一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法与流程

1.本技术涉及病原菌检验技术分析领域，更具体地说，它涉及一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法。


背景技术：

2.高光谱成像技术是在多光谱成像的基础上，在从紫外到近红外(200-2500nm)的光谱范围内，利用成像光谱仪，在光谱覆盖范围内的数十或数百条光谱波段对目标物体连续成像，在获得物体空间特征成像的同时，也获得了被测物体的光谱信息。利用高光谱技术在卫星遥感领域对地物进行勘测上有广泛的应用，例如地物分类、水质检测等。
3.传统的光谱成像技术能通过获得的间断的物质信息对物质进行大致的非标记的区分，但是由于存在波段的缺失，不能对微小的差异进行严格的检测，因此不能对细菌从蛋白质的微小差异上进行区分。高光谱成像技术通过精细的波段划分可以全方位的获得物质的详细信息，纳米级光学通道可以对病原菌等微小物质进行检测和区分。
4.临床病原菌检验在医疗领域对病患的诊断和治疗发挥着重要的参考作用，它主要是通过提取人体的血液、尿液、排泄物等对患者的病原病原菌进行鉴定。目前，临床病原菌检验技术已经广泛应用于就诊患者的各项疾病诊疗中，是帮助医生更加准确的判定患者疾病感染病菌的重要参考依据。然而，由于现实操作临床病原菌检验技术具有相当强的专业性和对医学专业知识清晰的专业认知性，整个检验病原菌的操作过程难度比较大，往往会因为病原菌制片过程中检测人员的各种操作等原因导致重现性较差，使得检验质量的把控不准确。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术存在的不足，提高病原菌高光谱成像检验的准确性，本技术提供一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法。
6.本技术提供一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，采用如下的技术方案：一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，方法包括：将病原菌制备成菌悬液，菌悬液的浊度为3-8mcf，采用接种环将菌悬液均匀的涂在清洗灭菌后的载玻片上；或先向载玻片上滴加固定液，采用接种环将病原菌均匀的涂在滴有固定液的载玻片上；通过接种环对涂覆在载玻片上的病原菌按同一方向持续搅拌研磨，研磨时接种环与载玻片的夹角为15-35
°
；对研磨完成的载玻片进行干燥处理。
7.通过采用上述技术方案，制备菌悬液，其浊度为3-8mcf。这个浊度范围的选择有助于确保填充率的优化，在进一步的制片过程中能够实现均匀的涂层。菌悬液制备过程还需注意菌液浓度不宜过高，以免光谱成像分析时生物样品堆积，杂质等导致信号干扰。涂布时采用接种环将菌悬液均匀涂在清洗灭菌后的载玻片上，或先将载玻片滴有固定液，再用接
种环将病原菌均匀涂在载玻片上。均匀涂布有助于获得光谱成像分析的连续性，可显著提高成像质量和实验重复性。通过使用接种环对涂覆在载玻片上的病原菌按同一方向持续搅拌研磨，研磨过程中接种环与载玻片的夹角为15-35
°
。这种方法有助于进一步均匀分布病菌，避免生物样品撕裂、结聚等不良效果，从而提高光谱成像质量。
8.优选的，制备所述菌悬液时的稀释剂为生理盐水、磷酸缓冲盐溶液以及三乙醇胺缓冲盐溶液中的任一一种。
9.通过采用上述技术方案，在高光谱成像分析中，在制片时制备菌悬液选择以上稀释剂，以获得均匀、分辨率高且无毒性的菌悬液。稀释剂可通过选择生理盐水、磷酸缓冲盐溶液或三乙醇胺缓冲盐溶液，制备得到的菌悬液的均匀性较好，并且分辨率相对进一步提升，能够进一步提高高光谱成像分析的准确性。
10.优选的，所述固定液为无水乙醇、75%酒精、磷酸缓冲盐溶液或三乙醇胺缓冲盐溶液中的任一一种。
11.通过采用上述技术方案，固定液在病原菌制片中发挥着重要作用。能够帮助固定生物样品，能确保制片牢固度。通过对固定液采用以上几种，其不会对生物样品结构造成影响、有较好的固定能力以及不会与涂布使用的各种试剂发生化学反应，且具有较好的固定和去脂能力，进而提高高光谱成像分析的准确性。
12.优选的，在对涂有菌悬液的载玻片进行干燥处理之后，通过清洗液对涂片进行冲洗处理。
13.通过采用上述技术方案，在对涂有菌悬液的载玻片进行干燥处理后，需采用清洗液对载玻片进行冲洗处理，以去除多余菌液，减少光谱信号干扰，可以冲洗掉制片时玻片上的盐结晶，进而减小检测误差,通过清洗液清洗的过程中可对没有与载玻片固定结合的部分病原菌进行清理，只保留牢固结合在载玻片上的病原菌，在通过高光谱成像进行单个菌分析，由于对病原菌的固定效果较好，进而提高检测效率以及准确性。
14.优选的，所述清洗液为75%酒精或与所述稀释剂采用相同的试剂。
15.通过采用上述技术方案，通过采用上述清洗液进行清洗后，均能对玻片上的盐结晶具有良好的清洗效果，有效减小检测误差。
16.优选的，所述接种环的直径为2-3mm，且所述接种环采用铂金接种环。
17.通过采用上述技术方案，采用铂金接种环，并且使用上述规格范围的铂金接种环可确保涂布均匀且减少对生物样品的损害，提高高光谱检测试验的准确性。
18.优选的，对所述铂金接种环进行低温等离子处理。
19.通过采用上述技术方案，低温等离子表面处理技术能够与铂金接种环表面进行纳米级的微观反应，可以通过粒子的物理轰击和分子化学反应形成微粗糙和洁净的金属表面；能够清洁接种环表面的污染物和油渍等，形成洁净的金属表面，也可以达到去除材料表面静电的作用，并可以提高接种环表面的亲水性，有利于病原菌的吸附和生长，从而提高病原菌制片的质量。
20.优选的，对铂金接种环进行低温等离子处理时，工作气体为氧气，处理温度小于100℃，放点功率为50-500w，处理时间为5-15min，气体流速为20-35sccm。
21.通过采用上述技术方案，该低温等离子处理技术可以有效地提高铂金接种环的表面质量和性能，有利于后续在制片中的应用；低于100℃的处理温度有利于避免铂金接种环
7.2；配制：先将磷酸盐溶解于500 ml蒸馏水中，用1 mol/l氢氧化钠溶液校正ph后，再用蒸馏水稀释至1000 ml得到储存液。
27.稀释缓冲盐溶液：取储存液1.25 ml，用蒸馏水稀释至1000 ml得到磷酸缓冲盐溶液。分装每瓶100 ml，121℃高压灭菌15 min。
28.三乙醇胺缓冲盐溶液制备例取三乙醇胺7.0g，加水80ml，盐酸1.6ml，乙二胺四醋酸二钠1.48g，搅拌溶解后，采用氢氧化钠或盐酸调节ph值至7.6
±
0.1，加水至1000ml后过滤去除悬浮杂质得到三乙醇胺缓冲盐溶液。
29.制备例中使用试剂均采用普通市售产品。
实施例
30.实施例1一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，包括以下步骤：步骤一：取一只干净的、加有生理盐水的浊度管备用；步骤二：用医用棉签从培养皿中挑出适量病原菌，加入到准备好的浊度管中，制成菌悬液，并用震荡器充分震荡、混匀；步骤三：测量菌悬液的浊度，浊度为3mcf，浊度合适后将制好的菌悬液放置备用；步骤四：取一片干净的载玻片，先清洗干净，再用酒精灯对其进行烘烤，冷却备用；步骤五：从浊度管中取出适量菌悬液，均匀、迅速地涂在步骤四所得到的载玻片上，通过接种环对涂覆在载玻片上的病原菌按同一方向持续搅拌研磨30s，研磨时接种环与载玻片的夹角为15
°
；步骤六：把制备好的涂片放在生物安全柜中待完全干透形成菌膜，并需将干透的载玻片于酒精灯下来回烘烤以固定病原菌，即可完成病原菌制片。
31.本实施例中接种环规格采用5ul，直径为2mm，采用普通市售聚丙烯接种环；生理盐水采用浓度为0.9%的生理盐水；本实施例中病原菌为大肠杆菌，大肠杆菌采用普通市售产品。
32.实施例2一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1不同之处在于，菌悬液的浊度为8mcf，研磨时接种环与载玻片的夹角为35
°
。
33.实施例3一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，包括以下步骤：步骤一：取一片干净的载玻片，先清洗干净，再用酒精灯对其进行烘烤，冷却备用；步骤二：向载玻片中间位置滴上固定液无水乙醇；步骤三：用接种环从培养皿中挑出适量病原菌，均匀、迅速地涂在滴有无水乙醇的载玻片上，并用接种环按同一方向持续搅拌研磨15s，充分研磨使细菌分散开，研磨时接种环与载玻片的夹角为15
°
。
34.步骤四：把制备好的涂片放在生物安全柜中待完全干透形成菌膜，并需将干透的
载玻片于酒精灯下来回烘烤干燥来固定病原菌，即可完成病原菌制片。
35.本实施例中无水乙醇为100%的乙醇，接种环规格采用5ul，直径为2mm，采用普通市售聚丙烯接种环；本实施例中病原菌为大肠杆菌。
36.实施例4一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例3的不同之处在于，固定液采用75%酒精。
37.实施例5一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例3的不同之处在于，固定液采用制备例制得的三乙醇胺缓冲盐溶液。
38.实施例6一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例3的不同之处在于，固定液采用制备例制得的磷酸缓冲盐溶液。
39.实施例7一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，在步骤六中通过酒精灯烘烤完成后，将适量清洗液浓度为0.9%的生理盐水滴加在步骤五获得的涂片上，滴加量只需覆盖住形成的菌膜即可，多余生理盐水用滤纸吸干，放置晾干固定，即可完成病原菌制片。
40.实施例8一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，在步骤六中通过酒精灯烘烤完成后，将适量清洗液75%酒精滴加在步骤五获得的涂片上，滴加量只需覆盖住形成的菌膜即可，多余75%酒精用滤纸吸干，放置晾干固定，即可完成病原菌制片。
41.实施例9一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，稀释液采用制备例制得的磷酸缓冲盐溶液，在步骤六中通过酒精灯烘烤完成后，将适量磷酸缓冲盐溶液滴加在步骤五获得的涂片上，滴加量只需覆盖住形成的菌膜即可，多余磷酸缓冲盐溶液用滤纸吸干，放置晾干固定，即可完成病原菌制片。
42.实施例10一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，稀释液采用制备例制得的磷酸缓冲盐溶液，在步骤六中通过酒精灯烘烤完成后，将适量75%酒精滴加在步骤五获得的涂片上，滴加量只需覆盖住形成的菌膜即可，多余75%酒精用滤纸吸干，放置晾干固定，即可完成病原菌制片。
43.实施例11一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，稀释液采用制备例制得的三乙醇胺缓冲盐溶液，在步骤六中通过酒精灯烘烤完成后，将适量三乙醇胺缓冲盐溶液滴加在步骤五获得的涂片上，滴加量只需覆盖住形成的菌膜即可，多余三乙醇胺缓冲盐溶液用滤纸吸干，放置晾干固定，即可完成病原菌制片。
44.实施例12一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，稀释液采用制备例制得的三乙醇胺缓冲盐溶液，在步骤六中通过酒精灯烘烤完成后，将75%酒精滴
加在步骤五获得的涂片上，滴加量只需覆盖住形成的菌膜即可，多余75%酒精用滤纸吸干，放置晾干固定，即可完成病原菌制片。
45.实施例13一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，接种环采用铂金接种环，接种环规格采用5ul，接种环的直径为2mm，对铂金接种环采用等离子清洗机进行低温等离子清洗处理，工作气体为氧气，处理温度60℃，放点功率为50w，处理时间为5min，气体流速为20sccm。
46.实施例14一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，接种环采用铂金接种环，接种环规格采用10ul，接种环的直径为3mm，对铂金接种环采用等离子清洗机进行低温等离子清洗处理，工作气体为氧气，处理温度95℃，放点功率为500w，处理时间为15min，气体流速为35sccm。
47.对比例对比例1一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，包括以下步骤：步骤一：取一只干净的、加有浓度为0.9%的生理盐水的浊度管备用；步骤二：用医用棉签从培养皿中挑出适量病原菌，加入到准备好的浊度管中，制成菌悬液，并用震荡器充分震荡、混匀；步骤三：测量菌悬液的浊度，浊度为3mcf，浊度合适后将制好的菌悬液放置备用；步骤四：取一片干净的载玻片，先清洗干净，再用酒精灯对其进行烘烤，冷却备用；步骤五：通过无菌棉签从浊度管中取出适量菌悬液，均匀、迅速地涂在步骤四所得到的载玻片上；步骤六：把制备好的涂片放在生物安全柜中待完全干透形成菌膜，并需将干透的载玻片于酒精灯下来回烘烤以固定病原菌，即可完成病原菌制片。
48.本实施例中病原菌为大肠杆菌。
49.对比例2一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，接种环研磨时与载玻片的夹角为45
°
。
50.对比例3一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，菌悬液的浊度为10mcf。
51.对比例4一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，与实施例1的不同之处在于，菌悬液的浊度为2mcf。
52.性能检测试验1、通过显微高光谱成像仪，采用高光谱相机内置扫描实施例1-14以及对比例1-4分别得到的病原菌制片，获取图像信息并导出光谱曲线（该光谱曲线的横坐标代表波长，以纳米（nm）为单位，表示光的波长；纵坐标代表吸光度，以od（optical density）为单位）；高光谱相机x轴起始位置为5mm，结束位置为20mm，推扫速率为0.41mm/s，回程速率为2mm/s；y
轴焦点位置16.01mm，扫描起始2mm，扫描结束10mm，运行速率0.5mm/s；得到图像信息参照图1-7中的a1-r1分别依次对应实施例1-14到对比例1-4，得到光谱信息参照图1-7中的a2-r2分别依次对应实施例1-14到对比例1-4。
53.结合实施例1和对比例1并结合图1中的a1和a2以及图6中的o1和o2可以看出，a1图像较o1中的大肠杆菌分布较为分散，且单个细菌较多，边界清晰，说明采用实施例1得到的制片明显好于对比例1得到的制片，说明实施例1的制片方法能够提高显微高光谱成像检测的准确性，进一步说明在制片过程中通过接种环对病原菌进行研磨搅拌，并且保持接种环一定的研磨角度，能够有效提高病原菌细菌的分散性，使得制片中单个菌落较多，进而能够有效提高病原菌高光谱成像检验的准确性；并且结合a2与o2中的光谱图可以看出，a2中多条光谱曲线的一致性相对较好，且a2中光谱图曲线的波峰波谷的位置相对较为统一，说明采用实施例1得到的制片明显好于对比例1得到的制片，进一步说明实施例1的制片方法能够提高显微高光谱成像检测的准确性。
54.结合实施例1和对比例2并结合图1中的a1和a2以及图6中的p1和p2可以看出，a1图像较p1图像中的大肠杆菌分布较为分散,且p1图像中出现部分菌落的团聚，说明实施例1的制片相较于对比例2的方法能够有效提高制片过程中菌落的分散性，进行方便显微高光谱成像的检测，提高检测准确度；并且a2中的光谱曲线较p2的光谱曲线一致性较好，进而说明在制片过程中采用接种环研磨搅拌时，控制接种环的与载玻片的角度能够有效提高菌落的分散性，进而提高显微高光谱成像检测的准确性。
55.结合实施例1和对比例3并结合图1中的a1和a2以及图6中的q1和q2可以看出，a1图像较q1图像中的大肠杆菌分布较为分散、边界清晰、且制片的背景较为干净，而q1图像中菌落的边界不够清晰，且背景杂质较多，并且a2中的光谱曲线明显优于q2中的光谱曲线，q2中多个光谱曲线的一致性较差，说明对比例3制片中的杂质影响显微高光谱成像的准确性，进而说明实施例1的制片相较于对比例3的制片能够有效提高制片质量；保证菌落的边界清晰且背景杂质较少，进而说明在制片过程中控制菌悬液的浓度，能够提高制片质量，进而提高显微高光谱成像的准确性。
56.结合实施例1和对比例4并结合图1中的a1和a2以及图7中的r1和r2可以看出，虽然a1与r1中的图像中菌落都较为分散，但是在r1中菌落的分散性太大，单个菌落的数量较少，导致可扫描的单个菌落数量较少，使得光谱曲线的数量较少，进而影响显微高光谱成像分析的准确性。
57.结合实施例1-6并结合图1-图2可以看出，a1与b1中大肠杆菌的分散性均相对较好，且分散更均匀，但是结合图a2-f2可以看出，各实施例的光谱曲线的一致性均较好，说明采用菌悬液制片比采用固定液制片得到制片的菌落分散性更好，但是对光谱曲线几乎不受影响，进一步说明采用上述两种方式制片在分散性上有所差异，但是对于显微高光谱成像检测的准确性几乎不受影响。
58.结合实施例1以及实施例7-12并结合图1-图2可以看出，实施例7-12得到的制片的图像信息中g1-l1相对a1的菌落边界更加清洗，且背景杂质更少，并且g2-l2相对a2的光谱曲线的一致性更好，说明在制片过程中通过清洗液冲洗后的制片对于显微高光谱成像检测更加准确。
59.结合实施例1以及实施例13-14并结合图1与图5可以看出，实施例13-14得到的制
片的图像信息中m1-n1与a1的图像信息分散性相差不大，但是m2-n2相对a2的光谱曲线的一致性更好，说明在制片过程中，接种环采用铂金接种环，并且对铂金接种环采用等离子清洗机进行低温等离子清洗处理能进一步提高显微高光谱成像检测的准确性。
60.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，其特征在于，方法包括：将病原菌制备成菌悬液，菌悬液的浊度为3-8mcf，采用接种环将菌悬液均匀的涂在清洗灭菌后的载玻片上；或先向载玻片上滴加固定液，采用接种环将病原菌均匀的涂在滴有固定液的载玻片上；通过接种环对涂覆在载玻片上的病原菌按同一方向持续搅拌研磨，研磨时接种环与载玻片的夹角为15-35
°
；对研磨完成的载玻片进行干燥处理。2.根据权利要求1所述的一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，其特征在于：制备所述菌悬液时的稀释剂为生理盐水、磷酸缓冲盐溶液以及三乙醇胺缓冲盐溶液中的任一一种。3.根据权利要求1所述的一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，其特征在于：所述固定液为无水乙醇、75%酒精、磷酸缓冲盐溶液或三乙醇胺缓冲盐溶液中的任一一种。4.根据权利要求2所述的一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，其特征在于：在对涂有菌悬液的载玻片进行干燥处理之后，通过清洗液对涂片进行冲洗处理。5.根据权利要求4所述的一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，其特征在于：所述清洗液为75%酒精或与所述稀释剂采用相同的试剂。6.根据权利要求1所述的一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，其特征在于：所述接种环的直径为2-3mm，且所述接种环采用铂金接种环。7.根据权利要求6所述的一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，其特征在于：对所述铂金接种环进行低温等离子处理。8.根据权利要求7所述的一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法，其特征在于：对铂金接种环进行低温等离子处理时，工作气体为氧气，处理温度小于100℃，放点功率为50-500w，处理时间为5-15min，气体流速为20-35sccm。

技术总结
本申请涉及病原菌检验领域，具体公开了一种用于高光谱成像技术的病原菌制片方法。制片方法为：将病原菌制备成菌悬液，菌悬液的浊度为3-8mcf，采用接种环将菌悬液均匀的涂在清洗灭菌后的载玻片上；或先向载玻片上滴加固定液，采用接种环将病原菌均匀的涂在滴有固定液的载玻片上；通过接种环对涂覆在载玻片上的病原菌按同一方向持续搅拌研磨，研磨时接种环与载玻片的夹角为15-35


技术研发人员：林姿含 车露美 朱鹏 杨雪玲
受保护的技术使用者：西安康汇馨光检科技有限公司
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/23