自组装拟肽及其应用

1.本发明涉及拟肽自组装的技术领域及其应用，尤其涉及一种自组装拟肽衍生物及其作为抗菌剂/抗菌佐剂的应用。


背景技术：

2.多肽分子自组装技术是近年来的研究热点，通过分子设计和固相合成等手段可以得到成千上万种结构相异的多肽分子，多肽分子自组装后形成的纳米尺寸材料具有广泛的潜在用途。一般的，可自组装的多肽肽链的序列较长，合成复杂，因此，在具体应用时多肽的生物相容性还是受到限制。由氨基酸制备的拟肽及其修饰物的自组装受到的关注和研究较少，对其后续的修饰以及应用开发是必要且有意义的。
3.目前，用于抗菌的自组装多肽一般可分为自发组装和诱导组装两类；自发组装主要是形成一些如水凝胶这种抗菌材料，利用水凝胶本身的特性(材料表面富含的疏水功能和正电荷)抗菌，诱导自组装是在特定刺激(如酶，环境因素等)下，改变多肽自身的特性，从而促进其形成自组装体(研究最为广泛的如碱性磷酸酶诱导的自组装)；这种诱导自组装行为由于是由特定物质介导，使其具有特异性；因此利用细菌本身特异性介导的自组装抗菌拟肽将更具选择性(针对细菌)，这将大大降低对哺乳动物细胞的非特异毒性。
4.对于阳离子多肽，作为具有抗菌作用的多肽有望克服临床上日益严重的细菌耐药性，国内外报道多用于构建抗菌剂。但多肽本身存在的稳定性差，非特异性细胞毒性等缺陷一直制约着其作为药物的开发。而拟肽具有与天然多肽相似的抗菌特性，且拟肽通常具有抗酶水解特性。针对目前抗菌肽中多肽稳定性差，非特异性细胞毒性，细菌选择性差等问题，且目前对于同时具有抗菌活性及抗菌佐剂特性的多肽，尤其是细菌诱导自组装的短拟肽仍鲜有报道。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明公开了一种自组装拟肽分子，以及及其作为抗菌剂/抗菌佐剂的应用。
6.一种自组装拟肽分子，具有如下通式：
[0007][0008]
其中r1基团为式(i)、式(ii)、式(iii)、式(iv)、式(v)、式(vi)、式(vii)、式(viii)、式(ix)、式(x)、式(xi)、式(xii)、式(xiii)、式(xiv)、式(xv)、式(xvi)、式(xvii)、式(xviii)、式(xix)、式(xx)中的任意一种；
[0009][0010]
r基团为式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)、式(h)、式(i)、式(j)、式(k)、式(l)、式(m)、式(n)、式(o)、式(p)、式(q)、式(r)中的任意一种；
[0011][0012]
本发明，针对目前抗菌肽中多肽稳定性差，非特异性细胞毒性，细菌选择性差等问题，且目前对于同时具有抗菌活性及抗菌佐剂特性的多肽尤其是细菌诱导自组装短拟肽仍鲜有报道，本发明设计出了一类阳离子对称的细菌诱导的抗菌自组装拟肽，它们的一级结构与天然多肽不同，具有线性对称性，具有抗菌作用，还可以作为敏化抗生素的抗菌佐剂。此外，目前虽对具有抗菌活性的天然或人工合成多肽已有大量的报道，但同时具有抗菌剂和抗生素佐剂特性的拟肽是少见的，尤其是自组装拟肽促使细菌产生膜扰动或受细菌诱导聚集的报道却更加少见。本发明公开了一种具有细菌促进自组装特性和抗菌性能的自组装拟肽分子及其应用，本发明基于修饰精氨酸分子丰富的非共价键作用能力以及良好的与脂质膜相互作用能力，设计合成了可使革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细菌膜扰动同时具有抗菌活性的自组装多肽分子。本发明的系列分子可在ph＝7.4的水溶液中，通过分子间强疏水相互作用后发生自组装絮凝化形成自组装体，且细菌与拟肽分子间的相互作用促进拟肽分子的自组装。本发明的自组装拟肽分子具有良好的细菌特异性和抗菌活性，成分单一、最短
的氨基酸序列(仅含两个精氨酸)。该系列分子由于其序列短小，且具有良好生物相容性、以及易于合成生产等优点，具有作为一种高效、环保的新型自组装抗菌剂/抗菌佐剂的应用潜力。
[0013]
本发明的系列分子可在ph＝7.5的磷酸缓冲盐溶液中，通过分子间相互作用后发生自组装形成液相分离的颗粒状。本发明的自组装拟肽分子具有良好的抗菌活性和敏化抗生素潜力，且在同类型的抗菌拟肽分子在细菌选择性上表现优异，具体体现在同类型分子(喷他脒和洗必泰)中表现出非特异性的溶血毒性和哺乳动物细胞的毒性，而该系列自组装抗菌拟肽分子表现出极低的溶血效果和细胞毒性，甚至在老鼠模型中也并未观察到明显的活体毒性。该系列分子由于其生物学来源、序列短小，而具有良好生物相容性以及易于合成生产等优点，具有作为一种高效、环保的新型细菌抗菌剂和抗菌佐剂的应用潜力。
附图说明
[0014]
图1为拟肽分子结构图；
[0015]
图2拟肽分子g-15的h
1 nmr图；
[0016]
图3为d-15，g-15，j-15，n-15拟肽和相似结构的分子(喷他脒和洗必泰)对哺乳动物细胞的毒性测试图；
[0017]
图4为该系列中活性最佳的拟肽分子g-15的自组装能力测试；
[0018]
图5为拟肽分子g-15对细胞内空间分布扰动；
[0019]
图6为拟肽分子g-15的动物实验；
[0020]
图7为拟肽分子j-14的h
1 nmr图；
[0021]
图8为拟肽分子j-14与lps自组装能力测试；
[0022]
图9为拟肽分子d-15的h
1 nmr图；
[0023]
图10为拟肽分子d-15筛选ia32抗生素；
[0024]
图11为拟肽分子d-15筛选fda批准的非抗生素药物；
[0025]
图12为拟肽分子d-15与lps和优选药物的自组装能力测试。
具体实施方式
[0026]
以下通过具体实施方式并且结合附图对本发明的技术方案作具体说明，下述实施例中的部件或设备如无特别说明，均为通用标准件或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。
[0027]
本发明基于修饰精氨酸分子丰富的非共价键作用能力以及良好的与脂质膜相互作用能力，设计合成了可使革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌等)和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌，鲍曼不动杆菌等)细菌膜扰动，同时具有细菌诱导抗菌活性的自组装拟肽分子。
[0028]
本发明的第一个目的是提供一种具有抗菌性能和抗菌佐剂的细菌诱导自组装拟肽分子，其具体结构如图1所示，这些拟肽分子具有如下通式：
[0029]
[0030]
其中r1基团为式(i)、式(ii)、式(iii)、式(iv)、式(v)、式(vi)、式(vii)、式(viii)、式(ix)、式(x)、式(xi)、式(xii)、式(xiii)、式(xiv)、式(xv)、式(xvi)、式(xvii)、式(xviii)、式(xix)、式(xx)中的任意一种；
[0031][0032]
r基团为式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)、式(h)、式(i)、式(j)、式(k)、式(l)、式(m)、式(n)、式(o)、式(p)、式(q)、式(r)中的任意一种；
[0033][0034]
本发明的第二个目的是提供一种所述的自组装拟肽分子的制备方法，所述的方法是采用液相多肽合成方法，将连接子(二胺linker)与fmoc或boc保护的精氨酸(胍基上带修饰基团的)进行酸胺缩合偶联，合成所述的自组装拟肽分子，所述的精氨酸氨基酸中的胍基需要带修饰基团，且fmoc或boc保护的氨基需要脱保护暴露游离状氨基。将以图1中的g-15及j-14为例，其合成路线如下：
[0035][0036]
本发明的第三个目的是提供所述的自组装拟肽分子作为抗菌剂的应用。该自组装拟肽分子直接利用自组装特性与病原菌相互作用，达到显著的抑制细菌生长的作用。
[0037]
本发明的第四个目的是提供所述的自组装拟肽分子作为当前抗生素敏化的佐剂作用，如d-15拟肽分子与万古霉素联用可以对抗革兰氏阴性菌(如鲍曼不动杆菌)。
[0038]
实施例1：拟肽分子的液相合成
[0039]
下面以图1中g-15拟肽分子的合成为例对本发明的拟肽分子液相合成法进行说明，其余分子结构的合成与g-15类似。在分子合成的过程中，根据目标分子的修饰基团和连接linker，氨基酸选用fmoc或者boc保护。
[0040]
在以fmoc为氨基酸保护基的合成中，将精氨酸(fmoc-arg(pbf)-oh)和二胺linker分子混合，利用酸胺缩合剂将氨基酸和二胺进行偶联，具体制备过程如下(以g-15的制备为例)：
[0041]
(1)称取fmoc-arg(pbf)-oh氨基酸1296mg(2mmol)于圆底烧瓶中溶于无水dmf中。
[0042]
(2)称取4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物608mg(2.2mm，1eq)溶解在水中后加入烧瓶中常温搅拌30min对氨基酸进行活化。
[0043]
(3)称取二胺化合物(1eq)至烧瓶中，继续搅拌8-10h后，tlc监测反应情况，反应完成后，在冰水烧杯中搅拌下，将反应液直接缓慢加入搅拌的烧杯中，此时可看见大量白色沉淀析出。用布氏漏斗进行抽滤，去除溶剂得到白色固体粗产物。粗产物利用柱层析(二氯甲烷：甲醇20：1)进行纯化，得到目标化合物。
[0044]
(4)上一步的目标化合物溶解在四氢呋喃溶剂中，加入哌啶(终浓度为20％)，常温搅拌2h，旋干溶剂后得到粗产物，粗产物进行柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇5：1)得到目标化合物g-15。其h
1 nmr如图2所示。
[0045]
对于boc保护的拟肽，利用液相合成法将精氨酸(boc-arg(tip)-oh)和二胺linker分子混合，利用酸胺缩合剂将氨基酸和二胺进行偶联，具体制备过程如下(以j-14的制备为
例)：
[0046]
(1)称取boc-arg(tip)-oh氨基酸1080.58mg(2mmol)于圆底烧瓶中溶于无水dmf中。
[0047]
(2)称取4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物608mg(2.2mm，1eq)溶解在水中后加入烧瓶中常温搅拌30min对氨基酸进行活化。
[0048]
(3)称取二胺化合物(1eq)至烧瓶中，继续搅拌8-10h后，tlc监测反应情况，反应完成后，在冰水烧杯中搅拌下，将反应液直接缓慢加入搅拌的烧杯中，此时可看见大量白色沉淀析出。用布氏漏斗进行抽滤，去除溶剂得到白色固体粗产物。粗产物利用柱层析(二氯甲烷：甲醇20：1)进行纯化，得到目标化合物。
[0049]
(4)上一步的目标化合物溶解在二氯甲烷溶剂中，加入三氟乙酸(终浓度为20％)，常温搅拌2h，旋干溶剂得到粗产物，用乙醚打浆成盐，并用饱和碳酸氢钠清洗有机物，然后用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，真空旋干得到的粗产物进行柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇5：1)得到目标化合物j-14。
[0050]
实施例2：拟肽分子的抗菌活性和细胞毒性测试
[0051]
将纯化好的拟肽分子分别溶解在dmso中，采用标准肉汤稀释方法测试这系列拟肽对多种病原菌的抗菌活性，在测试这系列抗生素中，发现中间的连接linker和胍基上的修饰基团均对抗菌活性具有较大的影响，对于中间的连接linker而言，在该系列中中间linker为单一苯环时表现出强的抗菌活性；而对于胍基上的修饰基团，发现修饰基团的疏水性与抗菌活性之间存在正相关关系，即修饰基团越疏水时其抗菌能力越强。其抗菌结果见表1。
[0052]
拟肽分子的细胞毒性测试如下，将拟肽化合物在无菌的96孔板中用无菌pbs进行梯度稀释，将不同浓度的化合物溶液轻轻加入细胞培养液中，每孔加入20μl的化合物溶液，使其终浓度分别为(256，128，64，32，8，4，2μg/ml)，放入培养箱中静置培养24h。24h后，称量并配置好mtt溶液。将药物处理好的细胞小心的吸取孔中的培养液丢弃，每孔加入100μl无菌pbs清洗一遍后吸去pbs，在避光环境条件下加入0.5mg/ml的mtt溶液，放置在培养箱中静置1.5h。mtt孵育时间足够后，小心将mtt吸取干净，随后向每孔中加入100μl二甲基亚砜静置在37度培养箱中。随后立即使用酶标仪读取595nm处吸光度，随后使用graphpad处理数据，其结果如图3所示，在所测试的6个化合物中，拟肽系列均无显著毒性，因此所有拟肽化合物的细胞毒性均小于具有相似结构(线性对称结构)喷他脒和洗必泰化合物。化合物的毒性结果见表1。
[0053]
表1
[0054]
[0055][0056]
备注：ef：enterococcus faecium(屎肠球菌)；sa：staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)；masa：methicillin resistant staphylococcus aureus(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)；bs：bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)；pa：pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌)；kp：klebsiella pneumonia(肺炎克雷伯菌)；ab：acinetobacter baumannii(鲍曼不动杆菌)；ec：escherichia coli(肠杆菌属细菌)和ms：mycobacterium marinum(海洋分枝杆菌)；其中带有
“‑
1”的菌株为临床分离的多药耐药菌株；hc
50
：选用的血细胞是羊血细胞；ic
50
：选用的细胞是hek293t。
[0057]
实施例3：具有高效抗菌效果的抗菌拟肽g-15分子的自组装测试
[0058]
首先将纯的g-15拟肽溶解在dmso中，储液浓度为10.24mg/ml，在装有1ml pbs(ph＝7)缓冲液的ep管中加入25μl g-15储液，终浓度为256μg/ml，混匀后静置，可以明显看到溶液中形成的颗粒状组装体(如图4中的a所示)；接着使用盐酸溶液调节该体系的ph为5后，组装体消失，说明该拟肽分子的组装与ph值相关(如图4中的a所示)。硫黄素t(tht)是一种天然激发波长为385nm的荧光分子。当分子插入β-薄片结构时，激发波长移至450nm，发射波
长变为490nm。因此，可以利用tht作为荧光探针来检测g-15拟肽分子的组装情况，g-15拟肽的临界组装浓度(cmc)为50μg/ml(如图4中的b所示)。为进一步观测形成的颗粒情况，也通过激光共聚焦显微镜观察了形成的颗粒状，在测试的不同浓度中明显观察到最低形成组装体的浓度为大于64μg/ml，这与采用多种手段观察到的最低cmc值一致，图4c中显示了在128μg/ml浓度下，tht的浓度为5μm的情况下形成的颗粒。同时使用电子扫描显微镜(sem)观测形成的颗粒情况，该组装体是一种纤维状的聚集体(如图4中的d所示)。为了进一步确定这种组装体颗粒的大小，对溶液状态中的颗粒进行动态光散射(dls)表征，如图4中的e所示，形成的颗粒的尺寸大约在100-1000nm之间。由于该类拟肽中都含有双胍基团，这样的双胍基团是dna的结合基团，测试了g-15与dna的结合之后对dna本身的电泳迁移能力，发现当g-15的浓度达到32μg/ml能够很好地绑定dna(如图4中的f所示)；因此推测是否这种dna的结合能否促进拟肽本身的自组装行为，测试了在是否存在dna的情况下的拟肽cac值，发现在存在dna时拟肽的cmc值变得更小，因此使用32μg/ml的拟肽测试其荧光强度，发现在存在dna时其荧光强度时无dna时的4.7倍，这证实了拟肽结合dna确实能够诱导其自组装发生(如图4中的g所示)。且由于组装体形成了均一的颗粒，尝试用流式细胞仪对形成的颗粒进行检测，使用读取固定体积(40μl)中颗粒的数量来进行定量，发现在读取相同体积时发现在存在dna时相同体积中含有的颗粒数也远远大于无dna存在的情况(如图4中的h所示)。
[0059]
实施例4：g-15对细胞内空间分布扰动
[0060]
为验证在细菌体内发生dna诱导自组装行为，枯草芽孢杆菌作为模式菌株进行胞内dna诱导拟肽自组装行为进行实验观察，结果显示拟肽g-15处理枯草芽孢杆菌后，在细菌体内出现聚集体形成(图5中的a)。而对照组并未观察到这种聚集体现象(图5中的a)。胞内形成的自组装体充斥在细菌的胞质内(图5中的a)，这种自组装体可能影响胞内蛋白聚集体功能，为验证该猜想，建立了以parb聚集体发挥染色质精确分离功能的体外实验，通过实验证实，在存在dna时会导致相关聚集体功能的抑制。例如parb蛋白的ctp水解活性，rna合成量降低及蛋白的翻译产量下降(图5中的b)。进一步我们假设拟肽分子被细菌摄取后被细菌dna诱导成毒性组装体，最终导致细菌死亡。首先，金黄色葡萄球菌被拟肽g-15或者pbs处理后通过tem观察，结果显示正常金黄色葡萄球菌膜内表面会呈现适当的褶皱形貌(图5中的c)。这种内膜褶皱是相关蛋白正确存在形态。但是当用拟肽处理后这种褶皱逐渐消失，接着整个细菌膜出现破裂及内容物泄露，最终细菌死亡(图5中的c)。这种细菌内膜破坏现象提示我们该拟肽分子极有可能是通过细菌内dna诱导发生自组装导致胞内物质分布及破坏。为了验证这种组装体能够进一步导致细菌细胞内膜裂解。我们设计了如下实验，一个能够在细菌周质表达mcherry的大肠杆菌被构建。当拟肽在大肠杆菌中被dna诱导发生自组装后，该组装体接触与内膜发生相互作用，扰乱细菌内膜导致表达在细菌周质的mcherry蛋白发生泄露(图5中的d)。实验结果显示当将mcherry表达在细菌周质时，在confocal下观察到mcherry蛋白集中在细菌周质中(图5中的d)，经过g-15处理之后发现在菌体中充满着mcherry蛋白，显示整个菌体呈现出红色荧光(图5中的d)。
[0061]
实施例5：g-15的动物实验
[0062]
体内抗菌效果：鉴于金黄色葡萄球是社区和临床感染主要的病原菌，我们建立了三种金黄色葡萄球菌的体内感染模型进行抗菌拟肽治疗潜力的评估。首先我们建立了小鼠表皮伤口金黄色葡萄球菌感染模型进行感染治疗测试，给药后评估表皮伤口细菌载量(图6
中的a)，结果显示在给药第二天后可以明显降低小鼠伤口细菌载量(图6中的b)。拟肽处理组相较pbs处理组其细菌载量降低了1.4个lg cfu菌量(图6中的b)。在连续给药7天后，拟肽处理组表皮伤口的愈合率为73％显著优于pbs处理组的58％(图6中的c)且在整个治疗期间伤口愈合率也明显优于pbs对照组。整个治疗过程中显示小鼠的体重都稳步增长，表明拟肽化合物未表现出明显的副作用。接着我们进一步构建了金黄色葡萄球菌感染的小鼠皮下脓肿模型对拟肽进行体内疗效评估。结果显示小鼠主要脏器细菌载量均显著低于对照组pbs，甚至在脾和肾中，拟肽组的细菌载量还低于对照药物万古霉素(图6中的e)。这些实验结果进一步说明拟肽具有应用于更加复杂的细菌感染模型研究，我们知道金黄色葡萄球菌与血液感染密切相关，其血液感染造成的败血症在临床中具有非常高的致死率，因此我们将体内药效评估扩展到金黄色葡萄球菌血液感染败血症模型。拟肽被静脉注射(10mg/kg)治疗两次后开始观察统计老鼠死亡率，结果表明拟肽组和万古霉素均具有50％的存活率，无显著差异，而pbs组致死率为100％，表明药物处理组相较于pbs组能够明显提高感染后小鼠的存活率(图6中的f)。综上所述，拟肽在体内抗菌活性上表现优异，具有重大的潜在药物开发潜力。
[0063]
实施例6：j-14的合成
[0064]
对于boc保护的拟肽，利用液相合成方法将精氨酸(boc-arg(tip)-oh)和二胺linker分子混合，利用酸胺缩合剂将氨基酸和二胺进行偶联，具体制备过程如下(以j-14的制备为例)：
[0065]
(1)称取boc-arg(tip)-oh氨基酸1080.58mg(2mmol)于圆底烧瓶中溶于无水dmf中。
[0066]
(2)称取4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物608mg(2.2mm，1eq)溶解在水中后加入烧瓶中常温搅拌30min对氨基酸进行活化。
[0067]
(3)称取二胺化合物(1eq)至烧瓶中，继续搅拌8-10h后，tlc监测反应情况，反应完成后，在冰水烧杯中搅拌下，将反应液直接缓慢加入搅拌的烧杯中，此时可看见大量白色沉淀析出。用布氏漏斗进行抽滤，去除溶剂得到白色固体粗产物。粗产物利用柱层析(二氯甲烷：甲醇20：1)进行纯化，得到目标化合物。
[0068]
(4)上一步的目标化合物溶解在二氯甲烷溶剂中，加入三氟乙酸(终浓度为20％)，常温搅拌2h，旋转蒸法仪旋干溶剂得到粗产物，用乙醚打浆成盐，并用饱和碳酸氢钠清洗有机物，然后用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，真空旋干后的粗产物进行柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇5：1)得到目标化合物j-14。图7为j-14的h
1 nmr图。
[0069]
实施例7:lps诱导j-14拟肽自组装研究
[0070]
为了检测拟肽的自组装，我们进行了尼罗红染料试验，尼罗红是一种疏水染料，在水中不溶解，当化合物自组装时，可以通过荧光光谱检测该染料的发射波长，从而确定拟肽自组装的最低浓度。如图8中的a所示，拟肽的组装浓度(cmc)为42μg/ml。有趣的是，在存在额外的lps(16μg/ml)的存在下，拟肽的组装浓度变小为15.6μg/ml，这说明lps与拟肽的结合会影响拟肽的自组装能力，即lps会诱导拟肽在更低的浓度下发生自组装。为了进一步确定这种组装体颗粒的大小，对溶液状态中的颗粒进行动态光散射(dls)表征，如图8中的b所示，在拟肽128μg/ml时形成的颗粒的尺寸大约在100nm左右，而在lps的存在下，拟肽的粒径明显增大，尺寸大约为600nm左右，这说明lps会影响拟肽的粒径大小，将拟肽聚集成更大的
颗粒。且由于组装体形成了均一的颗粒，尝试用流式细胞仪对形成的颗粒进行检测，使用读取固定体积(40μl)中颗粒的数量来进行定量，发现在读取相同体积时发现在存在lps时相同体积中含有的颗粒数也远远大于无lps存在的情况(如图8中的c所示)。为了更加直观的观察拟肽的形态，使用电子扫描显微镜(sem)观测形成的颗粒情况，如图8中的d所示，拟肽单独的粒径是一个个约100nm的小球，加入额外的lps后，拟肽会聚集在一起形成粒径更大的球状颗粒，尺寸大小在450-750nm之间。这证实了拟肽结合lps确实能够诱导其自组装发生。
[0071]
实施例8：d-15的合成步骤
[0072]
d-15的制备如下：
[0073]
(1)称取fmoc-arg(pbf)-oh氨基酸1296mg(2mmol)于圆底烧瓶中溶于无水dmf中。
[0074]
(2)称取4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物608mg(2.2mm，1eq)溶解在水中后加入烧瓶中常温搅拌30min对氨基酸进行活化。
[0075]
(3)称取二胺化合物(1eq)至烧瓶中，继续搅拌8-10h后，tlc监测反应情况，反应完成后，在冰水烧杯中搅拌下，将反应液直接缓慢加入搅拌的烧杯中，此时可看见大量白色沉淀析出。用布氏漏斗进行抽滤，去除溶剂得到白色固体粗产物。粗产物利用柱层析(二氯甲烷：甲醇20：1)进行纯化，得到目标化合物。
[0076]
上一步的目标化合物溶解在四氢呋喃溶剂中，加入哌啶(终浓度为20％)，常温搅拌2h，旋干溶剂后得到粗产物，粗产物进行柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇5：1)得到目标化合物d-15。图9为d-15的h
1 nmr图。
[0077]
实施例9：拟肽分子d-15的敏化抗生素抗革兰氏阴性菌测试
[0078]
以d-15为敏化剂，以临床鲍曼不动杆菌(a.baumannii-77-1)为筛选对象，对32种重要抗生素和fda批准的非抗生素药物进行筛选。具体的抗菌能力的测试实验流程如下(操作过程无菌化，所有耗材都经过高压灭菌处理)：
[0079]
将过夜培养的细菌用新鲜无菌的mh培养基稀释至终浓度为5
×
105cfu/ml，以此作为固定细菌浓度的工作溶液，其中，96孔板中用的最终溶液体积为100μl，将培养物在37℃和220rpm下孵育16-18小时,并测量其在595nm波长处的吸光度。
[0080]
首先，我们对抗生素进行增敏筛选。抗生素使用的是如图10中的a所示的含有不同抗菌机制的代表性的32种重要抗生素。测定在上述培养条件下d-15的最低抑菌浓度(mic)后,对d-15对ia32(important antibiotics 32)抗生素增敏能力的测试，将过夜培养的细菌用新鲜无菌的mh培养基稀释至终浓度为5
×
105cfu/ml，以此作为固定细菌浓度的工作溶液a,将96孔板(8
×
12)铺满100μl的工作溶液a后，每种抗生素设置两组平行实验组，将药物用二倍稀释法稀释8个梯度，每块96孔板测5种抗生素，留两列一列加工作菌液a作为pc对照，另一列未接种细菌的mh培养基作为nc对照。将培养物在37℃和220rpm下孵育16-18小时,并测量其在595nm波长处的吸光度。可以测得每种抗生素本在该环境下对临床菌株a.baumannii-77-1的抗菌能力。然后，取同等量的工作溶液a，加入浓度为1/4mic的d-15，得到工作菌液b，类似的测试ia32在另添加1/4mic的d-15后，它们的抗菌能力，这样我们可以知道d-15可以增敏哪些抗生素。重复测试三次。
[0081]
通过上述测试，我们可以得到具有被d-15敏化抗临床菌株a.baumannii-77-1的抗生素，如10中的c所示。d-15可以敏化rifampicin、bacitracin、vancomycin等九种抗生素。
为了探究他们敏化能力的差别，我们对这九种抗生素和d-15进行的棋盘实验，得到的棋盘数据图如图10中的b所示，具体实验操作如下：
[0082]
将过夜培养的细菌a.baumannii-77-1用新鲜无菌的mh培养基稀释至终浓度为5
×
105cfu/ml，以此作为固定细菌浓度的工作溶液，用100μl固定菌液浓度的工作溶液铺满96孔板除最后一列以外的其余孔，并用100μl工作溶液在96孔板中将d-15纵向连续两倍稀释10次，将抗生素横向连续两倍稀释7次，最终两药形成一个8
×
11的具有不同浓度梯度组合的矩阵。此外，在96孔板的最后一列添加4个平行的新鲜无菌的mh培养基孔作为nc对照，4个平行的无任何药物处理的细菌工作溶液孔作为pc对照。在37℃下，将96孔板以220rpm的转速孵育16-24h，并测量其在595nm波长处的吸光度。每个药物组合至少包括两次独立实验。每个药物组合至少包括两次独立实验。评价药物联用是否存在协同作用的重要指标为分级抑制浓度指数(fici)：
[0083][0084]
其中mica和micb分别表示药物a与药物b单独的mic；mic
ac
和mic
bc
分别代表两药联用时药物a与药物b的mic。若fici≤0.5则表示两药协同(即增敏剂对另一药物具有增敏效果)。每个药物组合至少包括两次独立的棋盘实验，每对药物组合最终的fici值为多次所测fici值的平均值。
[0085]
实施例10：拟肽分子d-15的敏化fda批准的非抗生素抗革兰氏阴性菌测试
[0086]
我们使用来自fda化合物库(selleck chemicals，休斯顿，德克萨斯州)的1235种非抗生素化合物进行敏化筛选。筛选流程示意图如下图11中的a所示。
[0087]
首先，对fda库中的1375个非抗生素化合物初步筛选，得到了61个具有潜在被增敏抗菌的初步化合物。具体实验步骤如下：工作溶液的准备，将过夜培养的细菌a.baumannii-77-1用新鲜无菌的mh培养基稀释至终浓度为5
×
105cfu/ml，以此作为固定细菌浓度的工作溶液a；同等量的工作溶液a中加1/2mic的d-15得到工作溶液b。由于药物较多，我们使用384孔板进行初步筛选，在384孔板中每孔加30μl工作溶液a，并在每个孔中加入50μm的药物，工作菌液a作为pc对照。将mh培基溶液作为nc对照。在37℃下，将96孔板以220rpm的转速孵育16-24h，并测量其在595nm波长处的吸光度。这样可以知道这些fda批准的化合物本身是否具有抗临床菌株a.baumannii-77-1的能力。然后，将上述操作中的工作溶液换成含有1/4mic的工作溶液b,工作溶液b作为pc对照。将mh培基溶液作为nc对照。在37℃下，将96孔板以220rpm的转速孵育16-24h，并测量其在595nm波长处的吸光度。通过上述实验对比在不同溶液中的抗菌差异性，我们得到了61个可以被d-15增敏的药物，即在在工作溶液a中没有抗菌效果，而在工作溶液b中具有抗菌。筛选数据如图11中的b所示。并且对敏化筛选的质量的评估结果为良好。
[0088]
然后，为了探究这些初步筛选到的药物可以被d-15增敏的能力，我们进一步探究它们的敏化抗菌能力。通过比较这些药物可以被1/4mic的d-15被增敏的倍数，得到了16个可以被d-15被增敏至少4倍的优选药物。具体实验步骤如下：同fda非抗生素筛选的初步筛选的工作溶液的准备一样准备工作溶液a以及含1/4mic的d-15工作溶液b。将96孔板(8
×
12)铺满100μl的工作溶液a后，每种抗生素设置两组平行实验组，将药物用二倍稀释法稀释8个梯度，每块96孔板测5种抗生素，留两列一列加工作菌液a作为pc对照，另一列未接种细
菌的mh培养基作为nc对照。将培养物在37℃和220rpm下孵育16-18小时,并测量其在595nm波长处的吸光度。这样我们可以知道候选药物的被敏化的倍数，从而得到了16个就可以被敏化至少四倍的非抗生素药物。并将敏化能力与常见的增敏剂喷他脒比较，使用相同剂量的增敏剂，比较被敏化的这16个非抗生素在增敏剂存在下的mic值，值越小表明增敏剂增敏能力越强。增敏能力比较数据图如下图11中的d所示。
[0089]
然后，我们对这16个药物与d-15进行棋盘协同抗菌实验，得到了6个fici值小于0.2的非抗生素药物，它们分别是penfluridol、cinacalcet hcl、aripiprazole、toremifene citrate、tamoxifen和citrate ponatinib，其中penfluridol与#15协同抗菌的效果最好。棋盘数据表如下图11中的e所示。
[0090]
最后，对所有的筛选敏化实验进行了筛选质量的评估，评估结果如图11中的c所示。可以看出，整个筛选实验质量较高。
[0091]
实施例11：penfluridol促进拟肽分子d-15与lps的自组装
[0092]
尼罗红是一种环境敏感性的亲脂性染料，激发波长是550nm，在590nm发射。尼罗红在脂质丰富的环境中具有强烈的荧光，而在水溶液中荧光被猝灭。而由于d-15具有一定的亲疏水性，可能具有自组装能力，因此可以将尼罗红作为荧光探针来检测d-15拟肽分子的组装情况。
[0093]
第一步，用超纯水配制含有尼罗红5μm的荧光染料溶液。第二步，在包有锡纸的96孔板的3*12列中加入150μl的荧光染料溶液，在每列的第一孔中加入#15，使得孔中#15浓度为256μg/ml，然后另取150μl的荧光染料溶液，逐行稀释，最后一行不稀释。这样可得到系列#15初始浓度为128μg/ml的2倍稀释浓度梯度溶液，最后一行为染料背景值。第三步，配置好#15在荧光染料溶液中梯度稀释后的96孔板后，将96孔板用锡纸包裹后避光孵育30分钟。第四步，运用荧光仪，定激发波长扫描固定范围的发射波长测试第三步中配制的溶液的荧光。先测试不含d-15的荧光染料溶液作为背景测试，后从溶液中的#15的低浓度向高浓度测试。测试溶液体积为100μl，设置激发波长为550nm，扫描发射波长范围为570nm至750nm。实验重复两次以上。
[0094]
然后，选取最大发射波长的荧光强度随d-15浓度变化，如图12中的a所示。d-15具有荧光强度突增的行为，即d-15在水环境中的聚集行为变化，并且由尼罗红的性质得知d-15在水溶液环境中形成了疏水聚集体，可以判断d-15在该环境下可以自组装，并且称荧光突增的浓度称为d-15的临界胶束浓度(cmc)。由于d-15敏化抗革兰氏阴性菌的特性，我们近一步用革兰氏阴性菌特有的脂质lps探究lps对d-15的自组装行为的影响。首先，在荧光染料环境中加入16μg/ml的lps后，此浓度下的lps对荧光染料溶液发光的影响可以忽略不计。对溶液强度随d-15的浓度变化分析，如图12中的a所示，在加入lps后d-15的cmc值更小，即d-15自组装行为被增强，并且在相同d-15浓度下，加入lps后荧光强度更大。可以得出lps可以促进d-15的自组装行为。
[0095]
根据前面筛选可知penfluridol与d-15协同抗革兰氏阴性菌效果更好，我们想探究penfluridol会不会对d-15与lps自组装行为有影响。在含有16μg/ml的lps荧光染料环境中再加入52μg/ml的penfluridol，扣除背景的影响后对溶液荧光强度随d-15浓度变化分析，如图12中的a所示，发现在加入penfluridol后，d-15的cmc值比只加lps的d-15的cmc值更小，并且相同浓度下的d-15的溶液具有更高的荧光强度，可以推断出penfluridol可以促
进d-15与lps自组装。
[0096]
为了进一步确定这多组分种组装体的组装行为，对溶液状态中的颗粒进行动态光散射(dls)表征，如图12中的b所示，形成的颗粒的尺寸随溶液中组分的变化而变化，并且d
d-15+lps
《d
d-15
《d
d-15+lps+penfluridol
。综合上述荧光探针相关实验可以推测，在加入16μg/ml的lps后，与d-15本身相比，lps与d-15形成了更多的小颗粒，而在多加了penfluridol后，penfluridol促进了小颗粒之间的团聚行为，形成了更大的组装颗粒。且尝试用流式细胞仪对形成的颗粒进行检测，使用读取固定体积(50μl)中颗粒的数量来进行定量，发现在读取相同体积时发现在存在lps时相同体积中含有的颗粒数大于无lps存在的情况,与我们上述不同组份组装行为推测一致(如图12中的c所示)。
[0097]
在以上的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是以上描述仅是本发明的较佳实施例而已，本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，因此本发明不受上面公开的具体实施的限制。同时任何熟悉本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

技术特征：
1.一种自组装拟肽分子，其特征在于，具有如下通式：其中r1基团为式(i)、式(ii)、式(iii)、式(iv)、式(v)、式(vi)、式(vii)、式(viii)、式(ix)、式(x)、式(xi)、式(xii)、式(xiii)、式(xiv)、式(xv)、式(xvi)、式(xvii)、式(xviii)、式(xix)、式(xx)中的任意一种；r基团为式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)、式(h)、式(i)、式(j)、式(k)、式(l)、式(m)、式(n)、式(o)、式(p)、式(q)、式(r)中的任意一种；2.根据权利要求1所述的自组装拟肽分子，其特征在于，具有如下结构：
3.一种如权利要求1所述自组装拟肽分子的制备方法，其特征在于，采用液相多肽合成方法，将连接子与fmoc或boc保护的精氨酸进行酸胺缩合偶联，从而合成所述自组装拟肽分子，其中所述精氨酸中的胍基带有修饰基团，所述精氨酸中的氨基为可脱保护暴露游离状氨基。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述连接子为二胺化合物。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将精氨酸溶于无水dmf中；2)向步骤1)的溶液中加入活化剂对所述精氨酸进行活化；3)将二胺化合物加入步骤2)所得溶液中，搅拌，得到白色沉淀物，分离所述沉淀物。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：4)将步骤3)分离后的沉淀物溶解在四氢呋喃溶剂中，加入哌啶，常温搅拌，旋干溶剂得到粗产物，对粗产物进行纯化，从而得到所述拟肽分子。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述修饰基团为疏水性基团。8.一种如权利要求1所述自组装拟肽分子的自组装方法，其特征在于，通过lps诱导所述拟肽分子发生自组装。9.一种包括如权利要求1所述自组装拟肽分子的抗菌剂。10.一种包括如权利要求1所述自组装拟肽分子的抗生素敏化佐剂。

技术总结
本发明公开了一类阳离子对称的细菌诱导的抗菌自组装拟肽，其结构具有如下通式：这类分子的一级结构与天然多肽不同，不仅具有线性对称性，也具有抗菌作用，还可以作为敏化抗生素的抗菌佐剂。佐剂。佐剂。


技术研发人员：冯欣欣 白玉罡 杨安明 李家琦 李友智
受保护的技术使用者：湖南大学
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/23