一株防治作物土传病害的菌株、微生物菌剂及其应用的制作方法

1.本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株防治作物土传病害的菌株、微生物菌剂及其应用。


背景技术：

2.近年来，全球范围内对生态环境保护越来越重视，农作物病害的生物防治越来越受到人们的关注。合理利用生防菌剂可减少和避免化学药剂的带来的负面影响，从而达到防治病害的发生及应对生态坏境的破坏，进而保障作物的安全优质生产。
3.小麦和玉米是全世界人类和牲畜的主要食物来源。而当前产量和质量受到多种病害的影响，尤其是土传根部病害严重，如小麦全蚀病、小麦纹枯病、小麦根腐病、玉米茎基腐病等。
4.对于上述病害的防治，目前也已鉴定出能防治上述病害的生防菌，如保藏编号为cgmcc no.18008的米修链霉菌可用于防治麦根腐平脐蠕孢引起的小麦根腐病、禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病(授权专利cn111500501b)；保藏编号为cgmcc no.15109的链霉菌对小麦全蚀病、辣椒疫霉病等表现良好的生防效果(授权专利cn110885769b)，保藏编号为cgmcc no.12210的白黄链霉菌w68对小麦根腐病、甜瓜枯萎病、辣椒疫霉病及小麦全蚀病等土传真菌病害的防治显示了明显的防控效果(授权专利cn107287130b)；保藏编号为cctcc no:m 2019266的链霉菌ms001对葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、南天竹炭疽病菌都具有较强的抑菌活性。
5.但是经过申请人检索，还未发现一种链霉菌兼具小麦全蚀病、小麦纹枯病、小麦根腐病和玉米茎基腐病的防治作用。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于提供菌株sxdjyj-fx01，以至少解决现有技术存在的问题之一，该菌株分类命名为链霉菌(streptomyces sp.)，于2023年01月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26396。
7.本发明的目的之二在于提供一种菌剂，所述菌剂的活性成分包括所述菌株sxdjyj-fx01或所述菌株sxdjyj-fx01的发酵产物。
8.本发明的目的之三在于提供所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
9.s1、将所述菌株sxdjyj-fx01活化、扩培后得到种子液；
10.s2、将所述种子液接种于固体发酵培养基中，28-32℃条件下培养10-12d，将培养物风干、粉碎后加入黏土和十二烷基硫酸钠混合均匀，得所述菌剂；
11.所述黏土和十二烷基硫酸钠占培养物的质量百分比依次为5％～15％和0.3％～3％。
12.进一步的，所述活化的具体操作是：将所述菌株sxdjyj-fx01接种于改良高氏一号
固体培养基，于30℃条件下培养3d。
13.进一步的，所述扩培的具体操作是：将活化的所述菌株sxdjyj-fx01制成浓度为107cfu/ml孢子悬浮液，然后按照8～15％的接种量接种于种子培养液中，150～200r/min，28～30℃下培养3～5d得到种子液；
14.所述种子培养液组按照质量百分比计算由以下组分制成：
15.蛋白胨0.1％～2.0％、黄豆粉1.0％～3.0％、葡萄糖0.3％～1.5％、nacl 0.05％～1％、caco30.05％～2％、补水至100％，ph 7.2-7.6。
16.进一步的，所述固体培养基按质量百分比计算由以下组分制成：
17.黄豆粉3％～15％、小麦秸秆粉：15～30％、蛋白胨1％～2％、磷酸二氢钾为2％～10％，硫酸亚铁0.0001～0.001％，补水至100％。
18.本发明的目的之四在于提供所述菌株sxdjyj-fx01在防治植物病害中的应用，所述病害包括小麦全蚀病、小麦纹枯病、小麦根腐病和玉米茎基腐病。
19.本发明的目的之五在于提供所述菌剂在防治植物病害中的应用，所述病害包括小麦全蚀病、小麦纹枯病、小麦根腐病和玉米茎基腐病。
20.本发明的目的之六在于提供所述菌株sxdjyj-fx01在降解秸秆中的应用。
21.本发明的目的之七在于提供所述菌剂在降解秸秆中的应用。
22.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
23.本发明提供的菌株sxdjyj-fx01可抑制多种植物病原菌的生长，可有效防治小麦全蚀病、小麦纹枯病、小麦根腐病、玉米茎基腐病等作物根部病害。该微生物菌剂对环境及植物无毒害作用，并对农作物生长具有一定的促生作用。同时，sxdjyj-fx01菌剂具有纤维素降解能力，能在低温下提高秸秆的降解速率，促进秸秆还田，提高土壤肥力功效。
24.保藏说明：
25.菌种名称：链霉菌；
26.拉丁名：streptomycessp.；
27.菌株编号：sxdjyj-fx01；
28.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；
29.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
30.保藏日期：2023年01月06日；
31.保藏编号：cgmcc no.26396。
附图说明
32.图1为菌株sxdjyj-fx01系统发育树。
具体实施方式
33.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
34.实施例1：菌株sxdjyj-fx01的分离和鉴定
35.本实施例的sxdjyj-fx01菌株是分离于陕西渭南玉米地土壤中。根据16s rrna基
因序列在微生物种属中的保守性，对其进行鉴定。提取sxdjyj-fx01的基因组，pcr扩增其16s rrna基因并进行测序，其16s rrna序列如seq id no.1所示。结果表明，该菌属于链霉菌属(图1)。
36.采用划线法将菌株sxdjyj-fx01接种于形态观察培养基平板(高氏一号培养基、苹果酸钙琼脂、燕麦粉培养基、无机盐淀粉培养基、葡萄糖天冬素培养基、蔗糖察氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂和酪氨酸琼脂培养基)上，28℃恒温培养箱中倒置培养，于第7d观察并记录菌株在各个培养基上的菌落形态和可溶性色素变化情况。
37.表1菌株sxdjyj-fx01培养特征
[0038][0039][0040]
采用点接法将sxdjyj-fx01接种于含有不同碳源、氮源培养基平板，观察碳、氮源利用情况，7d后观察结果。
[0041]
表2菌株sxdjyj-fx01生理生化特征
[0042][0043]
注：+，实验结果阳性；-，实验结果阴性
[0044]
由表2可知，sxdjyj-fx01菌株不能在d-果糖和d-木糖为碳源的培养基上生长；明胶液化、纤维素水解和淀粉水解反应阳性，但不产生黑色素。
[0045]
实施例2：菌剂的制备
[0046]
(1)菌株活化：将菌株sxdjyj-fx01在30℃条件下活化培养，所述活化培养基为改良高氏一号固体培养基。
[0047]
(2)种子制备：将活化的sxdjyj-fx01菌落制成浓度为107cfu/ml孢子悬浮液，然后按照10％(v/v)的接种量接种于已灭菌的种子培养液中，每瓶装液量为200ml，180r/min，28～30℃下培养4d得到种子液。
[0048]
所述的种子培养液组成为：蛋白胨0.15％、黄豆粉2.0％、葡萄糖1.0％、nacl 0.08％、caco31.5％、补水至100％，ph 7.4。
[0049]
(3)发酵产物及菌剂的制备：无菌条件下，将种子按10％(v/v)的接种量接入固体发酵培养基中，30℃条件下培养11d，将培养物在30℃条件下风干，并粉碎加入助剂(黏土和十二烷基硫酸钠)。
[0050]
所述的发酵固体培养基组成为：黄豆粉10％、小麦秸秆粉：20％、蛋白胨1.5％、磷酸二氢钾为4％，硫酸亚铁0.0005％，余量为水。
[0051]
所述黏土和十二烷基硫酸钠占培养物的质量百分比依次为8％和2％。
[0052]
实施例3：菌株sxdjyj-fx01抑制病原真菌生长的平板对峙实验
[0053]
取保藏管中的菌株sxdjyj-fx01和病原菌分别在平板上划线，将活化后的病原菌接种于pda平板中心，sxdjyj-fx01分别接于病原菌两侧，以只接种病原真菌的pda平板做为对照，置于28℃培养箱培养5-7天，通过十字交叉法来测量菌株生长的直径，从而计算抑菌率。通过平板对峙实验，本发明中采用的菌株sxdjyj-fx01对小麦全蚀病菌(gaeumannomycesgraminis)、小麦纹枯病菌(rhizoctonia cerealis)、小麦根腐病菌(bipolaris sorokiniana)和玉米茎基腐病菌(fusariumgraminearum)均具有显著的拮抗作用。其中对小麦全蚀病菌、小麦纹枯病菌和小麦根腐病菌的抑制率达84％以上，对玉米茎基腐病原真菌的抑制率达到76.52％，表明本发明中的菌株sxdjyj-fx01可利用范围较广(表3)。
[0054]
表3菌株sxdjyj-fx01对各病原菌的对峙结果
[0055][0056][0057]
实施例4：sxdjyj-fx01菌剂对玉米茎基腐病预防效果
[0058]
从玉米苗期开始，每隔15d采用sxdjyj-fx01菌剂400倍液进行灌根处理，连续处理3次，每株大约200ml。在玉米乳熟期和蜡熟期调查玉米茎基腐病的病情指数，结果见表4。茎基腐病调查方法按《农药田间药效试验准则》，玉米茎基腐病分级标准(植株个体受害程度)：
[0059]
1级：全株生长正常，中下部叶片出现青枯/青黄枯症状，茎基生长正常，果穗生长正常；3级：全株叶片出现青枯症状，茎基生长正常，果穗生长正常；5级：全株叶片出现典型青枯症状，茎基部变色且稍有水浸状，果穗基本正常；7级：植株叶片出现典型青枯症状，茎
基部明显变软但不倒状，果穗下垂，籽粒不饱满；9级：全株枯死且倒伏，茎基部维管束破裂，籽粒干瘪。
[0060]
表4微生物菌剂sxdjyj-fx01对玉米茎基腐病的预防效果
[0061][0062]
结果表明，sxdjyj-fx01生防菌剂400倍液能够显著降低玉米茎基腐病的发病率，在乳熟期和蜡熟期处理效果同噁霉灵相当。
[0063]
实施例5：sxdjyj-fx01菌剂对小麦土传病害防治
[0064]
采用人工接种病原菌，菌种分别为小麦全蚀病菌、小麦纹枯病菌和小麦根腐病菌，小麦播种前将本发明的生防菌剂翻埋至耕层土壤，15kg/亩，拔节前sxdjyj-fx01菌剂400倍液灌根2次。以只接种3种病原菌地块为对照，随机区组设计，每处理3次重复。分别于拔节期和灌浆中期在每小区5点取样，每点调查20株小麦发病情况，计算病情指数、防效，结果见表5。
[0065]
表5微生物菌剂sxdjyj-fx01对小麦土传病害田间防治效果
[0066][0067]
通过土壤处理，本发明的生防菌剂对小麦全蚀病、纹枯病和根腐病具有良好的防治效果，防治效果介于61.53％-73.52％之间。
[0068]
实施例6：菌剂对玉米秸秆的降解效果
[0069]
以制备的菌剂为试验对象，以不接菌的处理为空白对照，共设置3个处理。配制2700ml赫奇逊(hutchinson)秸秆培养基，平均分装到9个250ml的三角瓶中，每个处理3个重复。具体试验过程为：取稀释200倍和稀释400倍的菌剂5ml，接种于装有100ml赫奇逊秸秆培养基的250ml三角瓶中。在20℃温度下培养10d，培养结束后测定每个三角瓶中的玉米秸秆剩余量，计算每个处理的平均玉米秸秆降解率。玉米秸秆降解率的计算公式如下：
[0070]
秸秆降解率(％)＝(w1－w2)/w1×
100％
[0071]
式中：w1代表秸秆原质量(g)；w2表示降解后剩余秸秆质量(g)
[0072]
表6菌剂对玉米秸秆的降解效果
[0073]
组别秸秆原质量(g)剩余秸秆质量(g)降解率％200菌剂1.00.4852 400菌液1.00.7624
空白1.00.955
[0074]
表6的数据表明，在20℃条件下，本发明制备的菌剂200倍液对于玉米秸秆的降解效果明显，秸秆降解率达到了50％以上，明显高于对照的秸秆降解率。说明本发明采用的菌株能在室温下降解玉米秸秆。
[0075]
需要说明的是，虽然本发明主要以玉米秸秆为降解对象，但本发明的主要作用是降解纤维素类物质，因而本发明的应用范围不限于玉米秸秆，对于其它以纤维素为主要成分的农作物秸秆同样适用。
[0076]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0077]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.菌株sxdjyj-fx01，分类命名为链霉菌(streptomycessp.)，于2023年01月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.26396。2.菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述菌株sxdjyj-fx01或权利要求1所述菌株sxdjyj-fx01的发酵产物。3.权利要求2所述菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将所述菌株sxdjyj-fx01活化、扩培后得到种子液；s2、将所述种子液接种于固体发酵培养基中，28-32℃条件下培养10-12d，将培养物风干、粉碎后加入黏土和十二烷基硫酸钠混合均匀，得所述菌剂；所述黏土和十二烷基硫酸钠占培养物的质量百分比依次为5％～15％和0.3％～3％。4.根据权利要求3所述菌剂的制备方法，其特征在于，所述活化的具体操作是：将所述菌株sxdjyj-fx01接种于改良高氏一号固体培养基，于30℃条件下培养3d。5.根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，所述扩培的具体操作是：将活化的所述菌株sxdjyj-fx01制成浓度为107cfu/ml孢子悬浮液，然后按照8～15％的接种量接种于种子培养液中，150～200r/min，28～30℃下培养3～5d得到种子液；所述种子培养液组按照质量百分比计算由以下组分制成：蛋白胨0.1％～2.0％、黄豆粉1.0％～3.0％、葡萄糖0.3％～1.5％、nacl0.05％～1％、caco30.05％～2％、补水至100％，ph7.2-7.6。6.根据权利要求5所述菌剂的制备方法，其特征在于，所述固体培养基按质量百分比计算由以下组分制成：黄豆粉3％～15％、小麦秸秆粉：15～30％、蛋白胨1％～2％、磷酸二氢钾为2％～10％，硫酸亚铁0.0001～0.001％，补水至100％。7.权利要求1所述菌株sxdjyj-fx01在防治植物病害中的应用，其特征在于，所述病害包括小麦全蚀病、小麦纹枯病、小麦根腐病和玉米茎基腐病。8.权利要求2所述菌剂在防治植物病害中的应用，其特征在于，所述病害包括小麦全蚀病、小麦纹枯病、小麦根腐病和玉米茎基腐病。9.权利要求1所述菌株sxdjyj-fx01在降解秸秆中的应用。10.权利要求2所述菌剂在降解秸秆中的应用。

技术总结
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株防治作物土传病害的菌株、微生物菌剂及其应用。所述菌株为SXDJYJ-FX01，分类命名为链霉菌(Streptomycessp.)，于2023年01月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.26396。由所述菌株SXDJYJ-FX01制成的菌剂可抑制多种植物病原菌的生长，可有效防治小麦全蚀病、小麦纹枯病、小麦根腐病、玉米茎基腐病等作物根部病害。该微生物菌剂对环境及植物无毒害作用，并对农作物生长具有一定的促生作用。同时，SXDJYJ-FX01菌剂具有纤维素降解能力，能在低温下提高秸秆的降解速率，促进秸秆还田，提高土壤肥力功效。提高土壤肥力功效。提高土壤肥力功效。


技术研发人员：韩霁昌 张扬 庄华 陈田庆 郭振 王健 王迎国 周航 杨晨曦
受保护的技术使用者：陕西地建土地工程技术研究院有限责任公司
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/23