[0135]
聚合物：壳聚糖；
[0136]
溶剂：乙酸；
[0137]
(2)将壳聚糖溶解到乙酸中获得的均相溶液，即浓度为25wt％的纺丝液；
[0138]
(3)将步骤(2)的纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理后经切割得到接枝有醛基的圆形正交取向型纳米纤维膜；
[0139]
其中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压28kv，纺丝液流速4.5ml/h，湿度70％，温度27℃，喷丝头与接收装置的距离15cm，接收速度2600rpm，接收方法为附加磁场接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积；每层纤维的沉积时间为4.6min；
[0140]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为280层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.989；正交取向型纳米纤维膜为直径23mm的圆片，厚度为0.28μm，平均孔径为3.6μm，孔隙率为92.3％，通孔率为85.6％。
[0141]
实施例10
[0142]
一种的正交取向型纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
[0143]
(1)原料的准备：
[0144]
聚合物：聚丙烯腈；
[0145]
溶剂：n,n-二甲基甲酰胺；
[0146]
(2)将聚丙烯腈溶解到n,n-二甲基甲酰胺中获得的均相溶液，即浓度为30wt％的纺丝液；
[0147]
(3)将步骤(2)的纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理后经切割得到接枝有羧基的圆形正交取向型纳米纤维膜；
[0148]
其中静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压30kv，纺丝液流速5ml/h，湿度70％，温度30℃，喷丝头与接收装置的距离20cm，接收速度3000rpm，接收方法为高速滚筒接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积；每层纤维的沉积时间为5min；
[0149]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为300层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.989；正交取向型纳米纤维膜为直径25mm的圆片，厚度为0.3μm，平均孔径为4μm，孔隙率为93％，通孔率为86％。
[0150]
实施例11
[0151]
一种正交取向型纳米纤维膜的制备方法，基本同实施例1，不同之处仅在于聚合物为聚乙烯醇，溶剂为二甲基亚砜；
[0152]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为100层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.976；正交取向型纳米纤维膜为直径13mm的圆片，厚度为0.1μm，平均孔径为0.5μm，孔隙率为90.7％，通孔率为82.4％。
[0153]
实施例12
[0154]
一种正交取向型纳米纤维膜的制备方法，基本同实施例1，不同之处仅在于聚合物为聚乙二醇，溶剂为丙酮；
[0155]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为180层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.983；正交取向型纳米纤维膜为直径15mm的圆片，厚度为0.16μm，平均孔径为2.2μm，孔隙率为92.8％，通孔率为88.2％。
[0156]
实施例13
[0157]
一种正交取向型纳米纤维膜的制备方法，基本同实施例1，不同之处仅在于聚合物为聚苯胺，溶剂为甲酸；
[0158]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为210层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.981；正交取向型纳米纤维膜为直径17mm的圆片，厚度为0.18μm，平均孔径为0.65μm，孔隙率为93.2％，通孔率为88.6％。
[0159]
实施例14
[0160]
一种正交取向型纳米纤维膜的制备方法，基本同实施例1，不同之处仅在于聚合物为聚己内酯；溶剂为n,n-二甲基甲酰胺；
[0161]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为300层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.986；正交取向型纳米纤维膜为直径21mm的圆片，厚度为0.3μm，平均孔径为3.2μm，孔隙率为92.7％，通孔率为89.3％。
[0162]
实施例15
[0163]
一种正交取向型纳米纤维膜的制备方法，基本同实施例1，不同之处仅在于聚合物为壳聚糖，溶剂为n,n-二甲基甲酰胺；
[0164]
制得的正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为270层，由于纤维膜制备工艺相同，只改变纤维的垂直和水平方向，故每层纤维膜的单向取向参数均相同，可使用最上层纤维膜的取向水平反应整体纤维膜的单向取向参数，整体纤维膜的单向取向参数s为0.985；正交取向型纳米纤维膜为直径25mm的圆片，厚度为0.25μm，平均孔径为4μm，孔隙率
为90.2％，通孔率为83.4％。
[0165]
实施例16一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，如图1～2所示，包括圆形正交取向型纳米纤维膜5、微量注射泵1、无菌螺口注射器2和微量分析换膜过滤器3；圆形正交取向型纳米纤维膜5上固载有可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质；微量分析换膜过滤器3中具有两个o型环硅胶密封圈4组成的夹具，将圆形正交取向型纳米纤维膜5夹持于其中；o型环硅胶密封圈4外径与圆形正交取向型纳米纤维膜5的直径相等；无菌螺口注射器2与微量分析换膜过滤器3通过螺纹连接阀相连；由圆形正交取向型纳米纤维膜5、无菌螺口注射器2和微量分析换膜过滤器3构成的组件组装到微量注射泵上。采用上述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析的步骤为：(1)确定待测目标物质为氯霉素，固载区域为两个圆点，其中第一个圆点为0.5μl 100μm的第一识别物质5
’‑
aga-gga-cta-cgg-ccc-cag-cgg-agg-cgg-cat-ccg-tta-ttg-biotin-3’，作为检测组；第二个圆点为0.5μl 100μm的5
’‑
ttt-ttt-ttt-biotin-3’，作为对照组；
[0166]
(2)将显色标签与第二识别物质结合，显色标签为胶体金，第二识别物质为5
’‑
sh-aaa-aaa-aaa-caa-taa-cgg-atg-ccg-cct
–
ccg-ctg-ggg-ccg-tag-tcc-tct-3’；结合方法为：将1 ml胶体金溶液与5μl 100μm的第二识别物质孵育结合后取50μl加入到5 ml的待测溶液(0.01 m，ph＝7.4的pbst溶液，tween-20含量为0.5％，v/v)中孵育4 h，随后将孵育后的待测溶液转移至异相免疫分析装置中的无菌螺口注射器中；
[0167]
(3)根据被标记的第二识别物的大小选择固相载体的平均孔径为0.5μm(即选择实施例1的圆形正交取向型纳米纤维膜)，控制无菌螺口注射器的流速为0.5 ml/h，使得待测溶液通过固相载体完成免疫反应，反应时间为3 min，洗涤后通过信号采集实现高灵敏检测。测试的检测限为0.1 ng/ml，灵敏度为90％，假阳性率和假阴性率均为4.8％。
[0168]
实施例17一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，包括圆形正交取向型纳米纤维膜、微量注射泵、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器；
[0169]
圆形正交取向型纳米纤维膜上固载有可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质；微量分析换膜过滤器中具有两个o型环硅胶密封圈组成的夹具，将圆形正交取向型纳米纤维膜夹持于其中；o型环硅胶密封圈外径与圆形正交取向型纳米纤维膜的直径相等；无菌螺口注射器与微量分析换膜过滤器通过螺纹连接阀相连；由圆形正交取向型纳米纤维膜、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器构成的组件组装到微量注射泵上。采用上述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析的步骤为：
[0170]
(1)确定待测目标物质为微囊藻毒素lr(mc-lr)，固载区域为两个条带状，其中第一个条带状为第一识别物质为mc-lr-bsa，作为检测组，合成方法为：将1mg mc-lr、1mg nhs和1mg edc混合在200μl的n,n-二甲基甲酰胺中，在室温下反应5h形成混合溶液。将10mg bsa溶解在2ml pbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)中，加入到混合溶液中形成lr-bsa复合物，再将0.7μl复合物固定在纳米纤维膜圆片上形成0.8cm长的条带状；第二个条带状为0.7μl 10ng/ml的山羊抗小鼠igg抗体，作为对照组，长度为0.8cm；
[0171]
(2)将显色标签与第二识别物质结合，显色标签为荧光微球(羧基化黄绿色荧光乳胶ps微球)，第二识别物质为微囊藻毒素单克隆抗体；结合方法为：将15μl 2％w/v的荧光微球悬浮于1ml的mes缓冲液(0.05m，ph＝6)中，加入1mg edc和1mg nhs活化；在活化的荧光微球中加入20μl 0.2mg/ml的微囊藻毒素单克隆抗体，再搅拌30min，然后在加入20μl 20％w/
v的bsa溶液，溶剂为mes缓冲液(0.05m，ph＝6)，搅拌15min，最后，将混合物在10000rpm下离心10min得到沉淀，沉淀用1ml pbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)洗涤2次(以同样的方法离心两次)，再用200μl pbs重悬，超声处理形成结合物；然后取50μl结合物加入到5ml的待测溶液(0.01m，ph＝7.4的pbst溶液，tween-20含量为0.5％，v/v)中孵育4h，随后将孵育后的待测溶液转移至异相免疫分析装置中的无菌螺口注射器中；
[0172]
(3)根据被标记的第二识别物的大小选择固相载体的平均孔径为0.55μm(即实施例2的圆形正交取向型纳米纤维膜)，控制无菌螺口注射器的流速为1ml/h，使得待测溶液通过固相载体完成免疫反应，反应时间为3min，洗涤后通过信号采集实现高灵敏检测。
[0173]
测试的检测限为0.5ng/ml，灵敏度为90.4％，假阳性率和假阴性率均为4.6％。
[0174]
实施例18
[0175]
一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，包括圆形正交取向型纳米纤维膜、微量注射泵、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器；
[0176]
圆形正交取向型纳米纤维膜上固载有可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质；
[0177]
微量分析换膜过滤器中具有两个o型环硅胶密封圈组成的夹具，将圆形正交取向型纳米纤维膜夹持于其中；o型环硅胶密封圈外径与圆形正交取向型纳米纤维膜的直径相等；
[0178]
无菌螺口注射器与微量分析换膜过滤器通过螺纹连接阀相连；由圆形正交取向型纳米纤维膜、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器构成的组件组装到微量注射泵上。
[0179]
采用上述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析的步骤为：
[0180]
(1)确定待测目标物质为肉毒神经毒素a，固载区域为两个条带状，其中第一个条带状为3μl 4.5mg/ml的第一识别物质抗肉毒神经毒素a抗体，作为检测组，第二个条带状为3μl 4.5mg/ml的山羊抗小鼠igg，作为对照组；
[0181]
(2)将显色标签与第二识别物质结合，显色标签为磁纳米颗粒(羧基磁珠，超顺磁fe3o4颗粒)，第二识别物质为多克隆抗肉毒神经毒素a抗体；结合方法为：先用去离子水洗涤300μg的磁纳米颗粒，然后将磁纳米颗粒加入到0.8ml mes缓冲液(0.1m，ph＝5.0)中超声10min，然后在超声后的缓冲液中加入80mg edc和40mg sulfo-nhs孵育20min，得到磁纳米颗粒溶液，将10μl 3.5mg/ml多克隆抗肉毒神经毒素a抗体溶液加入到80μl硼酸盐缓冲液(0.1m，ph＝8.6)中，再加入到磁纳米颗粒溶液中偶联1h得到结合物；然后取50μl结合物加入到5ml的待测溶液(0.01m，ph 7.4的pbst溶液，tween-20含量为0.5％,v/v)中孵育6h，随后将孵育后的待测溶液转移至异相免疫分析装置中的无菌螺口注射器中；
[0182]
(3)根据被标记的第二识别物的大小选择固相载体的平均孔径为0.6μm(即实施例3的圆形正交取向型纳米纤维膜)，控制无菌螺口注射器的流速为1.5ml/h，使得待测溶液通过固相载体完成免疫反应，反应时间为4min，洗涤后通过信号采集实现高灵敏检测。
[0183]
测试的检测限为0.7ng/ml，灵敏度为90.6％，假阳性率和假阴性率均为4.2％。
[0184]
实施例19
[0185]
一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，包括圆形正交取向型纳米纤维膜、微量注射泵、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器；
1mg/ml重组内毒素a，作为对照组；
[0202]
(2)将显色标签与第二识别物质结合，显色标签为乳胶微球，第二识别物质为β-乳球蛋白多克隆抗体；结合方法为：将200μl 1mg/ml的β-乳球蛋白多克隆抗体加入到800μl 70nm的红色乳胶微球中得到终浓度为0.2mg/ml的β-乳球蛋白多克隆抗体偶联物，在室温下以12rpm/min、90
°
角摇动孵育2.5h。然后加入30μl乙醇胺，得到混合物并在室温下孵育30min。然后，将混合物在17000g下离心15min，弃上清。最后加入1mg bsa在室温下摇晃孵育2h形成结合物；然后取50μl结合物加入到5ml的待测溶液(0.01m，ph 7.4的pbst溶液，tween-20含量为0.5％,v/v)中孵育8h，随后将孵育后的待测溶液转移至异相免疫分析装置中的无菌螺口注射器中；
[0203]
(3)根据被标记的第二识别物的大小选择固相载体的平均孔径为1.2μm(即实施例5的圆形正交取向型纳米纤维膜)，控制无菌螺口注射器的流速为2.5ml/h，使得待测溶液通过固相载体完成免疫反应，反应时间为5min，洗涤后通过信号采集实现高灵敏检测。
[0204]
测试的检测限为2.8ng/ml，灵敏度为91％，假阳性率和假阴性率均为4％。
[0205]
实施例21
[0206]
一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，包括圆形正交取向型纳米纤维膜、微量注射泵、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器；
[0207]
圆形正交取向型纳米纤维膜上固载有可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质；
[0208]
微量分析换膜过滤器中具有两个o型环硅胶密封圈组成的夹具，将圆形正交取向型纳米纤维膜夹持于其中；o型环硅胶密封圈外径与圆形正交取向型纳米纤维膜的直径相等；
[0209]
无菌螺口注射器与微量分析换膜过滤器通过螺纹连接阀相连；由圆形正交取向型纳米纤维膜、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器构成的组件组装到微量注射泵上。
[0210]
采用上述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析的步骤为：
[0211]
(1)确定待测目标物质为链霉素(sm)，固载区域为两个条带状，第一个条带状为0.4μl 1mg/ml的第一识别物质sm-ova，作为检测组；第二个条带为0.4μl 0.25mg/ml的羊抗小鼠igg，作为对照组；
[0212]
(2)将显色标签与第二识别物质结合，显色标签为量子点，第二识别物质为抗链霉素抗体；结合方法为：先将抗链霉素抗体在pbs缓冲液(0.01m，ph＝7.6)中透析，取300μl 0.2mg/ml透析后的抗链霉素抗体与25μl 8μm的量子点、50μl 0.8mm的edc、50μl 0.8mm的sulfo-nhs在室温下避光搅拌90min，用超滤管在室温下10000g离心5次，每次15min，将浓缩的偶联物(即结合物)4℃保存；然后取50μl结合物加入到5ml的待测溶液中(0.01m，ph 7.4的pbst溶液，tween-20含量为0.5％,v/v)孵育8h，随后将孵育后的待测溶液转移至异相免疫分析装置中的无菌螺口注射器中；
[0213]
(3)根据被标记的第二识别物的大小选择固相载体的平均孔径为1.8μm(即实施例6的圆形正交取向型纳米纤维膜)，控制无菌螺口注射器的流速为3ml/h，使得待测溶液通过固相载体完成免疫反应，反应时间为6min，洗涤后通过信号采集实现高灵敏检测。
[0214]
测试的检测限为4.5ng/ml，灵敏度为91.4％，假阳性率和假阴性率均为3.8％。
[0215]
实施例22
[0216]
一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，包括圆形正交取向型纳米纤维膜、微量注射泵、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器；
[0217]
圆形正交取向型纳米纤维膜上固载有可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质；
[0218]
微量分析换膜过滤器中具有两个o型环硅胶密封圈组成的夹具，将圆形正交取向型纳米纤维膜夹持于其中；o型环硅胶密封圈外径与圆形正交取向型纳米纤维膜的直径相等；
[0219]
无菌螺口注射器与微量分析换膜过滤器通过螺纹连接阀相连；由圆形正交取向型纳米纤维膜、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器构成的组件组装到微量注射泵上。
[0220]
采用上述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析的步骤为：
[0221]
(1)确定待测目标物质为三聚氰胺(mel)，固载区域为两个圆点，其中第一个圆点为0.5μl 1mg/ml的第一识别物质mel-bsa，作为检测组；第二个圆点为0.5μl 1mg/ml的羊抗小鼠igg，作为对照组；
[0222]
(2)将显色标签与第二识别物质结合，显色标签为胶体硒，第二识别物质为抗三聚氰胺单克隆抗体；结合方法为：将10μl 1mg/ml抗三聚氰胺单克隆抗体与1ml 50nm胶体硒(se nps)孵育30min，在10000rpm下离心15min，去除上清。用1ml pbs(0.01m，ph＝7.4，0.5％w/v bsa，0.1％v/v吐温-20)重悬，得到最终的se nps-抗体偶联物(即结合物)；然后取50μl结合物加入到5ml的待测溶液(0.01m，ph 7.4的pbst溶液，tween-20含量为0.5％,v/v)中孵育4h，随后将孵育后的待测溶液转移至异相免疫分析装置中的无菌螺口注射器中；
[0223]
(3)根据被标记的第二识别物的大小选择固相载体的平均孔径为2.4μm(即实施例7的圆形正交取向型纳米纤维膜)，控制无菌螺口注射器的流速为3.5ml/h，使得待测溶液通过固相载体完成免疫反应，反应时间为7min，洗涤后通过信号采集实现高灵敏检测。
[0224]
测试的检测限为5.8ng/ml，灵敏度为91.8％，假阳性率和假阴性率均为3.6％。
[0225]
实施例23
[0226]
一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，包括圆形正交取向型纳米纤维膜、微量注射泵、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器；
[0227]
圆形正交取向型纳米纤维膜上固载有可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质；
[0228]
微量分析换膜过滤器中具有两个o型环硅胶密封圈组成的夹具，将圆形正交取向型纳米纤维膜夹持于其中；o型环硅胶密封圈外径与圆形正交取向型纳米纤维膜的直径相等；
[0229]
无菌螺口注射器与微量分析换膜过滤器通过螺纹连接阀相连；由圆形正交取向型纳米纤维膜、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器构成的组件组装到微量注射泵上。
[0230]
采用上述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析的步骤为：
[0231]
(1)确定待测目标物质为孔雀石绿，固载区域为两个条带状，其中第一个条带状为0.8μl 100μm的第一识别物质5
’‑
agg-gct-gac-ctt-gtc-cat-tgc-tta-cct-biotin-3’，作
为检测组；第二个条带状为0.8μl 100μm 5
’‑
ttt-ttt-ttt-biotin-3’，作为对照组；
[0232]
(2)将显色标签与第二识别物质结合，显色标签为胶体金，第二识别物质为5
’‑
sh-aaa-aaa-aaa-ucc-cga-cug-gaa-cag-gua-acg-aau-gga-3’；结合方法为：将1ml胶体金溶液与5μl 100μm的第二识别物质孵育结合后取50μl加入到5ml的待测溶液(0.01m，ph 7.4的pbst溶液，tween-20含量为0.5v/v％)孵育4h中，随后将孵育后的待测溶液转移至异相免疫分析装置中的无菌螺口注射器中；
[0233]
(3)根据被标记的第二识别物的大小选择固相载体的平均孔径为2.8μm(即实施例8的圆形正交取向型纳米纤维膜)，控制无菌螺口注射器的流速为4ml/h，使得待测溶液通过固相载体完成免疫反应，反应时间为8min，洗涤后通过信号采集实现高灵敏检测。
[0234]
测试的检测限为0.2ng/ml，灵敏度为92％，假阳性率和假阴性率均为3.4％。
[0235]
实施例24
[0236]
一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，包括圆形正交取向型纳米纤维膜、微量注射泵、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器；
[0237]
圆形正交取向型纳米纤维膜上固载有可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质；
[0238]
微量分析换膜过滤器中具有两个o型环硅胶密封圈组成的夹具，将圆形正交取向型纳米纤维膜夹持于其中；o型环硅胶密封圈外径与圆形正交取向型纳米纤维膜的直径相等；
[0239]
无菌螺口注射器与微量分析换膜过滤器通过螺纹连接阀相连；由圆形正交取向型纳米纤维膜、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器构成的组件组装到微量注射泵上。
[0240]
采用上述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析的过程为：
[0241]
(1)确定待测目标物质为卡那霉素，固载区域为两个圆点，其中第一个圆点为0.5μl 100μm第一识别物质为5
’‑
ctcaacccccaaaaaaa-biotin-3’，作为检测组；第二个圆点为0.5μl 100μm 5
’‑
biotin-gctaagccgattttttt-3’，作为对照组；
[0242]
(2)将显色标签与第二识别物质结合，显色标签为胶体金，第二识别物质为5
’‑
sh-tgggggttgaggctaagccga-3’；结合方法为：将1ml胶体金溶液与5μl 100μm的第二识别物质孵育结合后取50μl加入到5ml的待测溶液(0.01m，ph 7.4的pbst溶液，tween-20含量为0.5％,v/v)中孵育6h，随后将待测溶液转移至异相免疫分析装置中的无菌螺口注射器中；
[0243]
(3)根据被标记的第二识别物的大小选择固相载体的平均孔径为3.6μm(即实施例9的圆形正交取向型纳米纤维膜)，控制无菌螺口注射器的流速为4.5ml/h，使得待测溶液通过固相载体完成免疫反应，反应时间为9min，洗涤后通过信号采集实现高灵敏检测。
[0244]
测试的检测限为8.3ng/ml，灵敏度为92.5％，假阳性率和假阴性率均为3.2％。
[0245]
实施例25
[0246]
一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，包括圆形正交取向型纳米纤维膜、微量注射泵、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器；
[0247]
圆形正交取向型纳米纤维膜上固载有可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质；
[0248]
微量分析换膜过滤器中具有两个o型环硅胶密封圈组成的夹具，将圆形正交取向
型纳米纤维膜夹持于其中；o型环硅胶密封圈外径与圆形正交取向型纳米纤维膜的直径相等；
[0249]
无菌螺口注射器与微量分析换膜过滤器通过螺纹连接阀相连；由圆形正交取向型纳米纤维膜、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器构成的组件组装到微量注射泵上。
[0250]
采用上述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析的过程为：
[0251]
(1)确定待测目标物质为恩诺沙星(enr)，固载区域为两个圆点，其中第一个圆点为0.5μl 1.0mg/ml的第一识别物质enr-bsa，作为检测组；第二个圆点为0.5μl 1.0mg/ml羊抗小鼠igg，作为对照组；
[0252]
(2)将显色标签与第二识别物质结合，显色标签为胶体金，第二识别物质为抗恩诺沙星单克隆抗体；结合方法为：将5ml胶体金溶液与20μl 1.5μg/ml的抗恩诺沙星单克隆抗体在室温下在旋转器中反应30min，之后，将aμnps-抗恩诺沙星单克隆抗体溶液在6,000rpm4℃离心30min，得到沉淀物；然后将沉淀物用硼酸盐缓冲液(0.02m，ph＝9，1％ bsa、5％蔗糖)重悬至5ml得到结合物；然后取50μl结合物加入到5ml的待测溶液中(0.01m，ph 7.4的pbst溶液，tween-20含量为0.5％,v/v)孵育6h；随后将孵育后的待测溶液转移至异相免疫分析装置中的无菌螺口注射器中；
[0253]
(3)根据被标记的第二识别物的大小选择固相载体的平均孔径为4μm(即实施例10的圆形正交取向型纳米纤维膜)，控制无菌螺口注射器的流速为5ml/h，使得待测溶液通过固相载体完成免疫反应，反应时间为10min，洗涤后通过信号采集实现高灵敏检测。
[0254]
测试的检测限为10ng/ml，灵敏度为92.8％，假阳性率和假阴性率均为3％。

技术特征：
1.一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，其特征在于：包括正交取向型纳米纤维膜、微量注射泵、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器；无菌螺口注射器与微量分析换膜过滤器通过螺纹连接阀相连；微量分析换膜过滤器中具有两个o型环硅胶密封圈组成的夹具，将正交取向型纳米纤维膜夹持于其中；由正交取向型纳米纤维膜、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器构成的组件组装到微量注射泵上；正交取向型纳米纤维膜的形状为圆形，o型环硅胶密封圈外径与正交取向型纳米纤维膜的直径相等；正交取向型纳米纤维膜为经官能化处理的正交取向型纳米纤维膜；正交取向型纳米纤维膜由多层纤维构成，每层中的所有纤维取向排列，任意相邻两层中纤维的排列方向相互垂直。2.根据权利要求1所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，其特征在于，正交取向型纳米纤维膜中取向纳米纤维的层数为100～300层，每层纤维的单向取向参数s＞0.97。3.根据权利要求2所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，其特征在于，正交取向型纳米纤维膜为直径13～25mm的圆形膜；正交取向型纳米纤维膜的厚度为0.1～0.3μm，平均孔径为0.5～4μm，孔隙率＞90％，通孔率＞80％。4.根据权利要求3所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，其特征在于，正交取向型纳米纤维膜上的官能团为羧基、醛基、氨基、磺酸基、仲胺基、叔胺基、nhs酯基、马来酰亚胺基、碳二亚胺基、亚氨酸酯基。5.根据权利要求4所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，其特征在于，正交取向型纳米纤维膜是将纺丝液通过静电纺丝制备得到纳米纤维膜后，进行官能化处理得到，接收方法为高速滚筒接收、辅助电极接收或附加磁场接收，以第1层纤维的排列方向为0
°
作为参考，第2层纤维的排列方向为90
°
，依次进行0
°
、90
°
逐层沉积。6.根据权利要求5所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，其特征在于，纺丝液是将聚合物溶解到溶剂中获得的均相溶液，聚合物为聚偏氟乙烯、聚(乙烯醇-co-乙烯)、聚碳酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚乳酸、尼龙6、聚环氧乙烷、聚丙烯腈、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯胺、聚氨基甲酸酯、聚羟基丁酸酯、聚己内酯、聚醚砜、壳聚糖、胶原和纤维素的一种以上，溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、六氟异丙醇、四乙二醇、三乙二醇、甲酸、乙酸、苯酚、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲基正丙酮、二异丙酮、二异丁酮、丙酮、六氟丙酮、氯甲烷、氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、对氯甲苯、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、二氯丙烷、三氯甲烷、三氯乙烷、二溴乙烷、二溴丙烷、溴甲烷、溴乙烷、溴丙烷、醋酸、苯、甲苯、己烷、环己烷、环己酮、环戊烷、邻二甲苯、对二甲苯、乙腈、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、吡啶和水的一种以上。7.根据权利要求5所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，其特征在于，纺丝液的浓度为5～30wt％；静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压8～30kv，纺丝液流速0.5～5ml/h，湿度30～70％，温度25～40℃，喷丝头与接收装置的距离5～30cm，接收速度1000～3000rpm。8.根据权利要求5所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，其特征在于，每层纤维的沉积时间为2～5min。
9.根据权利要求1所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，其特征在于，正交取向型纳米纤维膜上固载有可与待测溶液中目标物质反应的第一识别物质，固载区域为一个以上圆点或条带状。10.根据权利要求1所述的一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，其特征在于，采用所述基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置进行异相免疫分析，检测限为0.1～100ng/ml，灵敏度为90％以上，假阳性率和假阴性率均低于5％。

技术总结
本发明涉及一种基于正交取向型纳米纤维的异相免疫分析装置，包括正交取向型纳米纤维膜、无菌螺口注射器和微量分析换膜过滤器构成的组件和微量注射泵，所述组件组装于微量注射泵上；无菌螺口注射器与微量分析换膜过滤器通过螺纹连接阀相连；微量分析换膜过滤器中具有两个O型环硅胶密封圈组成的夹具，将正交取向型纳米纤维膜夹持于其中；O型环硅胶密封圈外径与正交取向型纳米纤维膜的直径相等；正交取向型纳米纤维膜由多层纤维构成，每层中的所有纤维取向排列，任意相邻两层中纤维的排列方向相互垂直，孔径结构均匀，孔隙率高，蛋白吸附性强。采用本发明的装置进行异相免疫分析，检测限、检测灵敏度以及检测准确性均显著提升。检测灵敏度以及检测准确性均显著提升。检测灵敏度以及检测准确性均显著提升。


技术研发人员：李彦 李志辉 王璐 王富军
受保护的技术使用者：东华大学
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/23