一种辅助降血压类保健食品和/或中成药中可能添加的25种化学药物定性定量测定方法与流程

1.本发明涉及化学药物检测技术领域，尤其涉及一种辅助降血压类保健食品和/或中成药中可能添加的25种化学药物定性定量测定方法。


背景技术：

2.高血压(hypertension)是指以体内循环动脉血压(收缩压、舒张压)升高为主要特征，并伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损伤的临床综合征，是继糖尿病又一常见的慢性疾病也是心脑血管疾病的最主要危险因素之一。鉴于治疗高血压的合成化学药物常伴随有副作用，而这些由中药中提取的“纯天然”保健食品却不含有任何化学药物成分，不会对人体造成毒副作用，因此这些宣称具有辅助降血压的保健食品备受消费者的青睐。然而，不法商贩为了牟取暴利，利用消费者对保健食品的信赖，在这类型保健品中随意添加具有降血压作用的化学药物，若被消费者长期服用不但会耽误患者病情还会给其身心带来严重伤害，同时也给保健食品的非法添加监管带来了巨大的挑战。
3.目前临床上降压类药物有很多，按结构和药理作用主要分为：1)利尿剂(氢氯噻嗪、呋噻米)；2)α受体阻断剂(盐酸可乐定、利美尼定)；3)β受体阻断剂(普萘洛尔、阿替洛尔)；4)钙离子拮抗剂(二氢吡啶类：硝苯地平、氨氯地平；非二氢吡啶类：地尔硫卓、维拉帕米)；5)肾素血管紧张素-醛固酮系统抑制剂(血管紧张素ⅱ受体拮抗剂：坎地沙坦、阿利沙坦)；血管紧张素转换酶抑制剂(卡托普利、依那普利)。查询文献得知，检测此类保健食品中非法添加物涉及到的检测方法有薄层色谱法、表面增强拉曼光谱法、高效液相色谱法、超/高效液相-质谱法等。而这些方法效率低、方法复杂，不足以满足检测需求。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种辅助降血压类保健食品和/或中成药中可能添加的25种化学药物定性定量测定方法，建立了一种高效、准确、高通量检测保健食品中非法添加25种化学药物的高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱检测方法。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种辅助降血压类保健食品和/或中成药中可能添加的25种化学药物定性定量测定方法，包括以下步骤：
7.(1)分别配制25种化学药品的单品标准储备溶液；
8.(2)将25种化学药品的单品标准储备溶液分别与甲酸混合溶液配制每种化学药物的系列浓度标准工作液，进行高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定，以质量浓度为横坐标，对应的定量离子峰面积为为纵坐标，分别绘制上述25种化学药品的线性方程；
9.(3)供试品与甲醇混合，超声，取上清，滤膜过滤，取滤液高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定；记录供试品中各化合物的色谱保留时间及一级、二级质谱图，若与标准品色谱图的保留时间一致，且与标准品的母离子精确分子量误差不超过5
×
10-6
，二级离子
碎片丰度比与标准品一致，即可判定该样品中检出相应的目标化合物，将供试品定量离子峰面积带入线性方程计算含量。
10.作为优选，步骤(1)中所述25种化学药品为阿替洛尔、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、卡托普利、盐酸哌唑嗪、利血平、硝苯地平、苯磺酸氨氯地平、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平、坎地沙坦酯、奥美沙坦酯、阿利沙坦酯、替米沙坦酯、厄贝沙坦酯、氯沙坦钾、缬沙坦、他索沙坦、非马沙坦、阿奇沙坦、阿奇沙坦酯、依普罗沙坦、美托拉宗。
11.作为优选，步骤(1)中所述配制25种化学药品的单品标准储备溶液包括以下步骤：
12.25种化学药品分别与甲醇按照1mg～10mg：1ml～10ml的比例混合，240～260w，36～40khz超声处理8～12min，即得25种化学药品的1mg/ml的单品标准储备溶液。
13.作为优选，步骤(1)中所述25种化学药品的单品标准储备溶液稀释至100ng/ml。
14.作为优选，步骤(2)中所述甲酸混合溶液为甲酸水溶液与甲酸乙腈溶液按照体积比8.5～9.5:1混合。
15.作为优选，步骤(2)中所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.08～0.12％，甲酸乙腈溶液中甲酸的体积分数为0.08～0.12％。
16.作为优选，步骤(3)中所述供试品与甲醇混合的比例为供试品单次服用量与50ml甲醇混合；所述超声功率为240～260w，所述超声的频率为36～40khz，所述超声的时间为13～17min。
17.作为优选，步骤(3)中所述上清通过离心获得，所述离心的转速为7000～9000r/min，所述离心的时间为3～7min。
18.作为优选，步骤(3)中所述滤膜的孔径为0.20～0.24μm。
19.作为优选，步骤(3)中高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定的色谱条件为：
20.色谱柱：thermosyncronisc18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)；
21.柱温：25℃；
22.流动相：0.1％甲酸水溶液(a)、0.1％甲酸乙腈溶液(b)；
23.进样量：5μl；
24.体积流量：0.3ml/min；
25.梯度洗脱程序：共20min；0～1min，90％a；1～3min，90％～35％a；3～5min，35％a；5～5.1min，35％～10％a；5.1～8min，10％a；8～8.1min，90％～10％a；8.1～20min，10％a；
26.质谱条件为：
27.离子源：电喷雾电离离子源(esi)；扫描方式：正负离子扫描；全扫描分辨率140000(一级35000；二级17500)；检测方式：平行反应监测(prm)；喷雾电压：正离子3500v，负离子3000v；离子源温度：320℃；离子传输管温度：350℃；鞘气流速：30l/hr；辅助气流速：8l/hr；自动增益控制2
×
105；离子驻留时间100ms；隔离窗2.0m/z；25种降压类化合物的其它质谱采集参数如下表：
28.[0029][0030][0031]
*为定量离子。
[0032]
本发明提供了一种辅助降血压类保健食品和/或中成药中可能添加的25种化学药
物定性定量测定方法，涉及化学药物检测技术领域，包括以下步骤：(1)分别配制25种化学药品的单品标准储备溶液，稀释，混合，制备得混合标准溶液；(2)将25种化学药品的单品标准储备溶液分别与甲酸混合溶液配制每种化学药物的系列浓度标准工作液，进行高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定，分别绘制上述25种化学药品的线性方程；(3)供试品与甲醇混合，超声，取上清，滤膜过滤，取滤液高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定。根据保留时间、一级及二级质谱定性，峰面积带入线性方程定量。本发明建立了一种高效、准确、高通量检测保健食品中添加25种化学药物的高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱检测方法。
附图说明
[0033]
图1为阿替洛尔、盐酸可乐定、卡托普利、他索沙坦、美托拉宗、硝苯地平、尼群地平、尼索地平定量离子对的prm色谱图；
[0034]
图2为盐酸哌唑嗪、苯磺酸氨氯地平、利血平、厄贝沙坦酯、氯沙坦钾、阿奇沙坦、缬沙坦、阿利沙坦酯定量离子对的prm色谱图；
[0035]
图3为替米沙坦酯、奥美沙坦酯、依普罗沙坦、非马沙坦、阿奇沙坦酯、尼莫地平、非洛地平、坎地沙坦酯定量离子对的prm色谱图；
[0036]
图4为氢氯噻嗪定量离子对的prm色谱图；
[0037]
图5为dikmaspursilspursilc
18
柱化合物定量离子对的prm色谱图；
[0038]
图6为glsciencesc
18
柱化合物定量离子对的prm色谱图；
[0039]
图7为thermosyncronisc
18
柱化合物定量离子对的prm色谱图；
[0040]
图8为阿替洛尔化合物定量离子对的prm色谱图；
[0041]
图9为盐酸可乐定化合物定量离子对的prm色谱图；
[0042]
图10为盐酸哌唑嗪化合物定量离子对的prm色谱图；
[0043]
图11为舒压片中25种目标化合物在不同提取溶剂中的回收率；
[0044]
图12为银菊珍珠胶囊中25种目标化合物在不同提取溶剂中的回收率；
[0045]
图13为舒压片中25种目标化合物在不同提取时间的回收率；
[0046]
图14为银菊珍珠胶囊中25种目标化合物在不同提取时间的回收率；
[0047]
图15为舒压片中25种目标化合物在不同提取体积的回收率；
[0048]
图16为银菊珍珠胶囊中25种目标化合物在不同提取体积的回收率；
[0049]
图17为对照品溶液中盐酸可乐定的prm定量离子色谱图；
[0050]
图18为对照品溶液中美托拉宗的prm定量离子色谱图；
[0051]
图19为对照品溶液中阿奇沙坦酯的prm定量离子色谱图；
[0052]
图20为阳性样品溶液中盐酸可乐定的prm定量离子色谱图；
[0053]
图21为阳性样品溶液中美托拉宗的prm定量离子色谱图；
[0054]
图22为阳性样品溶液中阿奇沙坦酯的prm定量离子色谱图。
具体实施方式
[0055]
本发明提供了一种辅助降血压类保健食品和/或中成药中可能添加的25种化学药物定性定量测定方法，包括以下步骤：
[0056]
(1)分别配制25种化学药品的单品标准储备溶液，
[0057]
(2)将25种化学药品的单品标准储备溶液分别与甲酸混合溶液配制每种化学药物的系列浓度标准工作液，进行高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定，以质量浓度为横坐标，对应的定量离子峰面积为为纵坐标，分别绘制上述25种化学药品的线性方程；
[0058]
(3)供试品与甲醇混合，超声，取上清，滤膜过滤，取滤液高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定；记录供试品中各化合物的色谱保留时间及一级、二级质谱图，若与标准品色谱图的保留时间一致，且与标准品的母离子精确分子量误差不超过5
×
10-6
，二级离子碎片丰度比与标准品一致，即可判定该样品中检出相应的目标化合物。将供试品定量离子峰面积带入线性方程计算其含量。
[0059]
在本发明中，步骤(1)分别配制25种化学药品的单品标准储备溶液，将25种化学药品的单品标准储备溶液稀释，混合，制备得混合标准溶液；所述25种化学药品优选为阿替洛尔、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、卡托普利、盐酸哌唑嗪、利血平、硝苯地平、苯磺酸氨氯地平、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平、坎地沙坦酯、奥美沙坦酯、阿利沙坦酯、替米沙坦酯、厄贝沙坦酯、氯沙坦钾、缬沙坦、他索沙坦、非马沙坦、阿奇沙坦、阿奇沙坦酯、依普罗沙坦、美托拉宗；所述配制25种化学药品的单品标准储备溶液包括以下步骤：25种化学药品分别与甲醇按照比例混合，超声处理，即得25种化学药品的1mg/ml的单品标准储备溶液，所述25种化学药品与甲醇的混合比例分别优选为1mg～10mg：1ml～10ml，进一步优选为10mg：10ml，所述超声功率优选为240～260w，进一步优选为245～255w，再进一步优选为250w，所述超声频率优选为36～40khz，进一步优选为37～39khz，再进一步优选为38khz，所述超声时间优选为8～12min，进一步优选为9～11min，再进一步优选为10min，所述25种化学药品的单品标准储备溶液优选为稀释至100ng/ml。
[0060]
在本发明中，步骤(2)将25种化学药品的单品标准储备溶液分别与甲酸混合溶液配制每种化学药物的系列浓度标准工作液，进行高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定，以质量浓度为横坐标，对应的定量离子峰面积为纵坐标，分别绘制上述25种化学药品的线性方程；所述甲酸混合溶液优选为甲酸水溶液与甲酸乙腈溶液的混合溶液，所述甲酸水溶液与甲酸乙腈溶液的混合体积比优选8.5～9.5:1，进一步优选为8.6～9.4:1，再进一步优选为8.8～9.2:1；所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数优选为0.08～0.12％，进一步优选为0.09～0.11％，再进一步优选为0.10％，所述甲酸乙腈溶液中甲酸的体积分数优选为0.08～0.12％，进一步优选为0.09～0.11％，再进一步优选为0.10％。
[0061]
在本发明中，步骤(3)供试品与甲醇混合，超声，取上清，滤膜过滤，取滤液高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定；记录供试品中各化合物的色谱保留时间及一级、二级质谱图，若与标准品色谱图的保留时间一致，且与标准品的母离子精确分子量误差不超过5
×
10-6
，二级离子碎片丰度比与标准品一致，即可判定该样品中检出相应的目标化合物。将供试品定量离子峰面积带入线性方程计算其含量。所述供试品与甲醇混合的比例优选为供试品单次服用量与50ml甲醇混合，所述超声功率优选为240～260w，进一步优选为245～255w，再进一步优选为250w，所述超声的频率优选为36～40khz，进一步优选为37～39khz，再进一步优选为38khz，所述超声的时间优选为13～17min，进一步优选为14～16min，再进一步优选为15min；所述上清优选的通过离心获得，离心的转速优选为7000～9000r/min，进一步优选为7500～8500r/min，再进一步优选为7800～8200r/min，离心的时间优选为3～
7min，进一步优选为4～6min，再进一步优选为5min；所述滤膜的孔径优选为0.20～0.24μm，进一步优选为0.21～0.23μm，再进一步优选为0.22μm。
[0062]
在本发明中，步骤(3)中高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定的色谱条件优选为：
[0063]
色谱柱：thermosyncronisc18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)；
[0064]
柱温：25℃；
[0065]
流动相：0.1％甲酸水溶液(a)、0.1％甲酸乙腈溶液(b)；
[0066]
进样量：5μl；
[0067]
体积流量：0.3ml/min；
[0068]
梯度洗脱程序：共20min；0～1min，90％a；1～3min，90％～35％a；3～5min，35％a；5～5.1min，35％～10％a；5.1～8min，10％a；8～8.1min，90％～10％a；8.1～20min，10％a；
[0069]
质谱条件优选为：
[0070]
离子源：电喷雾电离离子源(esi)；扫描方式：正负离子扫描；全扫描分辨率140000(一级35000；二级17500)；检测方式：平行反应监测(prm)；喷雾电压：正离子3500v，负离子3000v；离子源温度：320℃；离子传输管温度：350℃；鞘气流速：30l/hr；辅助气流速：8l/hr；自动增益控制2
×
105；离子驻留时间100ms；隔离窗2.0m/z；25种降压类化合物的其它质谱采集参数如下表：
[0071]
[0072][0073]
*为定量离子。
[0074]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0075]
试剂与材料
[0076]
甲醇、乙腈(色谱纯，美国迪马公司)；甲酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲酸铵(色谱纯，上海阿拉丁生化科技有限公司)；乙酸铵(色谱纯，天津市科密欧化学
试剂有限公司)；0.22μm有机膜(江苏迈博瑞生物膜技术有限公司)；
[0077]
阿替洛尔(批号：100117-201606，纯度：99.7％)、盐酸可乐定(批号：100071-201607，纯度：100.0％)、氢氯噻嗪(批号：100309-201404，纯度：99.7％)、卡托普利(批号：100318-201904，纯度：99.7％)、盐酸哌唑嗪(批号：100164-201204，纯度：99.9％)、利血平(批号：100041-202015，纯度：99.0％)、硝苯地平(批号：100338-202107，纯度：/％)、苯磺酸氨氯地平(批号：100374-202106，纯度：99.9％)、尼群地平(批号：100585-201705，纯度：99.4％)、尼莫地平(批号：100270-201904，纯度：99.5％)、尼索地平(批号：100574-201702，纯度：99.4％)、非洛地平(批号：100717-201904，纯度：99.6％)、坎地沙坦酯(批号：100685-201903，纯度：99.8％)、奥美沙坦酯(批号：100864-201904，纯度：99.2％)、阿利沙坦酯(批号：101244-201101，纯度：99.5％)、替米沙坦酯(批号：100629-201803，纯度：99.9％)、厄贝沙坦酯(批号：100607-201804，纯度：100.0％)、氯沙坦钾(批号：100597-202104，纯度：99.4％)、缬沙坦(批号：100651-202006，纯度：99.0％)购于中国食品药品检定研究院；他索沙坦(批号：13416，纯度：97.74％)、非马沙坦(批号：13598，纯度：95.14％)、阿奇沙坦(批号：13552，纯度：98.98％)、阿奇沙坦酯(批号：13653，纯度：98.94％)、依普罗沙坦(批号：13505，纯度：98.38％)购于美国qcsrm公司；美托拉宗(批号：21081338，纯度：99.5％)购于北京坛墨质检科技股份有限公司。
[0078]
空白基质样品丹参菊花茶、银菊珍珠胶囊、舒压片及其他未检出样品均来自网购样品、药店及个人送检样品，阳性样品为自日常抽检工作所得。
[0079]
仪器:thermoqexactive液质联用仪(配esi源)(美国thermo公司)；thc-10b超声波提取器(济宁天华超声电子仪器有限公司)；3k15冷冻离心机(德国sigma公司)。
[0080]
实施例1
[0081]
精密称取阿替洛尔、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、卡托普利、盐酸哌唑嗪、利血平、硝苯地平、苯磺酸氨氯地平、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平、坎地沙坦酯、奥美沙坦酯、阿利沙坦酯、替米沙坦酯、厄贝沙坦酯、氯沙坦钾、缬沙坦、他索沙坦、非马沙坦、阿奇沙坦、阿奇沙坦酯、依普罗沙坦、美托拉宗这25种对照品10mg，分别置10ml容量瓶中，加入甲醇7ml，250w，38khz下超声处理10min，放冷至室温，用甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得质量浓度为1mg/ml的单品标准储备溶液，并于4℃下冷藏保存；将配制好的各化学药物的单品标准储备液进一步稀释成质量浓度为100ng/ml的混合标准溶液。考虑到地平类化合物对光有敏感性，操作时应避光。
[0082]
分别准确移取上述25种化学药物的单品标准储备溶液，用流动相(体积分数为0.1％甲酸水溶液：体积分数为0.1％甲酸乙腈溶液＝9:1，v:v)稀释成质量浓度为：含阿替洛尔、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、盐酸哌唑嗪、卡托普利、苯磺酸氨氯地平、他索沙坦、替米沙坦酯、利血平、奥美沙坦酯、美托拉宗、依普罗沙坦、阿奇沙坦、非马沙坦、缬沙坦、阿奇沙坦酯、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平、坎地沙坦酯标准品浓度为5、10、25、40、50、75、250、500ng/ml的系列标准曲线溶液；含厄贝沙坦酯、氯沙坦钾、硝苯地平、阿利沙坦酯标准品浓度为1、2、5、8、10、15、50、100ng/ml的系列标准曲线溶液。
[0083]
将网络和市售收集到宣称有辅助降血压的保健食品(包括片剂21批、胶囊剂15批、茶剂9批、口服液5批不同的基质类型)作为供试品，取供试品一次服用量，置棕色容量瓶中，加甲醇40ml，250w38khz下超声处理15min，放冷至室温，用甲醇定容至50ml，将样品溶液转
移至50ml离心管中，于8000r
·
min-1
离心5min；取上清液适量，经0.22μm有机系滤膜滤过，供高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定。
[0084]
色谱条件：thermosyncronisc18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)；柱温25℃；流动相为：0.1％甲酸水溶液(a)-0.1％甲酸乙腈溶液(b)；梯度洗脱共20分钟0～1min，90％(a)；1～3min，90％～35％(a)；3～5min，35％(a)；5～5.1min，35％～10％(a)；5.1～8min，10％(a)；8～8.1min，90％～10％(a)；8.1～20min，10％(a)；进样量5μl；体积流量0.3ml/min。
[0085]
质谱条件：离子源：电喷雾电离离子源(esi)；扫描方式：正负离子扫描；全扫描分辨率140000(一级35000；二级17500)；检测方式：平行反应监测(prm)；喷雾电压：正离子3500v,负离子3000v；离子源温度：320℃；离子传输管温度：350℃；鞘气流速：30l/hr；辅助气流速：8l/hr；自动增益控制2
×
105；离子驻留时间100ms；隔离窗2.0m/z；25种降压类化合物的其它质谱采集参数见表1。
[0086]
与标准质谱库比对，通过初筛判断有3批保健食品检出，分别检出可乐定(15mg/g)、阿奇沙坦(7.8mg/g)，其中一批同时检出阿奇沙坦(12mg/g)和美托拉宗(11mg/g)，阳性样品中药物添加的浓度范围为2.5～5μg/g，典型的prm色谱图见图17～图22。
[0087]
表125种降压类化合物的质谱采集参数
[0088]
[0089][0090]
注：*为定量离子。
[0091]
实验例1
[0092]
质谱、色谱条件优化
[0093]
采用实施例1所述的相同方法配制好混合标准溶液，并将其分别进行正负离子全扫描，结果发现除氢氯噻嗪在负离子模式下响应较高外，其余24种化合物均在正离子模式下响应高。在此基础上通过质谱外接注射器进样，将25种化合物的混合溶液注入离子源中
进行一级质谱分析(fullms-ms)确定25种化合物的准分子离子，接着对其进行二级质谱分析(aif-ms/ms)得到相应的子离子信息。采用质谱masstraces模块，观察变化曲线趋势图，挑选出离子对应的最佳碰撞值。
[0094]
表1列举了25种化合物的扫描模式、碰撞能量、实测质量数与理论质量数，且质量偏差值均小于5
×
10-6
，表明hplc-q/orbitraphrms可以提供较高的可信度。
[0095]
考虑到化合物多且结构复杂，故对比甲醇、乙腈、0.1％甲醇、0.1％乙腈作为有机溶剂时各化合物的分离及响应情况，结果表明各化合物在乙腈中峰形较好、无拖尾现象且乙腈可以得到较低的柱压，当乙腈中加入0.1％甲酸时发现化合物的离子响应强度增强，故选择0.1％甲酸乙腈作为有机相；考察了0.1％甲酸水溶液、0.5％甲酸水溶液，5mmol/l甲酸铵水溶液、5mmol/l乙酸铵水溶液4种水相条件，结果发现甲酸铵与乙酸铵的加入使得部分化合物的色谱峰拖尾加重，当加入0.1％的甲酸时，色谱峰的峰型可改善峰型，且目标物的响应更灵敏，整体可满足检测需求，而加入0.5％甲酸时发现与0.1％甲酸无较大差别，故最终选择a相(0.1％甲酸水溶液)和b相(0.1％甲酸乙腈溶液)为流动相，优化条件后的25种化合物色谱图见图1～图4。
[0096]
在色谱柱的选择上，对比了实验中常用到的c18色谱柱：thermosyncronisc18柱(2.1nm
×
100nm,1.7μm)；dikmaspursilspursilc
18
柱(2.1
×
100nm,3μm)；glsciencesc
18
柱(4.6nm
×
150nm,3μm)的分离效果。结果见图5～图7，glsciencesc
18
色谱柱部分目标化合物峰展宽现象明显，thermosyncronisc
18
柱分离效果强，化合物保留时间稳，而dikmaspursilspursilc
18
色谱柱较thermosyncronisc
18
柱分离效果弱，故实验选择thermosyncronisc
18
色谱柱，见图5～图7。
[0097]
在稀释剂的选择上，对比了初始比例流动相(0.1％甲酸水：0.1％甲酸乙腈溶液＝9:1,v:v)与甲醇两种条件，结果发现阿替洛尔、盐酸可乐定、盐酸哌唑嗪出峰时间较早、色谱保留弱，有机相含量低易发生二次分配，当甲醇为稀释剂时，部分目标化合物峰型分叉等，而当初始比例流动相(0.1％甲酸水：0.1％甲酸乙腈溶液＝9:1,v:v)稀释进样时，不仅解决了溶剂效应，还改善了峰型，故实验选择初始比例流动相(0.1％甲酸水：0.1％甲酸乙腈溶液＝9:1,v:v)为稀释剂，见图8～图10。
[0098]
实验例2
[0099]
选择舒压片和银菊珍珠胶囊为基质样品，在这两种空白基质样品中加入混合标准溶液0.2ml10μg进行提取效率的考察。分别考察50ml的甲醇、50％甲醇、乙腈、50％乙腈25种目标化合物提取回收率的影响。4种提取溶液对两种基质样品中的目标化合物提取浓度结果显示(见图11和图12)，甲醇的提取浓度明显高于乙腈，说明25种化合物在甲醇中均有一定的溶解性且回收率能达到75.00％以上。综合考虑，最终选择甲醇为提取溶剂。
[0100]
选择舒压片和银菊珍珠胶囊为基质样品，在这两种空白基质样品中加入混合标准溶液0.2ml进行提取效率的考察。分别考察超声时间(5、10、15、20min)对添加25种目标化合物回收率值的影响，结果发现(见图13和图14)两种基质样品中的回收率值在超声时间为15min时均能达到73.23～98.02％。说明提取15min既可把目标成分提取出来同时又避免基质自身中含有成分被提出过多，且响应更灵敏。
[0101]
选择舒压片和银菊珍珠胶囊为基质样品，在这两种空白基质样品中加入混合标准溶液0.2ml进行提取效率的考察。分别考察提取固液比[1:5(5ml)、1:10(10ml)、1:25
(25ml)、1:50(50ml)]对添加25种目标化合物回收率值的影响,结果发现加标回收率随固液比的增大而升高(见图15和图16)，当固液比为50ml时添加的目标化合物回收率值达83.91％以上，表明保健食品中基质复杂，存在不同程度基质效应，但随着甲醇用量的增多，基质效应逐渐消减，故选择固液比1：50为提取液体积。
[0102]
实验例3
[0103]
高分辨质谱数据库的建立
[0104]
自建上述25种目标化合物一级精确质量数据库与二级碎片离子数据库。按照上述优化好的实验条件，取25种目标化合物的混合标准溶液(100μg/l)进行质谱扫描，连续进样6次，获得25种目标化合物的保留时间、一级、二级离子质量数等信息，利用质谱自带软件xcalibur选取出与理论值偏差值小于5
×
10-6
的一级分子离子，筛选出对应的二级碎片离子信息。目标化合物检出判定方法：化合物通过与数据库中的质谱图、一级精确分子离子质量数、二级碎片离子质量数及丰度比、保留时间等参数比对而自动鉴别每个峰的候选物质。具体信息可参考表1。
[0105]
定性判断
[0106]
按照高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱法中质谱条件测定样品和混合标准工作液，实时记录样品和混合标准工作液中各目标化合物的色谱保留时间及一级、二级质谱图，当样品中检出与标准品色谱图(或标准品建立的质谱库)时间保留一致的色谱峰，并与标准品的母离子精确分子量误差不超过5
×
10-6
，二级离子碎片丰度比一致，即可初步确定样品中检测出相应的目标化合物。
[0107]
实验例4方法学考察
[0108]
专属性实验
[0109]
分别取空白基质样品，按照实施例1所述方法，取基质样品溶液各5μl，色谱和质谱进样分析，在所得到的3种空白基质样品溶液的tic图和prm色谱图，均未检出上述25种降压类化学成分的色谱峰。另取空白基质各1份，加入混合标准溶液适量，得到添加对照样品溶液，进样测定，结果显示均能检出上述25种降压类化学成分的色谱峰，说明这3种空白基质中所含成分均不干扰上述目标化学成分，方法专属性强。
[0110]
线性关系、检出限与定量限
[0111]
利用四极杆/轨道阱高分辨质谱技术一级离子的高精确性和高分辨率进行定量分析，研究采用prm扫描模式：一次扫描完成一、二级离子的定性分析，同时也利用一级离子完成了对25种目标化合物的定量分析。将系列不同质量浓度的标准曲线溶液在正、负离子模式下分别进样测定，以定量监测离子对的质量浓度(ng/ml)为x-轴，对应的平均峰面积为y-轴，绘制标准曲线，进行回归分析。结果表明，所有目标化合物的线性关系良好，r值均大于0.99。
[0112]
取空白基质样品，按0.25μg/g的添加量加入混合标准溶液，逐级稀释后进样，以s/n＝10时计算各目标化合物的定量限(loq)，和s/n＝3时的检出限，结果表明，25种化合物的检出限在0.3～2.0ng/ml，说明该方法具有较高的灵敏度，完全可以满足非法添加降压类化学药物的检测要求，详见表2。
[0113]
表225种降压类药物的线性方程、线性范围、相关系数检出限和定量限
[0114][0115][0116]
加标回收率与精密度
[0117]
取片剂、胶囊剂、茶剂的空白基质采用低、中、高3个浓度(厄贝沙坦、阿利沙坦酯、氯沙坦钾、硝苯地平浓度为1、2、10ng/ml；其余21种浓度为5、10、50ng/ml)制备样品溶液，每个水平平行做6份，提取后进样测定，计算回收率值及精密度。结果表明，25种降压类化合物回收率范围在81.0％～108.1％，相对标准偏差为1.0％～4.9％，可符合方法学验证要求。
[0118]
表325种降压类药物在3种基质中的加标回收率和精密度(n＝6,％)
[0119]
[0120][0121]
重复性实验
[0122]
取空白基质样品溶液共6份，分别精密加入混合标准溶液适量，使各成分的浓度为标曲中间点浓度(10、50ng/ml)，提取后，色谱、质谱条件测定，计算各目标化合物的含量及rsd值。结果阿替洛尔、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、盐酸哌唑嗪、卡托普利、苯磺酸氨氯地平、他索沙坦、替米沙坦酯、利血平、奥美沙坦酯、厄贝沙坦酯、美托拉宗、氯沙坦钾、依普罗沙坦、阿奇沙坦、非马沙坦、缬沙坦、硝苯地平、阿奇沙坦酯、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、阿利沙坦酯、非洛地平、坎地沙坦酯的平均含量分别为0.43、0.47、0.51、0.52、0.49、0.50、0.49、0.48、0.51、0.58、2.51、0.49、2.50、0.52、0.52、0.47、0.43、2.49、0.48、0.51、0.49、0.45、2.51、0.50、0.47μg/g(n＝6)；rsd值分别为4.7、3.2、3.3、1.9、2.3、3.2、3.8、2.9、1.8、4.1、3.8、4.8、1.2、2.6、3.0、2.5、4.7、3.1、2.9、1.9、2.2、3.2、4.5、3.8、2.9％(n＝6)，表明此方法重复性较好。
[0123]
稳定性实验
[0124]
取重复性项下其中一份供试品溶液，在配制后分别避光放置0、2、4、6、8、12h，色
谱、质谱条件测定，根据上述25种目标化合物定量离子对的色谱峰面积计算rsd值，结果表明，各成分的rsd值为1.7％～4.6％，供试品溶液在12h内稳定性良好。
[0125]
本发明充分利用hplc-q/orbitraphrms技术的优势，将快筛、验证技术与准确定量统一结合，既节省了人力物力又提升了非法检测工作效率。针对市售具有宣称辅助降血压的保健食品，建立了一种20min内对非法添加的25种降血压类化学药物检测的高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱法，样品在一次提取进样后，利用色谱峰保留时间、一级精确质量数、二级精确质量数及丰度比，即可实现对样品的靶标筛查与定性、定量分析，并判断样品中是否存在此类非法添加。该方法过程简便、分析时间短，准确性高、灵敏度高，可对保健食品中非法添加化学药物提供技术支持，同时对维护消费者的自身利益，具有重要意义。
[0126]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种辅助降血压类保健食品和/或中成药中可能添加的25种化学药物定性定量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别配制25种化学药品的单品标准储备溶液；(2)将25种化学药品的单品标准储备溶液分别与甲酸混合溶液配制每种化学药物的系列浓度标准工作液，进行高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定，以质量浓度为横坐标，对应的定量离子峰面积为为纵坐标，分别绘制上述25种化学药品的线性方程；(3)供试品与甲醇混合，超声，取上清，滤膜过滤，取滤液高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定；记录供试品中各化合物的色谱保留时间及一级、二级质谱图，若与标准品色谱图的保留时间一致，且与标准品的母离子精确分子量误差不超过5
×
10-6
，二级离子碎片丰度比与标准品一致，即可判定该样品中检出相应的目标化合物，将供试品定量离子峰面积带入线性方程计算含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述25种化学药品为阿替洛尔、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、卡托普利、盐酸哌唑嗪、利血平、硝苯地平、苯磺酸氨氯地平、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平、坎地沙坦酯、奥美沙坦酯、阿利沙坦酯、替米沙坦酯、厄贝沙坦酯、氯沙坦钾、缬沙坦、他索沙坦、非马沙坦、阿奇沙坦、阿奇沙坦酯、依普罗沙坦、美托拉宗。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述配制25种化学药品的单品标准储备溶液包括以下步骤：25种化学药品分别与甲醇按照1mg～10mg：1ml～10ml的比例混合，240～260w，36～40khz超声处理8～12min，即得25种化学药品的1mg/ml的单品标准储备溶液。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述25种化学药品的单品标准储备溶液稀释至100ng/ml。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述甲酸混合溶液为甲酸水溶液与甲酸乙腈溶液按照体积比8.5～9.5:1混合。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.08～0.12％，甲酸乙腈溶液中甲酸的体积分数为0.08～0.12％。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述供试品与甲醇混合的比例为供试品单次服用量与50ml甲醇混合；所述超声功率为240～260w，所述超声的频率为36～40khz，所述超声的时间为13～17min。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述上清通过离心获得，所述离心的转速为7000～9000r/min，所述离心的时间为3～7min。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述滤膜的孔径为0.20～0.24μm。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定的色谱条件为：色谱柱：thermo syncronis c18色谱柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)；柱温：25℃；流动相：0.1％甲酸水溶液(a)、0.1％甲酸乙腈溶液(b)；进样量：5μl；体积流量：0.3ml/min；
梯度洗脱程序：共20min；0～1min，90％a；1～3min，90％～35％a；3～5min，35％a；5～5.1min，35％～10％a；5.1～8min，10％a；8～8.1min，90％～10％a；8.1～20min，10％a；质谱条件为：离子源：电喷雾电离离子源(esi)；扫描方式：正负离子扫描；全扫描分辨率140000(一级35000；二级17500)；检测方式：平行反应监测(prm)；喷雾电压：正离子3500v，负离子3000v；离子源温度：320℃；离子传输管温度：350℃；鞘气流速：30l/hr；辅助气流速：8l/hr；自动增益控制2
×
105；离子驻留时间100ms；隔离窗2.0m/z；25种降压类化合物的其它质谱采集参数如下表：
*为定量离子。

技术总结
本发明提供了一种辅助降血压类保健食品和/或中成药中可能添加的25种化学药物定性定量测定方法，涉及化学药物检测技术领域，包括以下步骤：(1)分别配制25种化学药品的单品标准储备溶液，稀释，混合，制备得混合标准溶液；(2)将25种化学药品的单品标准储备溶液分别与甲酸混合溶液配制每种化学药物的系列浓度标准工作液，进行高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定，分别绘制上述25种化学药品的线性方程；(3)供试品与甲醇混合，超声，取上清，滤膜过滤，取滤液高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱仪测定。本发明建立了一种高效、准确、高通量检测保健食品中添加25种化学药物的高效液相-四极杆/轨道阱高分辨质谱检测方法。四极杆/轨道阱高分辨质谱检测方法。四极杆/轨道阱高分辨质谱检测方法。


技术研发人员：董培智 刘晓普 张禄 赵丽红 申国华 任静
受保护的技术使用者：山西省检验检测中心（山西省标准计量技术研究院）
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/23