三叶木通花青素合成调控基因AtrANS及其编码蛋白和应用的制作方法

三叶木通花青素合成调控基因atrans及其编码蛋白和应用
技术领域
1.本发明属于三叶木通种植技术领域，尤其涉及一种三叶木通花青素合成调控基因atrans及其编码蛋白和应用。


背景技术：

2.三叶木通(akebia trifoliate(thunb.)koidz.)隶属木通科木通属，作为一种野生藤本果树，广泛分布于中国20多个省市，药、食、油和赏兼用，营养丰富，适种区域广，增产潜力大，经济效益高。三叶木通果皮颜色多样，在未成熟时呈绿色，成熟时颜色发生巨大变化，转变为白色、粉色、紫色等颜色。三叶木通具有重要的食用和观赏价值，作为一种新型水果，三叶木通果皮的颜色、果实的形状、大小等外观品质直接影响其商品价值，果皮颜色作为三叶木通一项重要的农艺性状，只有当果实成熟到一定程度后，才能表现出良好的色泽、风味和品质，果实的外观颜色是果实各项性能是否满足人们购买需求、是否成熟的最直观体现，意义重大。作为一种观赏植物，观果也是一项重要的内容，颜色是观赏植物最重要的观赏性状之一，色素代谢在观赏植物中一直是研究热点。
3.花青素是一类重要的黄酮类化合物，来自苯丙酸/类黄酮生物合成途径，是一种糖基化的多酚化合物，属于植物次生代谢产物的一大类，在花、种子、果实和营养组织中具有蓝色到红色到紫色等一系列颜色。在三叶木通中它是决定果皮颜色的主要色素物质，影响着三叶木通的果实品质，着色差的果实很难在市场上获得消费者的认可。花青素作为一种具有天然生物活性的植物色素，不仅具有强抗氧化性，其在营养器官中的合成和积累对植物适应和抵抗恶劣环境条件至关重要，可以增强植物对不同生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。此外，富含花青素的食物因其诱人的颜色和对人体健康的益处而越来越受欢迎。如预防心血管疾病、减少糖尿病、控制肥胖等。
4.ans(花青素合成酶)是花青素合成途径中后期第2个关键酶，是一种依赖于feii/2-氧戊二酸的双加氧酶，能催化c-4的去羟基化，并在c环上形成一个双键，将无色的花青素转化为有色的花青素，对植物的色彩形成至关重要。一些报道揭示ans参与调控花青素的生物合成，洋葱鳞片中ans基因发生点突变，使巴西黄洋葱和美国红洋葱鳞片颜色发生改变；桃中的重组ppans蛋白可以催化无色花青素形成花青素；洋葱的粉色性状与ans基因的突变相关，其表达量在粉色洋葱中显著降低；而ans过表达使水稻(oryza sativa l)植株中的类黄酮物质和花青素的积累增加，种皮呈现紫红色。这些结果说明了ans基因可以参与植物花青素的生物合成。目前ans基因在三叶木通花青素合成中的作用还未见报道。
5.目前有关于三叶木通花青素生物合成调控研究有限，因此挖掘三叶木通花青素生物合成调控的候选基因，可为三叶木通或其它木通属的品质改良与分子育种提供理论与技术支持。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一
种三叶木通花青素合成调控基因atrans及其编码蛋白和应用。
7.为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
8.一种三叶木通花青素合成调控基因atrans，其核苷酸序列如seq id no：1所示。
9.一种用于克隆如权利要求1所述基因atrans的引物对，其碱基序列如下：
10.上游引物：5'-aattgcaccaagacgaaa-3'(如seq id no：3所示)；
11.下游引物：5'-aatgtcatcaagagtggtac-3'(如seq id no：4所示)。
12.一种过表达载体，包括载体pbi121-gfp，在所述载体pbi121中包含如权利要求1所述基因atrans。
13.一种用于构建如权利要求3所述过表达载体的引物对，其碱基序列如下：
14.上游引物：5'-gagaacacgggggactctagaatggcaacacaagtagagtaaagtt aca-3'(如seq id no：5所示)；
15.下游引物：5'-gctcaccatggatcctctagattatttggagaggagagtttcttgg-3'(如seq id no：6所示)。
16.一种病毒诱导的基因沉默载体，包括载体trv2，在所述载体trv2中包含如权利要求1所述基因atrans。
17.一种用于构建如权利要求5所述基因沉默载体的引物对，其碱基序列如下：
18.上游引物：5'-aaggttaccgaattctctagaactaaaggctgttggtgaagcttt-3'(如seq id no：7所示)；
19.下游引物：5'-tccccatggaggccttctagaatctctatggtgtccccaatgtg-3'(如seq id no：8所示)。
20.一种基因atrans的编码蛋白，其氨基酸序列如seq id no：2所示。
21.基于一个总的发明构思，本发明还提供一种基因atrans在提升三叶木通果皮中花青素含量的应用。
22.基于一个总的发明构思，本发明还提供一种基因atrans在培育高花青素植物新品种中的应用。
23.优选的，所述植物为三叶木通。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
25.1、本发明首次发现三叶木通花青素合成调控基因atrans，并公开了其核苷酸序列及其编码蛋白的序列，通过在三叶木通中瞬时表达ans基因能够促进花青素的积累，沉默该基因能够减少花青素的积累。
26.2、本发明还公开包含atrans基因的过表达载体和沉默载体，并提供所述基因atrans在提升三叶木通果皮中花青素含量以及在培育高花青素含量的植物品种中的应用，该基因atrans能显著增强三叶木通花青素合成，为培育高花青素含量三叶木通新品种提供了基因和载体资源。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
这些附图获得其他的附图。
28.图1是本发明实施例中atrans氨基酸序列功能结构域分析；
29.图2是本发明实施例中atrans基因在三叶木通不同表型果皮中表达的情况分析(注：白色果皮(lw)、粉色果皮(gp)、紫色果皮(zp)；s1，绿熟期；s2，转色期；s3，着色期)；
30.图3是本发明实施例中atrans在三叶木通果皮中的过表达促进花青素积累；(a)瞬时过表达atrans基因在三叶木通果皮中，未进行注射的果皮为阴性对照；(b)注射一周后，atrans在注射位点周围的实时表达量；(c)注射部位周围果皮中的花青素含量；数据为3个独立生物重复的平均值，采用student's t检验与相应的对照进行统计分析(**p《0.05,***p《0.01)；
31.图4是本发明实施例中基于trv病毒诱导基因沉默对atrans基因的功能分析；(a)三叶木通转色期atrans基因的沉默；(c)注射一周后，atrans在注射位点周围的相对表达量；(b)注射部位周围果皮花青素含量；数据为3个独立生物重复的平均值，采用student's t检验与相应的对照进行统计分析(**p《0.05,***p《0.01)。
具体实施方式
32.为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
33.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
34.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
35.实施例：
36.本发明鉴定到了三叶木通果皮花青素合成过程中差异表达的结构基因，并鉴定到了一个关键ans基因。本发明选择紫色果皮zp(种质名为杂交30)为模板，对三叶木通中ans基因进行分离与鉴定。通过生物信息学软件对克隆得到的三叶木通中的目的基因进行功能结构域、氨基酸序列、蛋白三维结构以及等电点等进行分析，结合相关的研究预测该基因的生物学功能，基于对该基因的功能预测我们将该基因命名为atrans。然后，通过构建过表达载体和构建trv病毒介导基因沉默表达载体瞬时转化三叶木通果皮来验证该基因的功能。处理果实的表型、类花青素含量的分析明确了atrans基因在三叶木通花青素生物合成中的作用，这一实验结果为木通属花青素生物合成的调控机理研究提供了理论基础。
37.1.试验材料：三叶木通果实采自湖南省沅江市中国农业科学院麻类研究所三叶木通资源圃，三叶木通鲜果用于果实瞬时表达。
38.2.试验方法：
39.2.1三叶木通果皮总rna提取及反转录
40.使用steadypure植物rna提取试剂盒(艾科瑞生物科技有限公司，中国长沙)，按照试剂盒的说明，从紫色果皮zp的新鲜果皮样品中分离用于克隆目的基因的总rna。利用琼脂糖凝胶电泳来判断rna样品的纯度。
41.使用thermo scientific revertaid first strand cdna synthesis kit反转录
试剂盒，以提取的总rna为模板，取10μl用于反转录，体系和程序见表1。
42.表1反转录反应体系
[0043][0044][0045]
2.2三叶木通果皮花青素合成关键基因atrans的克隆
[0046]
基于三叶木通基因组中atrans基因(atr08g041820)的序列信息，其中cds长度为1279bp，使用primerpremier5软件进行引物设计，并交由北京擎科生物科技有限公司合成，其核苷酸序列为：
[0047]
f端引物：aattgcaccaagacgaaa(如seq id no：3所示)；
[0048]
r端引物：aatgtcatcaagagtggtac(如seq id no：4所示)；
[0049]
以zp果实cdna为模板，使用kod fx dna polymerase(toyobo，日本)对目的基因的扩增，pcr反应体系及pcr反应程序见表2。
[0050]
表2pcr反应体系及程序
[0051][0052]
首先，将目的基因pcr产物经1.0％(w/v)琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像系统中观察是否存在单一明亮的目的条带。随后，使用胶回收试剂盒(omega d2400-01，omega，美国)对目的条带进行回收纯化。以琼脂糖凝胶电泳对产物进行纯度测定。
[0053]
2.3目的基因atrans的克隆连接与转化
[0054]
使用peasy-blunt cloning vector克隆载体试剂盒(全式金生物科技有限公司，北京)，将回收的目的基因产物通过平末端连接的方式连接到克隆载体中表3。热激法将连接产物转化到dh5a感受态(北京擎科生物科技有限公司，北京)中，复苏后将其均匀涂布在含有卡那霉素的lb培养基上，在37℃的培养箱内倒置培养过夜，形成单菌落。挑取单克隆，打散于10μl的灭菌超纯水中，利用peasy载体上的通用引物，以taq dna聚合酶(全式金生物科技有限公司，北京)对单克隆进行pcr检测，反应体系及程序见表4。将阳性克隆菌液在含有卡那霉素液体lb培养基扩大培养后将其委托北京擎科生物科技有限公司进行测序。通过ncbi blastn以及dnaman version 9对测序结果与目的基因cds序列进行比对。
[0055]
表3克隆载体连接体系及程序
[0056][0057]
表4pcr反应体系及程序
[0058][0059]
2.4目的基因表达载体的构建
[0060]
使用二元表达载体pbi121-gfp来构建含有atrans基因(atr08g041820)的orf序列的表达载体。以pbi121-gfp序列作为载体序列，目标基因序列作为连接序列。选择quick cut
tm
xbai作为限制性位点，并设计了带有酶切位点的pcr引物，其核苷酸序列为：
[0061]
f端引物：gagaacacgggggactctagaatggcaacacaagtagagtaaagttac a(如seq id no：5所示)；
[0062]
r端引物：gctcaccatggatcctctagattatttggagaggagagtttcttgg(如seq id no：6所示)；
[0063]
用含有atrans基因orf序列的克隆质粒作为模板进行pcr扩增(pcr扩增体系如表2)，通过琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收和纯化，以获得atrans基因片段。用quickcut
tm
xbai限制性内切酶对pbi121-gfp质粒dna进行消化，反应体系见表5，消化后的产物经电泳分离回收纯化，获得线性化载体片段，并通过琼脂糖凝胶电泳测定纯度和浓度。
[0064]
使用clonexpress
r ii one step cloning kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)进行无缝克隆连接，将atrans基因片段与线性化的pbi121-gfp载体进行连接，连接体系如表6所示。热激法将连接产物转化dh5a感受态(北京擎科生物科技有限公司，中国)，均匀涂布在含有卡那霉素的lb固体培养基中，37℃过夜培养。对平板上长出的单克隆，用pbi121-gfp载体的上的f端引物和atrans基因的r端引物对阳性克隆进行pcr检测，然后，委托北京擎科生物技术有限公司进行测序。选择测序正确的单克隆菌液进行质粒提取，转化农杆菌gv3101感受态(北京擎科生物科技有限公司，中国)，然后涂布到含有卡那霉素和利福平的固体lb培养基上，在28℃培养2天。在单个菌落生长后，收获单个克隆进行pcr验证，将阳性克隆在液体lb培养基中扩大培养并加入1∶1的50％的甘油储存在-80℃冰箱中用于后续的侵染。
[0065]
表5酶切反应体系及反应程序
[0066][0067]
表6连接体系
[0068][0069]
2.5目的基因vigs病毒诱导的沉默载体构建
[0070]
将zp三叶木通果皮样品中克隆得到的atrans基因的cds序列在三叶木通基因组序列以及ncbi数据库中进行同源比对，选取高度同源的543bp片段设计atrans基因的特异引物，引物序列如下：
[0071]
f端引物：aaggttaccgaattctctagaactaaaggctgttggtgaagcttt(如seq id no：7所示)；
[0072]
r端引物：tccccatggaggccttctagaatctctatggtgtccccaatgtg(如seq id no：8所示)；
[0073]
将高度同源的atrans基因片段与线性化的trv2载体连接以构建载体，构建载体步骤同前述第2.4节。
[0074]
2.6三叶木通果皮瞬时过量表达分析
[0075]
瞬时表达侵染液的配置：对保存的含有atrans基因的pbi121-gfp过表达农杆菌，在lb固体培养基使用划线法将其活化，置于28℃的恒温培养箱中黑暗培养。随后挑选单克隆并接种到1ml液体lb培养基中(含卡那霉素和利福平)，在28℃的恒温摇床中以200r/min的速度培养过夜，直到浑浊。接着，我们将100μl上述菌液转移至50ml液体lb培养基中(含卡那霉素和利福平)，在28℃的恒温摇床中以200r/min的速度培养过夜。最后，将菌液以5000rpm的速度离心15分钟，丢弃培养基，将沉淀重新悬浮在mma缓冲液中(10mm mgcl2，10mm mes，200μm乙酰丁香酮，ph＝5.6)，并将od
600
值调整到0.8左右，并加入0.1％的吐温。
[0076]
新鲜三叶木通果皮的侵染：选择成熟度相似、无机械损伤和病虫害的果实作为注
射材料，以注射含目的基因片段的pbi121-gfp过表达载体农杆菌菌液的果实作为实验组，将注射不含有目的基因的pbi121-gfp农杆菌菌液和不进行任何处理的果实作为阴性对照，使用5ml无菌注射器将重悬好的菌液以压迫法注射进果皮，在s1时期进行试验，在果实的不同部位进行注射，每个部位至少注射2ml菌液，每组至少注射20个果实。一周后将果实从树上取回，拍摄彩色表型数码照片，并在注射部位附近切除有色的果皮组织，在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃超低温冰箱中。
[0077]
2.7三叶木通果皮病毒介导的基因沉默分析
[0078]
侵染液的配置：方法同前述第2.6节，取构建好的含atrans基因的trv2沉默载体、空载trv2沉默载体、trv1农杆菌菌液进行活化，并重悬在mma缓冲液中，将含atrans基因的trv2沉默载体、空载trv2载体重悬液分别以1∶1的体积比例与trv1重悬液进行混合，加入0.1％的吐温，调配成侵染液。
[0079]
新鲜三叶木通果皮的侵染：将调配好的侵染液在室温下静置2小时后使用。以trv2-atrans+trv1为实验组，trv2+trv1和未注射为阴性对照，在s2转色期侵染新鲜三叶木通果皮，侵染方法同前述第2.6节。
[0080]
2.8三叶木通果皮中目的基因表达量的rt-qpcr测定
[0081]
使用steadypure plant rna extraction kit试剂盒(艾科瑞，长沙，中国)按照参考说明从粉色果皮(gp)、紫色果皮(zp)、白色果皮(lw)中提取总rna。用evo m-mlv rt premix for qpcr试剂盒(艾科瑞)合成cdna。本发明用primer 5设计引物，并由擎科生物(北京)合成。引物序列为5'-aagcgattacattgaggt-3'(如seq id no：9所示)；5'-gtagagggcacttagggt-3'(如seq id no：10所示)。qrt-pcr反应使用2
×
sybr green qpcr mix混合物(aidlab，北京，中国)，体系和程序见表7。在bio-rad cfx96 touch荧光定量pcr仪(bio-rad，美国)上进行3个生物重复，每个重复对每个反应进行3个技术重复。在每个样品的每次运行结束时产生熔融曲线。用excel 2016对原始数据进行分析，并用2-δδct法测定基因表达水平。
[0082]
表7rt-qpcr反应体系及程序
[0083][0084]
2.9三叶木通果皮中花青素含量
[0085]
三叶木通有色果皮中的花青素具体提取步骤为：将样品在液氮中充分研磨，称取1g样品，加入10ml 1％盐酸乙醇溶液，摇匀，4℃黑暗12h，5000g离心10min，取上清液，再用10ml 1％盐酸乙醇溶液提取一次，合并两次的上清液，转移至25ml容量瓶，定容25ml，取上
清液，测其在530nm、620nm、650nm下的吸光值，每个样品重复测定3次。
[0086]
δa＝od530-0.9*od620-0.1*od650，
[0087]
ta＝(δa/εl)*mw*df*v/wt*100，
[0088]
其中ta为总花青素含量(mg/100g)，ε为摩尔吸光度(26900)，l为光程(1cm)mw为标准分子量(449.2)，df为稀释倍数，v为终体积(ml)，mw为样品重量(g)。
[0089]
3.结果与分析
[0090]
3.1三叶木通中atrans基因序列分析
[0091]
花青素合酶(ans)是一种2-氧戊二酸(2og)和fe(ii)依赖性加氧酶，催化花青素生物合成的倒数第二步，可以将无色花青素转为有色花青素，其酶活性影响花色苷的合成。为了解atrans(atr08g041820)在三叶木通中的功能，本发明从zp的cdna中分离到了atrans的cds片段，其核苷酸序列如seq id no：1所示。该片段由1279bp的开放阅读框组成，包含2个外显子和2个内含子，预计编码426个残基多肽，分子式为c
2171h3442n566o657s12
，分子量为48369.33，其生物信息学分析见表8。利用ncbi-cdd对atrans蛋白的结构域进行分析，显示atrans蛋白含有一个pln03178(花青素合成酶)多域蛋白，包含吗啡合成n-端非血红素双加氧酶亚家族(diox_n)和2-酮戊二酸-fe
2+-双加氧酶亚家族(2og-feⅱoxy)两个保守结构域(图1)，atrans蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
[0092]
表8atrans的生物信息学分析
[0093][0094]
atrans基因核苷酸：
[0095]
atggcaacacaagtagagtaaagttacaccaagggtagagagcttagcaagcaatgggatccaagctatccctaaggagtacgactggaaagaagatcgcgaaagcatcaacgatgtgttcgaggaggagaagacatataacga
agctccacagatacccgttattgatttaaatggtgtcgattcggagaaatgtagggaggagtcgaagaaggttgatatttcaccaagggtagagagcttggcaagtagtgggatccaagctattcctaaggagtacatacgctcgaaagaagaacgcgaaagcatcaatgatgtgttcgaggaggaaaagaagtataacgagggtccacagataccaactatcgatttaaagggtatcgaatcggaggaggagatggtgagggagaaatgtagggaggagttgaaggcggcttcaatggagtggggtgtaatgcatatagtgaaccatggtatacctgatgatctaattcgtcgactaaaggctgttggtgaagctttctttgaactccctatcgaggagaaggagaagtatgccaatgatctggcctcgggcaaaatcgctgggtatgggagcaagcttgccaacaacgccaacgggcaactcgagtgggaggactacttcttccatctcatatttccagaagaaaagcgcgacatgtcaatttggcctaagataccaagcgattacattgaggtgacgagcgagtatgcaaggcaaataagagtactagtgaccaagatattgtcagtactatcgcttggtttgggattggaagaaggaaggctagaaacggaagttggtggcatggaggagttattattgcaattaaagattaactactaccctaagtgccctctaccagaattagcacttggggttgaagcccacaccgacattagcgcgctcaccttcatactccacaacatggttcctggcttgcaagtccactataaagacaagtgggtaacagcaaaatgtgtccccgattcaatcatcttgcacattggggacaccatagagatattgagcaatggcaagtacaagagtatacttcatagagcactagtgaacaaggagaaggttaggatatcgtggcccgtcttctgtgagccacctaaagagagcattttgctcaggcctctgtctgagcttgtcactgagtcggagccagcactcttcccacctcgaacttttgctcaacatattcaacacaagcttttcaagaaaacccaagaaactctcctctccaaataa。
[0096]
atrans蛋白氨基酸：
[0097]
massgiqaipkeyirskeeresindvfeeekkynegpqiptidlkgieseeemvrekcreelkaasmewgvmhivnhgipddlirrlkavgeaffelpieekekyandlasgkiagygsklannangqlewedyffhlifpeekrdmsiwpkipsdyievtseyarqirvlvtkilsvlslglgleegrletevggmeelllqlkinyypkcplpelalgveahtdisaltfilhnmvpglqvhykdkwvtakcvpdsiilhigdtieilsngkyksilhralvnkekvriswpvfceppkesillrplselvtesepalfpprtfaqhiqhklfkktqetllskmsiwpkipsdyievtseyarqirvlvtkilsvlslglgleegrletevggmeelllqlkinyypkcplpelalgveahtdisaltfilhnmvpglqvhykdkwvtakcvpdsiilhigdt。
[0098]
3.2atrans基因的表达分析
[0099]
本发明中的atrans基因是在三叶木通花青素合成相关转录组差异基因中得到，利用不同表型果皮对该基因进行表达分析，发现该基因在有色(紫色和粉色)材料中的表达量显著高于无色(白色)材料(见图2)。
[0100]
3.3atrans的过表达促进三叶木通花青素的积累
[0101]
为了研究atrans在三叶木通花青素生物合成中的作用，本发明在三叶木通果皮中对atrans基因进行了瞬时过表达。pbi121-atrans-gfp和pbi121-gfp农杆菌同时注射到三叶木通果皮中，与pbi121-gfp空载相比，注射pbi121-atrans-gfp的注射孔周围一周后出现清晰的紫色色素沉着，与未进行任何处理的ck相比，pbi121-atrans-gfp和pbi121-gfp注射过的果实表现出明显的黄色，可能是农杆菌菌液的注射对果实造成了伤害，应激导致的黄化。与未处理的果皮相比，处理过的果皮中atrans的表达量水平与花青素含量均有明显的提升，注射atrans-pbi121-gfp果皮中atrans的表达量是仅注射pbi121-gfp的2.54倍，是未处理的9.15倍，花青素的含量也呈现类似的趋势，注射过pbi121-atrans-gfp的果皮中花青素含量最高(35.22mg/100g)，明显高于注射pbi121-gfp的果皮(15.04mg/100g)和未处理过的果皮(9.30mg/100g)(图3)。这些结果表明，atrans过表达诱导注射部位周围的花青素生物合成增加，atrans正向调控三叶木通果皮花青素的生物合成。
[0102]
3.4vigs抑制atrans降低三叶木通果皮花青素积累
[0103]
利用病毒诱导基因沉默(vigs)系统进一步验证atrans的功能。以trv2-atrans+trv1和trv2+trv1的农杆菌重悬液为材料，在s2转色期瞬时渗透到三叶木通果皮中。在注射trv2-atrans+trv1后一周，观察到注射部位的紫色色素沉着减少，而注射trv2+trv1的部位肉颜色没有较为明显的变化。测定注射位点周围果皮花青素的含量，发现trv2-atrans+trv1注射位点附近的(46.00mg/100g)显著低于仅注射trv2+trv1的注射位点(60.97mg/100g)和相对未注射位点(57.23mg/100g)，这与atrans的表达水平降低密切相关(图4)。以上结果表明，atrans在三叶木通果皮花青素生物合成中起正调控作用。
[0104]
总的来说，本发明在三叶木通果皮中对atrans基因进行过表达，促进了花青素的积累；对atrans基因进行沉默，抑制了花青素的积累。这些结果说明了atrans基因能够正向调控花青素的积累，提升三叶木通果皮中花青素的含量；还可以通过在植物中引入atrans基因进行过表达，进而应用于培育高花青素植物新品种。

技术特征：
1.一种三叶木通花青素合成调控基因atrans，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no：1所示。2.一种用于克隆如权利要求1所述基因atrans的引物对，其特征在于，其碱基序列如下：上游引物：5'-aattgcaccaagacgaaa-3'；下游引物：5'-aatgtcatcaagagtggtac-3'。3.一种过表达载体，其特征在于，包括载体pbi121-gfp，在所述载体pbi121中包含如权利要求1所述基因atrans。4.一种用于构建如权利要求3所述过表达载体的引物对，其特征在于，其碱基序列如下：上游引物：5'-gagaacacgggggactctagaatggcaacacaagtagagtaaagtt aca-3'；下游引物：5'-gctcaccatggatcctctagattatttggagaggagagtttcttgg-3'。5.一种病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于，包括载体trv2，在所述载体trv2中包含如权利要求1所述基因atrans。6.一种用于构建如权利要求5所述基因沉默载体的引物对，其特征在于，其碱基序列如下：上游引物：5'-aaggttaccgaattctctagaactaaaggctgttggtgaagcttt-3'；下游引物：5'-tccccatggaggccttctagaatctctatggtgtccccaatgtg-3'。7.一种如权利要求1所述的基因atrans的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：2所示。8.一种如权利要求1所述的基因atrans在提升三叶木通果皮中花青素含量的应用。9.一种如权利要求1所述的基因atrans在培育高花青素植物新品种的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物为三叶木通。

技术总结
本发明属于三叶木通种植技术领域，公开了一种三叶木通花青素合成调控基因AtrANS及其编码蛋白和应用。本发明首次发现三叶木通花青素合成调控基因AtrANS，并公开了其核苷酸序列及其编码蛋白的序列，通过在三叶木通中瞬时表达ANS基因能够促进花青素的积累，沉默该基因能够减少花青素的积累。本发明还公开了包含AtrANS基因的过表达载体和沉默载体，并提供所述基因AtrANS在提升三叶木通果皮中花青素含量以及在培育高花青素含量的植物品种中的应用，该基因AtrANS能显著增强三叶木通花青素合成，为培育高花青素含量三叶木通新品种提供了基因和载体资源。基因和载体资源。基因和载体资源。


技术研发人员：栾明宝 陈建华 王越 肖进军 陈晓蓉 牛娟 孙志民
受保护的技术使用者：湖南省吉祥天生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/23