一种细胞药物组织分布检测方法与流程

1.本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种细胞药物组织分布检测方法。


背景技术：

2.在细胞药物的研发过程中，药效与安全性是生物药的重要评价与筛选指标。与此同时，药物的组织分布是药物有效性与安全性的重要保障前提。因此开发一种专一、灵敏、准确的药物组织分布检测法是评估药物有效性与安全性的重要手段。
3.目前常用的生物药(如car-t药物)组织检测方法包括两种：
4.(1)其一是活体成像，即首先对受试药物进行体外荧光染色，在注入动物体内后通过成像系统检测受试动物各脏器及组织荧光强度，进而反映细胞药物的体内分布情况。但这种方法准确度受多种因素干扰，如非特异性强、灵敏度低、不可定量等，因此业内正尝试使用一种新的检测方法。
5.(2)其二是荧光定量pcr(rt-pcr)法，其原理是通过聚合链式反应检测所回输细胞药物的核酸，通过标准曲线计算药物在各组织的分布情况。这种方法具有专一性强、灵敏度高、可定量等优势，因此正被业内逐步采用。
6.当前rt-pcr法主要通过检测单位组织内目的细胞(药物)基因组，即dna表达量，依次得出药物的分布情况，但这种方法往往适用于通过基因工程改造后的细胞药物，如car-t细胞药物，因为在改造后这些细胞(药物)，其基因组获得了一段(或多段)特异性序列，因此可以根据这段序列设计引物加以检测；而对未经改造的细胞药物如nk细胞药物、γδ-t细胞药物等则只能通过检测不同物种(如人与小鼠)中的差异性序列，因此特异性较差，不能分辨目的细胞在组织中的浸润、分布情况，(即受到药物纯度影响)，例如不能分辨同种属来源的nk细胞与t细胞。


技术实现要素：

7.为解决上述问题，本发明提供一种细胞药物组织分布检测方法，基于人vγ9vδ2-t细胞设计的特异性引物组，采用rt-pcr法检测。
8.优选地，所述特异性引物的前引物序列如seq id no.1所示，后引物序列如seq id no.2所示。
9.优选地，采用的探针的序列如seq id no.3所示。
10.优选地，所述细胞药物组织分布检测方法包括：
11.基于人vγ9vδ2-t细胞设计特异性引物，以及对应的探针，并制备引物样品和探针样品；根据所述特异性引物和所述探针设计需插入质粒中的标准品序列，并制备标准品样品；
12.基于所述标准品样品、所述引物样品和所述探针样品，提取对应的组织样本；
13.基于所述组织样本提取rna样本，并反转录为cdna；
14.取cdna，配置pcr反应体系，进行扩增，并收集检测数据。
15.优选地，所述标准品序列如seq id no.4所示。
16.优选地，所述制备标准品样品还包括：
17.将所制备的标准品样品稀释成
18.将所制备的标准品样品稀释成107copys/μl、106copys/μl、105copys/μl、104copys/μl、103copys/μl和102copys/μl的系列梯度浓度；
19.所述制备引物样品和探针样品，还包括：
20.将所述引物样品和所述探针样品分别稀释至10μm。
21.优选地，所述基于所述标准品样品、所述引物样品和所述探针样品，提取对应的组织样本，包括：
22.取所述标准品样品、所述引物样品和所述探针样品的组织样本，分别制成匀浆液，经室温裂解后得到裂解液；
23.向所述裂解液中加入gdna eliminator后混匀；
24.分别加入三氯甲烷、室温孵育后，离心取上清液即得到所述组织样本。
25.优选地，所述基于所述组织样本提取rna样本，包括：
26.取所述组织样本，加入酒精后洗涤，再加入rwt缓冲溶液洗涤；离心后弃去上清液；
27.用rpe溶液洗涤，得到产物；
28.向所述产物中加入无rna酶水，离心后，收集液体即为所述rna样本。
29.优选地，所述反转录为cdna，包括：
30.测定所述rna样本的浓度；
31.根据所述rna样本浓度配置反转录体系试剂；
32.在室温反应后，加入逆转录酶、引物混合物、5倍缓冲液和双蒸水，在pcr仪中进行反转录，即得到cdna。
33.优选地，所述pcr反应体系包括：
34.pcr预混液10μl；所述引物样品中的前引物样品和后引物样品，以及所述探针样品各0.5μl；超纯水3.5μl；cdna5μl。
35.本发明提供一种细胞药物组织分布检测方法，基于人vγ9vδ2-t细胞设计的特异性引物组，采用rt-pcr法检测。所述特异性引物的前引物序列如seq id no.1所示，后引物序列如seq id no.2所示。本发明针对现有生物药组织分布检测灵敏度低、特异性差、适用范围受限等问题，提供了一种能够简便、专一、准确、灵敏且适用性强的细胞药物组织分布检测方法。该方法基于人vγ9vδ2-t细胞设计的特异性引物组，采用rt-pcr法检测，能够基于够专一性检测目的细胞(药物)在组织、器官中的分布情况。同时，除非基因工程改造的细胞药物外，此方法理论上对以γδ-t细胞为原料的基因工程改造的细胞药物也具有一定适用性。该方法对于细胞药物的组织分布、药效研究、质量控制乃至临床应用均具有重要意义。
附图说明
36.图1为本发明实施例的测试2中特异性基因表达情况示意图(采用本发明所提供方法)；
37.图2为本发明实施例的测试2中特异性基因表达情况示意图(采用传统方法)；
38.图3为本发明实施例的测试3中24小时检测小鼠肝脏与肺组织目的基因表达情况示意图；
39.图4为通过本发明测试4中基于转录组的标准曲线(采用本发明所提供方法)；
40.图5为通过本发明测试4中基于基因组的标准曲线(采用传统方法)。
41.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
42.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
44.如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由
…
组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
45.在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
46.本发明中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的
±
10％，优选
±
5％。
47.此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
48.以下仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
49.下面结合具体实施例的方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
50.本发明提供一种细胞药物组织分布检测方法，基于人vγ9vδ2-t细胞设计的特异性引物组，采用rt-pcr法检测。
51.上述，vγ9vδ2t细胞又名vγ2vδ2t细胞，占人体外周血细胞约1-10％、γδt细胞的90％左右，在人体先天性免疫和后天免疫中发挥重要作用。vγ9vδ2-t细胞作为一种免疫细胞，具有良好的医学治疗和/或用于人vγ9vδ2t细胞的检测的功能。
52.上述，采用基于人vγ9vδ2-t细胞设计的特异性引物组，利用rt-pcr法检测的目的是为了实现高度特异性的细胞药物组织分布检测。采用该方法可以避免非特异性干扰，减少误判的发生率，从而提高检测的准确性和灵敏度。此外，由于vγ9vδ2-t细胞在人体中具
有较高的丰度和广泛的组织分布，在设计引物时选择其特异性序列进行设计能够更好地保证检测结果的可靠性。
53.进一步的，所述特异性引物的前引物序列如seq id no.1所示，后引物序列如seq id no.2所示。
54.本实施例中，采用特定的前引物和后引物序列的选择是为了实现对目标细胞(药物)的高度特异性识别和扩增。在设计引物时，选择与目标细胞(药物)特异性结合的引物序列可以最大程度降低不必要的反应和扩增，从而提高检测的准确性和特异性。
55.进一步的，采用的探针的序列如seq id no.3所示。
56.采用特定的探针序列可以实现对扩增产物的定量检测。通过选择合适的探针序列，可以使扩增产物与探针结合并释放荧光信号，进而实现对扩增产物的定量检测。因此，采用特定的探针序列可以提高检测的准确性和灵敏度，避免误判的发生率。
57.总之，采用基于人vγ9vδ2-t细胞设计的特异性引物组，采用rt-pcr法检测的方法具有高度特异性、准确性和灵敏度高等优点，能够更好地保证细胞药物组织分布检测的可靠性和有效性。同时，采用特定的引物和探针序列可以进一步提高检测的特异性和灵敏度，避免误判的发生率。
58.上述，引物组和探针的序列，分别为如下表格所示：
59.表1、引物组和探针的序列表
60.no.类型序列(5
’‑3’
)1前引物tcaactggtacaggaagacccaa2后引物acagccaggttctttgcaat3探针aaccagggccatagatgtcctt
61.本发明针对现有生物药组织分布检测灵敏度低、特异性差、适用范围受限等问题，提供了一种能够简便、专一、准确、灵敏且适用性强的细胞药物组织分布检测方法。该方法基于人vγ9vδ2-t细胞设计的特异性引物组，采用rt-pcr法检测，能够基于够专一性检测目的细胞(药物)在组织、器官中的分布情况。同时，除非基因工程改造的细胞药物外，此方法理论上对以γδ-t细胞为原料的基因工程改造的细胞药物也具有一定适用性。该方法对于细胞药物的组织分布、药效研究、质量控制乃至临床应用均具有重要意义。
62.进一步的，所述细胞药物组织分布检测方法包括：
63.步骤s100，基于人vγ9vδ2-t细胞设计特异性引物，以及对应的探针，并制备引物样品和探针样品；根据所述特异性引物和所述探针设计需插入质粒中的标准品序列，并制备标准品样品；
64.步骤s200，基于所述标准品样品、所述引物样品和所述探针样品，提取对应的组织样本；
65.步骤s300，基于所述组织样本提取rna样本，并反转录为cdna；
66.步骤s400，取cdna，配置pcr反应体系，进行扩增，并收集检测数据。
67.上述，特异性引物中，包括前引物和后引物。根据人vγ9vδ2-t细胞，分别设计得到特异性引物和探针，并且根据特异性引物，设计得到标准品序列，分别制备对应的样品。
68.在步骤s100中，进行基于人vγ9vδ2-t细胞设计特异性引物和探针，并制备标准品样品。这一步骤的目的是根据所需检测的靶分子(如药物或特定生物标志物)，设计具有高
度特异性的引物和探针，并通过制备标准品样品进行验证。引物和探针的设计是基于vγ9vδ2-t细胞的特异性序列并进行合理选取，以增加检测的特异性和灵敏度。
69.其优点在于，可以根据需要快速、准确地设计特异性引物和探针，从而达到高效、高灵敏的检测目的。此外，制备标准品样品可以帮助确定pcr反应的最佳条件，以及量化扩增过程中的产物。
70.例如，需要检测某种肿瘤标志物在患者组织样本中的表达水平，可以根据该标志物的特异性序列设计引物和探针，并选择vγ9vδ2-t细胞的特异性序列作为靶序列。再制备一个包含该标志物完整序列的标准品样品，用于验证引物和探针的特异性和准确性。
71.在步骤s200中进行提取组织样本。这一步骤的目的是从患者样本中提取含有所需靶分子(如药物或生物标志物)的组织样本。提取方法可以根据具体样本类型进行选择，例如利用离心过程或化学裂解法提取细胞样本中的rna等。该步骤优点在于，可以从复杂的样本中提取含有所需靶分子的组织样本，并保证样本的质量和纯度达到检测要求。
72.在步骤s300中，反转录为cdna。这一步骤的目的是将提取的rna样本反转录为与其相应的cdna，以便进一步进行pcr扩增。反转录时需要加入逆转录酶和引物样品。其优点在于，可以将rna转录为cdna，方便后续pcr扩增。此外，引物样品的添加可以保证反转录的特异性和准确性。
73.在步骤s400中，进行pcr扩增和数据收集。这一步骤的目的是利用引物和探针对cdna进行pcr扩增，并收集扩增产物的检测数据。pcr反应体系包括所需引物、探针和其他反应条件。
74.该方法的优点在于，可以通过pcr扩增快速、灵敏地检测靶分子的表达或存在情况。采用合适的引物和探针可以提高检测的准确性和特异性。
75.进一步的，所述标准品序列如seq id no.4所示。
76.上述，标准品的序列，是根据引物序列设计需插入质粒中的标准品序列。其序列如下表所示：
77.表2、标准品的序列表
[0078][0079]
采用特定的标准品序列，目的是为了验证所设计的引物和探针的特异性和准确性，并帮助优化pcr反应条件。在制备标准品时，可以根据所需检测物质的完整序列设计合适的标准品序列，并将其插入参考质粒中。随后，将参考质粒扩增并纯化，得到含有标准品序列的dna样品。该标准品样品可以作为正常样本进行pcr扩增反应，并与患者组织样本进行比较分析，从而判断pcr反应的准确性和灵敏度。
[0080]
采用标准品的优点在于，可以帮助确定最佳的pcr反应条件，以及量化扩增产物的浓度，从而提高检测结果的准确性和可靠性。此外，在不同实验室或操作人员之间进行数据
比较和共享时，采用相同的标准品序列也可以保证数据的可比性和一致性。
[0081]
总之，以上方法通过特异性引物和探针的设计、标准品样品的制备和pcr扩增等步骤，可以高效、快速地检测所需靶分子在组织中的表达或存在情况，并具有高度的准确性和特异性。同时，采用合适的标准品序列还可以帮助验证检测方法的准确性和优化pcr反应条件，提高检测结果的可靠性和重复性。
[0082]
进一步的，所述步骤s100中，制备标准品样品还包括：
[0083]
步骤s110，将所制备的标准品样品稀释成107copys/μl、106copys/μl、105copys/μl、104copys/μl、103copys/μl和102copys/μl的系列梯度浓度；
[0084]
所述步骤s100中，制备引物样品和探针样品，还包括：
[0085]
步骤s120，将所述引物样品和所述探针样品分别稀释至10μm。
[0086]
上述，在进行系列梯度浓度稀释时，参考如下公式：
[0087]
质粒拷贝数浓度(copies/μl)＝(6.02
×
10
23
)
×
(质粒度
×
10-9
)/dna碱基数
×
660)。
[0088]
上述，在进行标准品样品、引物样品和探针样品的稀释时，采用超纯水(depc水)进行稀释。
[0089]
上述，在细胞药物组织分布的检测中，步骤s110中将所制备的标准品样品稀释成不同浓度，目的是为了建立一个标准曲线，用于后续定量pcr分析。
[0090]
在步骤s120中，引物样品和探针样品被稀释至10μm，目的是为了得到一定的工作浓度范围，从而能够精确地进行pcr扩增和检测。同时，合适的引物和探针浓度也可以提高pcr反应的特异性和灵敏度。
[0091]
这些步骤的主要效果和优点包括：
[0092]
(1)建立标准曲线能够更加准确地定量实际样品中的细胞、药物或组织数量，从而提高pcr检测结果的可靠性。
[0093]
(2)使用合适的引物和探针浓度能够提高pcr反应的特异性和灵敏度，减少假阳性或假阴性结果的发生。
[0094]
(3)稀释样品可以避免在pcr反应中出现抑制作用，从而提高pcr反应的成功率和准确性。
[0095]
(4)通过合适的稀释和浓度调整，可以更好地控制pcr反应过程中的变量，从而提高实验重复性和可比性。
[0096]
进一步的，所述步骤s200中，基于所述标准品样品、所述引物样品和所述探针样品，提取对应的组织样本，包括：
[0097]
步骤s210，取所述标准品样品、所述引物样品和所述探针样品的组织样本，分别制成匀浆液，经室温裂解后得到裂解液；
[0098]
上述，所述组织样本，为小于50mg的样本；其可以为细胞样本，为小于小于5
×
107cells。
[0099]
在制备匀浆液时，取所述组织样本，其中加入900μl的qiazol lysis reagent(qiazol裂解试剂)。再将混合后的组织样本(或细胞样本)充分研磨成所述匀浆液。
[0100]
将所述匀浆液，在室温条件下裂解5分钟，完成裂解，从而得到裂解液。
[0101]
步骤s220，向所述裂解液中加入gdna eliminator后混匀；
[0102]
步骤s230，分别加入三氯甲烷、室温孵育后，离心取上清液即得到所述组织样本。
[0103]
向所述裂解液中，加入100μl的gdna eliminator(即gdna裂解分离柱)后混匀。再向每个gdna eliminator管中，加入180μl三氯甲烷；剧烈混匀后置于室温孵育3分钟，离心(12000g,15min,4℃,升0降0)取上清液；将所述上清夜转移至一新的ep管(离心管)中(吸取过程中勿吸取或扰动中间层与下层)，即得到所述组织样本。
[0104]
进一步的，所述步骤s300，中，基于所述组织样本提取rna样本，包括：
[0105]
步骤s310，取所述组织样本，加入酒精后洗涤，再加入rwt缓冲溶液洗涤；离心后弃去上清液。
[0106]
其中，优选的技术方案中，酒精为70％酒精。
[0107]
上述，向转移后的组织样本(上清液)中加入等体积的70％酒精，如600μl。进行颠倒混匀，室温静置3-5分钟。吸取700μl混合液，加入至预装好的rneasy mini spin column(rneasy微型收集管)中分离，离心(8000g,30秒)，弃去收集管中的滤液后回收使用收集管，将剩余的液体转移至rneasy mini spin column中。
[0108]
重复进行一次上述操作，即将收集管进行离心，弃去收集管中的滤液后回收使用收集管，将剩余的液体转移至rneasy mini spin column中，向rneasy mini spin column中加入700μl已配置好的rwt缓冲液。
[0109]
上述，rwt缓冲液的配置：取试剂盒中的rwt原液，向其中加入2倍体积的无水乙醇，即得到所述rwt缓冲液。
[0110]
将混合后的溶液进行离心(8000g，30秒)，弃去收集管中的滤液后回收使用收集管。
[0111]
步骤s320，用rpe溶液洗涤，得到产物；
[0112]
向rneasy mini spin column(rneasy微型收集管)中加入500μl已配置好的rpe溶液，离心(8000g,30秒)分离后，弃去收集管中的滤液后回收使用收集管。
[0113]
其中，rpe溶液的配置方法为：向试剂盒中的rpe原液中加入4倍体积的无水乙醇。
[0114]
重复上述操作一次，即再加入500μl已配置好的rpe溶液，离心(8000g,30秒)分离后，弃去收集管中的滤液后回收使用收集管，即得到所述产物。
[0115]
步骤s330，向所述产物中加入无rna酶水，离心后，收集液体即为所述rna样本。
[0116]
将产物所在的收集管放置于一新1.5ml的ep管中，向收集管中加入30μl的无rna酶水；离心(8000g,1分钟)分离，该ep管中收集的液体即为制备好的所述rna样本。
[0117]
进一步的，所述步骤s300中，反转录为cdna，包括：
[0118]
步骤s340，测定所述rna样本的浓度；
[0119]
上述，实施例中，用nano drop测定所得到的rna样本的浓度。
[0120]
步骤s350，根据所述rna样本浓度配置反转录体系试剂；
[0121]
其中，反转录体系试剂如下表所示：
[0122]
表3、反转录体系试剂表(以500ng为例)
[0123]
no.试剂配置量15
×
gdna eraser buffer(5倍gdna去除缓冲液)2μl2gdna eraser(gdna去除试剂)1μl3total rna(总rna抽提试剂)xμl
4ddh2o(双蒸水)(10-x)μl
[0124]
步骤s360，在室温反应后，加入逆转录酶、引物混合物、5倍缓冲液和双蒸水，在pcr仪中进行反转录，即得到cdna。
[0125]
上述，室温反应5分钟，加入如下表所示试剂：
[0126]
表4、反应后补充试剂表
[0127]
no.试剂配置量1primer script rt enzyme mix(逆转录酶)1μl2rt primer mix(引物混合物)4μl35
×
primer script buffer(5倍gdna去除缓冲液)4μl4ddh2o(双蒸水)1μl
[0128]
上述，在加入补充试剂后，进行反转录程序，其程序如下：
[0129]
(1)37℃，15分钟；
[0130]
(2)85℃，5秒；
[0131]
(3)4℃，程序hold，得到cdna。
[0132]
再将上述程序得到的cdna用超纯水进行稀释，稀释倍数为5-10倍，得到稀释液，并按照如下配置pcr反应体系：
[0133]
所述pcr反应体系包括：
[0134]
(1)pcr预混液(5
×
gdnaeraser buffer)10μl；
[0135]
(2)所述引物样品中的前引物样品和后引物样品，以及所述探针样品各0.5μl；
[0136]
(3)超纯水3.5μl；
[0137]
(4)cdna5μl。
[0138]
将上述反应体系置于荧光pcr仪中按下示程序进行扩增并收集数据：
[0139]
(1)95℃，3分钟；
[0140]
(2)95℃，15秒；(45个循环)
[0141]
(3)60℃，1分30秒(收集信号)
[0142]
(4)40℃，1分钟。
[0143]
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0144]
实施例1：设计特异性引物、探针，以及标准品。
[0145]
基于人vγ9vδ2-t细胞设计特异性引物，以及对应的探针，并制备引物样品和探针样品；根据所述特异性引物和所述探针设计需插入质粒中的标准品序列，并制备标准品样品，具体序列如下(5
’‑3’
)：
[0146]
(1)前引物序列：tcaactggtacaggaagacccaa；
[0147]
(2)后引物序列：acagccaggttctttgcaat；
[0148]
(3)探针序列：aaccagggccatagatgtcctt；
[0149]
(4)标准品序列：
[0150]
tatatcaactggtacaggaagacccaaggtaacacaatgactttc atataccgagaaaaggacatctatggccctggtttcaaagacaatttc caaggtgacattgatattgcaaagaacctggctgtactt。
[0151]
实施例2：制备组织样本。
[0152]
基于所述标准品样品、所述引物样品和所述探针样品，提取对应的组织样本；
[0153]
(1)在制备匀浆液时，取所述组织样本，其中加入900μl的qiazol lysis reagent(qiazol裂解试剂)。再将混合后的组织样本(或细胞样本)充分研磨成所述匀浆液。将所述匀浆液，在室温条件下裂解5分钟，完成裂解，从而得到裂解液。
[0154]
(2)向所述裂解液中，加入100μl的gdna eliminator(即gdna裂解分离柱)后混匀。再向每个gdna eliminator管中，加入180μl三氯甲烷；剧烈混匀后置于室温孵育3分钟，离心(12000g,15min,4℃,升0降0)取上清液；将所述上清夜转移至一新的ep管(离心管)中(吸取过程中勿吸取或扰动中间层与下层)，即得到所述组织样本。
[0155]
实施例3：反转录为cdna
[0156]
基于所述组织样本提取rna样本，并反转录为cdna。
[0157]
(1)向转移后的组织样本(上清液)中加入等体积的70％酒精，如600μl。进行颠倒混匀，室温静置3-5分钟。吸取700μl混合液，加入至预装好的rneasy mini spin column(rneasy微型收集管)中分离，离心(8000g,30秒)，弃去收集管中的滤液后回收使用收集管，将剩余的液体转移至rneasy mini spin column中。
[0158]
重复进行一次上述操作，即将收集管进行离心，弃去收集管中的滤液后回收使用收集管，将剩余的液体转移至rneasy mini spin column中，向rneasy mini spin column中加入700μl已配置好的rwt缓冲液。
[0159]
将混合后的溶液进行离心(8000g，30秒)，弃去收集管中的滤液后回收使用收集管。
[0160]
(2)向rneasy mini spin column(rneasy微型收集管)中加入500μl已配置好的rpe溶液，离心(8000g,30秒)分离后，弃去收集管中的滤液后回收使用收集管。
[0161]
重复上述操作一次，即再加入500μl已配置好的rpe溶液，离心(8000g,30秒)分离后，弃去收集管中的滤液后回收使用收集管，即得到所述产物。
[0162]
(3)将产物所在的收集管放置于一新1.5ml的ep管中，向收集管中加入30μl的无rna酶水；离心(8000g,1分钟)分离，该ep管中收集的液体即为制备好的所述rna样本。
[0163]
(4)用nano drop测定所得到的rna样本的浓度
[0164]
(5)根据所述rna样本浓度配置反转录体系试剂(如表3)；
[0165]
(6)在室温反应后，加入逆转录酶、引物混合物、5倍缓冲液和双蒸水，在pcr仪中进行反转录，即得到cdna。
[0166]
实施例4：根据pcr反应体系扩增并测试。
[0167]
取cdna，配置pcr反应体系，进行扩增，并收集检测数据。
[0168]
将上述程序得到的cdna用超纯水进行稀释，稀释倍数为5-10倍，得到稀释液，并按照如下配置pcr反应体系：
[0169]
所述pcr反应体系如下表：
[0170]
表5、pcr反应体系表
[0171][0172][0173]
将上述反应体系置于荧光pcr仪中按下示程序进行扩增并收集数据。
[0174]
(1)95℃，3分钟；
[0175]
(2)95℃，15秒；(45个循环)
[0176]
(3)60℃，1分30秒(收集信号)
[0177]
(4)40℃，1分钟。
[0178]
基于上述实施例1中所设计得到的特异性引物、探针，以及标准品，利用实施例2-4中的方法进行对样本的测试。
[0179]
材料与试剂：
[0180]
材料：外周血免疫细胞，扩增的γδ-t细胞，未回输γδ-t细胞小鼠脏器(肝脏与肺组织，后同)，回输3千万γδ-t细胞小鼠脏器，回输5千万γδ-t细胞小鼠脏器，质粒标准品，引物与探针。
[0181]
试剂：如下表所示
[0182]
表6、实验中使用试剂表
[0183][0184]
测试1、稳定性测试：
[0185]
实验方法：基于上述实施例1中所设计得到的特异性引物、探针，以及标准品，利用实施例2-4中的方法，进行标准曲线绘制，针对单一样本，分别5次测试。
[0186]
实验结果：标准曲线拟合常数r2均在0.99以上，具体参见下表：
[0187]
表7、标准曲线拟合常数表
[0188][0189]
测试2、准确性测试：
[0190]
(1)外周血与扩增培养后细胞特异性基因表达：
[0191]
实验方法：基于上述实施例1中所设计得到的特异性引物、探针，以及标准品，利用实施例2-4中的方法，定量检测外周血(目的细胞占比1.6％-1.9％)与扩增培养后目的细胞(目的细胞占比92％-94％)特异性基因表达情况。
[0192]
实验结果：
[0193]
相较于基因组pcr检测，基于对目的细胞特异性表达基因的转录组检测可专一性检出目的细胞，从而排除同种属非目的细胞干扰。
[0194]
参考图1，结果显示，外周血目的基因表达水平与培养后目的细胞表达水平比的中值为1/46.62。同时，与实际情况相一致，表明本发明中所采用的方法准确、可靠性高。
[0195]
(2)方法间横向比对：
[0196]
实验方法：将基于上述实施例1中所设计得到的特异性引物、探针，以及标准品，利用实施例2-4中的方法，与传统方法进行对比，以校验两种方法之间的准确性。
[0197]
基于以sbry-green染料为代表的传统检测法对相同处理样本检测。
[0198]
实验结果：
[0199]
参考图2，虽然传统方法也能反映出外周血与扩增培养后目的基因表达之间的差异，但外周血目的基因表达水平与培养后目的细胞表达水平比的中值仅为1/8.049(如图2所示)，严重偏离实际情况，表明本发明所提供的方法具备准确性高的特点。
[0200]
测试3、特异性测试：
[0201]
对于细胞药物组织分布检测，其技术关键点除稳定性好、专一性强之外，应还具有特异性高的特点，即只检测对应种属的特定基因，而对相异种属同种基因不具识别与扩增特性。
[0202]
测试方法：基于上述实施例1中所设计得到的特异性引物、探针，以及标准品，利用实施例2-4中的方法，将不同数量的目的细胞回输至小鼠体内后24小时检测小鼠肝脏与肺组织目的基因表达情况。
[0203]
测试结果：
[0204]
如图3所示，在未回输组小鼠肝脏与肺组织均不能检测到目的基因的表达，与预期
相符。
[0205]
同时，无论是肝脏或肺组织，回输5千万个细胞(50m)组目的基因表达均高于回输3千万个细胞(30m)组，与实际情况相符，表明本发明所提供的方法具备特异性强的特点。
[0206]
测试4、检测范围和灵敏度测试：
[0207]
检测灵敏度是评价一种检测方法的重要指标之一。
[0208]
本发明所提供的细胞药物组织分布检测方法，其理论检测范围在102-107copys/μl，具有较为广泛的检测范围。
[0209]
在实际检测中，本发明的细胞药物组织分布检测方法，在样本表达量低于标曲检测范围时仍具有较好的检测效果，在目前已得到的数据中发现，最低检测限度可达到6-7copys/μl，优于目前已公布的绝大多数检测方法。
[0210]
进一步的，将本方法(细胞药物组织分布检测方法，即基于转录组的rt-pcr检测法)与传统方法(基于基因组的rt-pcr检测法)在检测灵敏度层面进行对比，发现两种方法都能稳定、准确地绘制标准曲线(r2均大于0.99，如图4和图5，图4为基于转录组的标准曲线，图5为基于基因组的标准曲线)，由图4和图5可见，两种检测方法稳定性与准确性。
[0211]
并且本发明所提供的细胞药物组织分布检测方法，对待检样本均体现出较好的检测结果(详见测试3，特异性测试)，但传统方法对于待测阳性样本(n＝4)只有1例检出，且此例检出的样本ct值高(ct值均值为30.96)，超出标曲检测下限(ct值均值为27.25)。
[0212]
以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量和反应容器的调整，例如采用连续流动反应器，这些都属于本发明的保护范围之内。以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量的调整，这些都属于本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种细胞药物组织分布检测方法，其特征在于，基于人vγ9vδ2-t细胞设计的特异性引物组，采用rt-pcr法检测。2.如权利要求1所述细胞药物组织分布检测方法，其特征在于，所述特异性引物的前引物序列如seq id no.1所示，后引物序列如seq id no.2所示。3.如权利要求1所述细胞药物组织分布检测方法，其特征在于，采用的探针的序列如seq id no.3所示。4.如权利要求1所述细胞药物组织分布检测方法，其特征在于，所述细胞药物组织分布检测方法包括：基于人vγ9vδ2-t细胞设计特异性引物，以及对应的探针，并制备引物样品和探针样品；根据所述特异性引物和所述探针设计需插入质粒中的标准品序列，并制备标准品样品；基于所述标准品样品、所述引物样品和所述探针样品，提取对应的组织样本；基于所述组织样本提取rna样本，并反转录为cdna；取cdna，配置pcr反应体系，进行扩增，并收集检测数据。5.如权利要求4所述细胞药物组织分布检测方法，其特征在于，所述标准品序列如seq id no.4所示。6.权利要求4所述细胞药物组织分布检测方法，其特征在于，所述制备标准品样品还包括：将所制备的标准品样品稀释成107copys/μl、106copys/μl、105copys/μl、104copys/μl、103copys/μl和102copys/μl的系列梯度浓度；所述制备引物样品和探针样品，还包括：将所述引物样品和所述探针样品分别稀释至10μm。7.如权利要求4所述细胞药物组织分布检测方法，其特征在于，所述基于所述标准品样品、所述引物样品和所述探针样品，提取对应的组织样本，包括：取所述标准品样品、所述引物样品和所述探针样品的组织样本，分别制成匀浆液，经室温裂解后得到裂解液；向所述裂解液中加入gdna eliminator后混匀；分别加入三氯甲烷、室温孵育后，离心取上清液即得到所述组织样本。8.如权利要求4所述细胞药物组织分布检测方法，其特征在于，所述基于所述组织样本提取rna样本，包括：取所述组织样本，加入酒精后洗涤，再加入rwt缓冲溶液洗涤；离心后弃去上清液；用rpe溶液洗涤，得到产物；向所述产物中加入无rna酶水，离心后，收集液体即为所述rna样本。9.如权利要求4所述细胞药物组织分布检测方法，其特征在于，所述反转录为cdna，包括：测定所述rna样本的浓度；根据所述rna样本浓度配置反转录体系试剂；在室温反应后，加入逆转录酶、引物混合物、5倍缓冲液和双蒸水，在pcr仪中进行反转录，即得到cdna。10.如权利要求4所述细胞药物组织分布检测方法，其特征在于，所述pcr反应体系包
括：pcr预混液10μl；所述引物样品中的前引物样品和后引物样品，以及所述探针样品各0.5μl；超纯水3.5μl；cdna5μl。

技术总结
本发明提供一种细胞药物组织分布检测方法，属于生物化学技术领域。所述细胞药物组织分布检测方法基于人Vγ9Vδ2-T细胞设计的特异性引物组，采用RT-PCR法检测。本发明所提供检测方法，基于人Vγ9Vδ2-T细胞设计的特异性引物组，采用RT-PCR法检测，能够基于够专一性检测目的细胞(药物)在组织、器官中的分布情况。同时，除非基因工程改造的细胞药物外，此方法理论上对以γδ-T细胞为原料的基因工程改造的细胞药物也具有一定适用性。该方法对于细胞药物的组织分布、药效研究、质量控制乃至临床应用均具有重要意义。床应用均具有重要意义。床应用均具有重要意义。


技术研发人员：邬曾峰 詹铭杰 徐艳 李曼 何柳 向征 尹芝南
受保护的技术使用者：广东暨德康民生物科技有限责任公司
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/23