一种双孢蘑菇多糖提取物及其制备方法和应用

1.本发明涉及天然药物开发领域，特别是涉及一种双孢蘑菇多糖提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)是心血管事件的主要促成因素，其死亡率是所有疾病中最高的，约占死亡原因的45％。动脉粥样硬化是一种慢性多因素疾病，主要特征为主动脉内壁脂质沉积、炎症反应、血管平滑肌细胞增殖等。目前常用于治疗as的药物为他汀类药物，但使用他汀类药物有着一定的副作用。
3.双孢蘑菇(agaricus bisporus)隶属于真菌界担子菌门、蘑菇纲、蘑菇目、蘑菇科、蘑菇属。双孢蘑菇在我国栽培广泛，产量大，且营养美味，其多糖具有抗肿瘤，抗氧化，肝保护等多种药理活性，具有重要的经济价值和药用价值。目前双孢蘑菇多糖改善动脉粥样硬化功效尚未见报道。因此，对其进行药用价值的开发和利用具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种双孢蘑菇多糖提取物及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该双孢蘑菇多糖提取物具有改善动脉粥样硬化、降血脂、抗炎症和抗氧化作用。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种双孢蘑菇多糖提取物，所述双孢蘑菇多糖提取物主要由半乳糖、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖组成，摩尔百分比分别为89.44％、7.41％、1.71％和1.22％。
7.优选的是，所述双孢蘑菇多糖提取物的连接方式为6-半乳糖、2,6-半乳糖、t-岩藻糖、t-半乳糖、6-甘露糖和3,6-半乳糖。
8.优选的是，所述双孢蘑菇多糖提取物abp的总糖含量为84.4％，分子量为9886da。
9.本发明还提供一种所述的双孢蘑菇多糖提取物的制备方法，包括：以双孢蘑菇子实体为原料，通过热水浸提、乙醇沉淀以及离子层析和葡聚糖凝胶层析进行分离纯化，获取双孢蘑菇多糖提取物。
10.优选的是，所述制备方法具体包括以下步骤：
11.(1)将双孢蘑菇菌粉在80℃热水中浸提，浸提液浓缩至原浓度1/10，加入无水乙醇至终浓度75％静止过夜后，离心去上清，收集沉淀冻干，得到双孢蘑菇粗多糖；
12.(2)将所述双孢蘑菇粗多糖溶解后，通过3次sevag试剂去蛋白，再通过透析、冻干，获得双孢蘑菇除蛋白多糖；
13.(3)将所述双孢蘑菇除蛋白多糖溶解后，利用阴离子柱层析法分离纯化得到中性多糖组分；在将所述中性多糖组分经葡聚糖凝胶层析法分离纯化得到双孢蘑菇多糖提取物。
14.优选的是，步骤(1)中，所述双孢蘑菇菌粉和热水的料液比为1g:30ml，浸提时间为
2h。
15.优选的是，步骤(2)中，所述sevag试剂为正丁醇和氯仿体积比1:4的混合溶液，透析条件为3500da截留量。
16.优选的是，步骤(3)中，所述阴离子柱层析法采用deae-52层析柱分离纯化，得到所述中性多糖组分；
17.所述葡聚糖凝胶层析法依次采用sephacryl s-400葡聚糖凝胶层析柱和superdex g-200葡聚糖凝胶层析柱分离纯化，得到所述双孢蘑菇多糖提取物。
18.本发明还提供所述的双孢蘑菇多糖提取物的应用，所述应用包括如下任一项：
19.(1)制备抗动脉粥样硬化药物中的应用；
20.(2)制备降血脂药物中的应用；
21.(3)制备抗炎和/或抗氧化药物中的应用；
22.(4)制备调控肠道菌群和/或肠道菌群相关代谢物水平药物中的应用。
23.本发明还提供一种药物组合物，包含所述的双孢蘑菇多糖提取物和药学上可接受的辅料。上述药物组合物可为常见的片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、散剂、微丸、溶液剂、糖浆剂、乳剂或注射剂。
24.本发明公开了以下技术效果：
25.本发明首次从天然食用菌双孢蘑菇中获得具有新颖结构和多种生物活性的中性多糖abp。本发明还通过实验证明，该多糖具有改善动脉粥样硬化，降血脂、抗炎症和抗氧化作用，可用于制备改善动脉粥样硬化药物、降血脂、抗炎症和抗氧化的药物中。本发明以无毒害副作用的天然产物药物进行改善动脉粥样硬化研究，为双孢蘑菇后续的开发和利用提供研究基础，具有重要的经济价值和市场价值。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为本发明双孢蘑菇多糖洗脱曲线；a：deae-52洗脱曲线，b：sephacryl s-400洗脱曲线，c：superdex g-200洗脱曲线；
28.图2为本发明abp单糖组成分析；a：标准单糖，b：abp；
29.图3为本发明abp对小鼠主动脉的动脉粥样硬化的改善作用的组织病理学切片图；
30.图4为本发明abp对hfd小鼠血脂的调控作用；a：tc；b：tg；c：ldl-c；d：hdl-c；n＝6，与ctrl相比
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p《0.001；与hfd组相比
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p《0.05，
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31.图5为本发明abp对hfd小鼠氧化应激的影响；a：血清中的sod；b：主动脉中的sod；c：血清中的ros；d：主动脉中的ros；n＝6，与ctrl相比
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p《0.05，
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p《0.01；与hfd组相比
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p《0.05，
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32.图6为本发明abp对hfd小鼠炎症反应的影响；(n＝6，与ctrl相比
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p《0.001；与hfd组相比
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p《0.001)；
33.图7为本发明abp对hfd小鼠肠道菌群的otu的韦恩图；
34.图8为本发明abp对hfd小鼠肠道菌群alpha多样性指数的箱线图；
35.图9为本发明abp对hfd小鼠肠道菌群beta多样性指数的样本二维排序图；
36.图10为本发明abp对hfd小鼠肠道菌群lefse分析图；
37.图11为本发明abp对hfd小鼠肠道菌群属水平物种组成热图；
38.图12为本发明abp对hfd小鼠肠道菌群metacyc预测丰度图；
39.图13为本发明abp对hfd小鼠盲肠内容物样本opls-da分析图；
40.图14为本发明abp对hfd小鼠盲肠内容物代谢物在各化学分类的数量占比图；
41.图15为本发明abp对hfd小鼠差异代谢物韦恩图；
42.图16为本发明abp对hfd小鼠差异代谢物关性热图；
43.图17为本发明abp对hfd小鼠差异代谢物kegg富集图。
具体实施方式
44.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
45.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
46.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
47.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
48.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
49.实施例1双孢蘑菇多糖提取物的制备
50.将双孢蘑菇子实体晒干，粉碎，将双孢蘑菇菌粉在80℃，液料比为1：30(ml/g)条件下提取2h；提取液浓缩至原浓度1/10，加入无水乙醇至终浓度75％静止过夜后，于5000r/min离心去上清，沉淀冻干后备用，得到双孢蘑菇粗多糖；
51.将冻干的粗多糖样品加入100ml去离子水溶解，通过3次300ml sevag试剂(正丁醇：氯仿＝1:4，v/v)去蛋白，再通过3500da截留量透析袋透析去除小分子后，旋转蒸发仪浓缩，并通过冷冻干燥机对其冷冻干燥，获得双孢蘑菇除蛋白多糖。
52.将双孢蘑菇除蛋白多糖用适量去离子水溶解，上样至deae-52层析柱，并用去离子水洗脱，洗脱速度为1ml/min，每管收集5ml，通过苯酚-硫酸法测定多糖含量，将含有多糖部分收集，获得中性多糖组分ab1，进一步将ab1上样至sephacryl s-400葡聚糖凝胶层析柱，
洗脱速度为1ml/min，每管收集5ml，分别获得多糖组分ab1-1、ab1-2，最后将ab1-2上样至superdex g-200葡聚糖凝胶层析柱，洗脱速度为1ml/min，每管收集3ml，获得双孢蘑菇多糖提取物abp(见图2)，冻干后干燥保存。上述deae-52层析柱洗脱曲线，sephacryl s-400葡聚糖凝胶层析柱洗脱曲线，以及superdex g-200葡聚糖凝胶层析柱洗脱曲线，见图1。对得到的abp进行苯酚-硫酸法测定多糖含量检测，结果得到双孢蘑菇多糖提取物abp的总糖含量为84.4％。
53.实施例2双孢蘑菇多糖abp单糖组成分析
54.称取适量样品溶解于1ml水，加4mol/l三氟乙酸1ml，110℃烘箱中水解5h，取出后冷却至室温，取0.1ml于4ml离心管中，在60℃真空干燥箱中干燥2h后，向离心管中加入0.05ml 0.3mol/l naoh，0.05ml pmp甲醇溶液，70℃水浴60min，取出后冷却至室温，加0.05ml 0.3mol/l hcl、0.75ml水、1.5ml氯仿，振荡摇匀后静置分层，弃去下层氯仿，如此反复萃取三次，水层过0.45μm滤膜，通过高效液相色谱进行检测。
55.结果如表1所示，结果表明，该多糖提取物主要由半乳糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖组成，摩尔百分比为89.44％、7.41％、1.71％、1.22％。
56.表1abp单糖组成结果
[0057][0058]
实施例3双孢蘑菇多糖abp的甲基化分析
[0059]
5mg多糖样品abp溶解至500μl dmso中。加入10mg naoh粉末，孵育30min。将样品冰浴冷却至样液凝固，充入氮气，加入0.1ml ch3i，反应30min，孵育期间控制水浴温度为18℃-20℃。冰浴冷却至样液凝固，再加0.1ml ch3i，反应30min。加入1ml 4mmol/lna2s2o3的水，终止甲基化反应。反应液中加入1ml氯仿，吸取下层氯仿相，重复萃取4次。合并氯仿相，加入1ml水，离心后除去水相，重复4次。合并滤液，在121℃下加入0.5ml2mol/l三氟乙酸水解120分钟，冷却至室温。加入0.5ml 10mg/ml nabd4，混匀室温反应2h，期间震荡数次，加入20μl乙酸中和终止反应。最后加入0.5ml吡啶乙酸酐混合液(吡啶：乙酸酐＝1:1，v/v)，120℃反应30min，冷却至室温，氮气吹干。加入1ml水静置10min，加入0.5ml二氯甲烷，涡旋震荡，离心，弃水相。重复水洗3次，取二氯甲烷相，过0.45μm滤膜上机。采用gc-ms系统分析，结果如表2所示，结果表明abp主要连接方式为6-gal、2,6-gal、t-fuc、t-gal、6-man、3,6-gal。
[0060]
表2abp甲基化结果
[0061][0062]
以下试验例为双孢蘑菇多糖的医用用途：
[0063]
试验例1：双孢蘑菇多糖abp改善高脂饮食(hfd)小鼠主动脉的动脉粥样硬化
[0064]
30只雄性c57bl/6j小鼠和45只apoe(-/-)小鼠(8周龄)，所有动物5只一笼，自由取食饮水。小鼠适应一周后，随机分为四组，空白对照组为30只c57bl/6j小鼠，apoe(-/-)小鼠随机分为模型组(hfd)，阳性对照组(hfd+rc)，多糖治疗组(hfd+abp)，每组15只。空白对照组每天喂养普通饲料，apoe(-/-)小鼠的三组每天给以高脂饲料，通过高脂饮食诱导建立动脉粥样硬化的动物模型。连续建模12周后，进行给药实验，空白对照组和模型组灌胃给药蒸馏水，阳性对照组灌胃给药瑞舒伐他汀钙(3mg/kg/d)，多糖治疗组灌胃给药abp溶液(100mg/kg/d)，实验周期4周。
[0065]
动物实验结束，取小鼠主动脉进行苏木精/伊红染色、油红o染色、movat五色法染色，进行组织病理学分析。
[0066]
(1)苏木精/伊红染色
[0067]
主动脉和胸腺组织用4％多聚甲醛溶液固定，在常温下保存。石蜡包埋，然后将标本切成标准的5μm切片，切片脱蜡和水。然后用苏木精对切片进行染色，水洗，置于分化液中30s，水洗，返蓝液返蓝后，水洗。脱水后，置于伊红染液浸染1min。梯度无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，用显微镜观察，对所呈现图像进行组织病理学分析。
[0068]
(2)油红o染色
[0069]
取出4％多聚甲醛固定液中的主动脉，用水洗涤并干燥。在黑暗条件下，将切片用油红溶液染色8-10分钟。然后将切片取出，停留3s，依次置于2缸60％异丙醇中3s和5s，并依次浸入纯水中停留10s两次。取出切片停留3s，在室温下将组织切片在苏木精中孵育5min，然后用3缸水分别洗涤5s、10s、30s。分化液分化8s后，用2缸水分别洗涤10s，置于返蓝液中1s，再次用2缸水分别洗涤5s、10s。组织切片用甘油明胶密封并在显微镜下观察。显微镜观察下细胞核呈蓝色，脂质呈红色。
[0070]
(3)movat五色法染色
[0071]
主动脉石蜡切片脱蜡，水洗。置于1％阿利新蓝溶液染色15min，放入碱性乙醇中3-5s进行分化。水洗干净后，依次使用evg染色和番红o酸性品红染色。再次分化后，用天狼猩红染色，水洗无水乙醇快速脱水3次，二甲苯透明，封片后显微镜下观察。
[0072]
双孢蘑菇多糖abp对主动脉动脉粥样硬化改善作用的结果如图3所示。空白对照组小鼠主动脉形态正常，只存在少量细点状红色脂滴。模型组小鼠受hfd诱导，小鼠的主动脉呈现脂质堆积，血管平滑肌细胞变性，有大块面积红色脂滴存在，该现象表明高脂饮食会造成主动脉内脂肪大规模积累。而abp给药后，红色脂滴面积显著减少，脂肪液滴积累现象明显得到了改善。movat染色结果表明，模型组主动脉弹力纤维面积比显著降低(p《0.01)，胶原纤维面积比显著增加(p《0.01)。蛋白聚糖面积比在四组对比中均没有显著变化。经abp给药后，小鼠主动脉胶原纤维面积比显著降低(p《0.05)，而弹力纤维面积比未有明显变化。结果表明abp给药对动脉粥样硬化的形成具有一定的改善作用。
[0073]
试验例2：双孢蘑菇多糖abp对hfd小鼠血脂的调控作用
[0074]
小鼠眼球取血，静置30min以上，4000r/min离心10min，取上清液，离心2次，得到血清样本，-80℃保存备用。按试剂盒说明书的要求，用试剂盒检测血清的tc、tg、ldl、hdl。
[0075]
结果如图4所示，双孢蘑菇多糖给药后，与模型组小鼠对比，小鼠tc水平下降了17.6％，tg水平下降27.6％，ldl-c水平下降17.2％(p《0.01)，与阳性药组趋势相同，均有显著降低。我们发现血清中hdl-c的含量变化不大，未有显著的变化趋势(p＞0.05)。abp能够有效减少高脂饮食小鼠血清中的tc、tg、ldl-c含量，具有显著的降血脂功能。
[0076]
试验例3：双孢蘑菇多糖abp对hfd小鼠主动脉炎症反应和氧化应激的影响
[0077]
主动脉组织匀浆：0.01g主动脉组织混合9倍体积生理盐水于1.5ml离心管。用组织研磨器以70hz参数匀浆120s，匀浆期间每隔30s于冰上静置3min以防止蛋白降解。12000rpm，离心5min，取上清液，重复2次，得主动脉组织匀浆液。市场常规购买的试剂盒并按照试剂盒说明书的要求，用试剂盒对应检测血清的sod、ros、tnf-α、il-6、il-1β、l-10、l-22、mcp-1指标。
[0078]
abp对hfd小鼠氧化应激的影响结果如图5所示，abp给药后，双孢蘑菇多糖给药组的ros水平显著下降，sod水平显著上升，与阳性药效果相似。结果表明，rc和abp给药，均能有效地缓解hfd小鼠体内血清和主动脉中相关的氧化应激因子，对小鼠主动脉氧化应激具有保护作用，进一步说明abp具有良好的体内抗氧化作用。
[0079]
abp对hfd小鼠炎症反应的影响结果如图6所示，hfd诱导下，导致动脉粥样硬化的发生，伴随着tnf-α和il等炎症细胞因子的改变，小鼠体内会产生一定程度的炎症反应。以阳性药物作为参考，在给予双孢蘑菇多糖abp后，小鼠血清和主动脉中tnf-α、il-6、il-1β、il-22、mcp-1水平降低，il-10水平增加，有效缓解了小鼠体内的炎症反应，从而证明abp对动脉粥样硬化的改善作用。
[0080]
试验例4：双孢蘑菇多糖abp对hfd小鼠肠道菌群的调控
[0081]
收集小鼠盲肠内容物，用细胞冻存管封存，液氮速冻，之后-80℃保存。对收集的肠道内容物根据说明书进行dna提取，用nanodrop分光光度计(thermo fisher scientific)分析dna纯度，并使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳分析提取dna的质量。对细菌16s rrna基因的v3-v4区进行聚合酶链反应(pcr)扩增。定量分析扩增产物，按样本需求进行混合。采用illumina平台对盲肠内容物dna进行双端(paired-end)测序。根据原始测序数据的结果，进行序列去噪和聚类。主要采用dada2和vsearch两种方法。高质量序列聚类以97％相似度为标准，得到otu丰度表以进行之后生物信息学分析。
[0082]
肠道菌群分析结果如图7-图12所示。alpha和beta多样性结果显示长期进食高脂
饮食会破坏正常小鼠盲肠内菌群的多样性和丰富度，abp给药后能够缓解这一现象，一定程度改善小鼠肠道微生物的多样性水平。物种组成热图进行进一步聚类树排序和筛选，abp喂食下23种属水平物种发生了显著改变，abp给药能够调节改善高脂饮食小鼠各菌群丰度，并通过菌群的改变来调控疾病的生成。
[0083]
试验例5：双孢蘑菇多糖abp对hfd小鼠肠道菌群非靶向代谢组学的影响
[0084]
(1)样本提取；将装有样品的冻存管置于4℃环境下缓慢解冻。取适量样本向其加入甲醇，乙腈和水混合液，超声30min后，置于-20℃冰箱10min。4℃下低温高速离心机，转速14000rpm离心20min，取上清液。将上清液真空干燥，加入1：1的100μl乙腈水溶液复溶，充分混合，以14000rpm离心15min，取上清液进样分析。
[0085]
(2)色谱条件：样品采用agilent 1290infinity lc超高效液相色谱系统(uhplc)hilic色谱柱进行分离。进样量2μl，样品置于4℃自动进样器中，流速0.5ml/min，柱温25℃。流动相a为乙酸铵-氨水，流动相b为乙腈。梯度洗脱程序：0—0.5min，为95％的b；0.5—7min，线性洗脱由95％—65％ b；7—8min，为65％—40％ b；8—9min，维持40％ b；9—9.1min，转变为40％—95％ b；9.1—12min，维持95％ b。
[0086]
(3)质谱条件：以ab triple tof 6600质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集。样本经过超高效液相色谱系统分离后，分别使用了电喷雾电离(esi)正负离子模式。
[0087]
进行检测：正/负离子喷雾电压分别为
±
5.5kv，辅助加热气和气帘气分别为60psi和30psi，扫描检测范围25—1000da，碰撞电压：35
±
15ev。
[0088]
(4)对样本经过色谱-质谱分析后得到的数据，首先进行代谢物结构鉴定、数据预处理，然后对实验数据进行质量检测分析，最后再进行数据处理。
[0089]
代谢物结构鉴定与分析：检测盲肠内容物样本代谢物的原始数据，比较数据库的信息，对代谢物进行结构鉴定和确认。统计盲肠内容物各组样本中代谢物的鉴定数量，并根据其化学分类归属的类别进行分类整合。
[0090]
单变量统计分析：单变量统计分析方法是最常用的统计分析方法之一，能够从某单一变量水平考察组内差别和组间差异。运用变异倍数分析的方法，认为fc》1.5或fc《0.67，pvalue《0.05的条件下，代谢物具有显著性，用火山图表现数据结果的差异性。
[0091]
多维统计分析：单变量分析无法精确分析高度相关的代谢物之间的差异性，所以需要运用多元统计的方法，如pca、opls-da分析等分析。采用正交-偏最小二乘判别分析(orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，opls-da)方法进行组间差异分析，各组的差异度以图像分布度表示。
[0092]
差异代谢物筛选：根据opls-da分析后所得到的数据结构进行筛选，选择条件p≤0.05且vip≥1的代谢物，认为具有显著性。筛选给与双孢蘑菇多糖后，hfd喂养的小鼠体内发生改变的相关差异代谢物。
[0093]
聚类分析：采用层次聚类(hierarchical cluster)进行聚类分析。通过计算样本互相之间的差距，找到距离最短的两个聚类，然后各个聚类进行合并，直到全部合并为同一个。通过此方法建立样本层次聚类树和显著性差异代谢物层次聚类热图。图中通过不同颜色代表表显著性上调或下调，颜色深浅表示上下调的程度，每行代表一个差异代谢物，每列代表一组盲肠内容物样品。
[0094]
相关性分析：对显著性差异代谢物之间的相关性进行分析，进一步了解双孢蘑菇
多糖给药过程中代谢物之间的相互调节关系。相关性分析的结果以相关性热图进行展示。
[0095]
(5)结果
[0096]
结果如图13-图17所示，模型组和空白组的小鼠盲肠内容物之间存在209个显著差异代谢物，模型组和abp组小鼠盲肠内容物之间存在29个显著差异代谢物，对比得到总共11种差异代谢物是相同的。从中筛选得到一种差异代谢物水苏碱(stachydrine)，其对心血管疾病的急性心肌缺血具有修复作用，同时水苏碱有效抑制动脉炎症因子渗出、主动脉组织水肿，血管内壁细胞通透性增加和慢性炎症纤维组织增生，对血管内皮及其细胞、抗凝血、舒张血管亦表现出良好的保护作用。说明abp能够通过调控肠道菌群差异代谢物的种类和丰度来改善动脉粥样硬化症状。
[0097]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种双孢蘑菇多糖提取物，其特征在于，所述双孢蘑菇多糖提取物主要由半乳糖、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖组成，摩尔百分比分别为89.44％、7.41％、1.71％和1.22％。2.如权利要求1所述的双孢蘑菇多糖提取物，其特征在于，所述双孢蘑菇多糖提取物的连接方式为6-半乳糖、2,6-半乳糖、t-岩藻糖、t-半乳糖、6-甘露糖和3,6-半乳糖。3.如权利要求1所述的双孢蘑菇多糖提取物，其特征在于，所述双孢蘑菇多糖提取物的分子量为9886da。4.一种如权利要求1-3任一项所述的双孢蘑菇多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括：以双孢蘑菇子实体为原料，通过热水浸提、乙醇沉淀以及离子层析和葡聚糖凝胶层析进行分离纯化，获取双孢蘑菇多糖提取物。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：(1)将双孢蘑菇菌粉在80℃热水中浸提，浸提液浓缩至原浓度1/10，加入无水乙醇至终浓度75％静止过夜后，离心去上清，收集沉淀冻干，得到双孢蘑菇粗多糖；(2)将所述双孢蘑菇粗多糖溶解后，通过3次sevag试剂去蛋白，再通过透析、冻干，获得双孢蘑菇除蛋白多糖；(3)将所述双孢蘑菇除蛋白多糖溶解后，利用阴离子柱层析法分离纯化得到中性多糖组分；在将所述中性多糖组分经葡聚糖凝胶层析法分离纯化得到双孢蘑菇多糖提取物。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述双孢蘑菇菌粉和热水的料液比为1g:30ml，浸提时间为2h。7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述sevag试剂为正丁醇和氯仿体积比1:4的混合溶液，透析条件为3500da截留量。8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述阴离子柱层析法采用deae-52层析柱分离纯化，得到所述中性多糖组分；所述葡聚糖凝胶层析法依次采用sephacryl s-400葡聚糖凝胶层析柱和superdex g-200葡聚糖凝胶层析柱分离纯化，得到所述双孢蘑菇多糖提取物。9.如权利要求1-3任一项所述的双孢蘑菇多糖提取物的应用，其特征在于，所述应用包括如下任一项：(1)制备抗动脉粥样硬化药物中的应用；(2)制备降血脂药物中的应用；(3)制备抗炎和/或抗氧化药物中的应用；(4)制备调控肠道菌群和/或肠道菌群相关代谢物水平药物中的应用。10.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的双孢蘑菇多糖提取物和药学上可接受的辅料。

技术总结
本发明公开了一种双孢蘑菇多糖提取物及其制备方法和应用，属于天然药物开发领域。所述双孢蘑菇多糖提取物的多糖含量为84.4％，分子量为9886Da，主要由半乳糖、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖组成，摩尔百分比分别为89.44％、7.41％、1.71％和1.22％，连接方式为6-半乳糖、2,6-半乳糖、T-岩藻糖、T-半乳糖、6-甘露糖和3,6-半乳糖。该双孢蘑菇多糖提取物对动脉粥样硬化具有改善作用，能够降低高脂饮食小鼠的血脂水平，改善其体内产生的炎症反应和氧化应激。本发明双孢蘑菇多糖提取物的制备方法简单，对于改善动脉粥样硬化药物或功能食品的开发提供研究基础。供研究基础。供研究基础。


技术研发人员：刘洋 孔凡格 舒昉 王迪 张子洋
受保护的技术使用者：吉林农业大学
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/23