一种多波长荧光激发采集系统的制作方法

[0002][0003]
本发明涉及荧光检测技术领域，具体而言，涉及一种多波长荧光激发采集系统。


背景技术：

[0004][0005]
呼吸道感染的病原体种类较多，不同病原体感染的临床症状和体征相似，但治疗方法和病程发展时间差异显著。实时荧光定量pcr技术作为目前国际公认的、病原体检测应用最广泛和最稳定的分子检测技术，被视为呼吸道传染病等病原体实验室确证的金标准。pcr仪或核酸提取扩增一体机的单次运行检测靶标数，也就成了制约检测效率的关键指标。
[0006]
市面常见的荧光定量pcr仪一般提供4-6个检测通道，难以满足日益增长的多联检需求；部分仪器未能解决通道间信号串扰问题，更限制了检测通道的可用选择。其原因主要是仪器光学系统的波长分辨能力不足，导致某一通道激发光能同时激发相邻通道探针，或邻近通道荧光信号被一并采集分析，发生信号串扰。而光学系统集成度和驱动精度不足，也限制了多波长光学系统的现场化应用。


技术实现要素：

[0007][0008]
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种多波长荧光激发采集系统，可提供多达12色荧光通道的激发-采集功能。
[0009]
本发明提供的具体技术方案如下：所述多波长荧光激发采集系统包括多波长激发光源和荧光采集模块；所述多波长激发光源可发出多个预设波长的激发光至被测样品，所述荧光采集模块设置在被测样品一侧，在进行pcr反应时，采集所述被测样品受所述激发光辐照后发出的发射光；
[0010]
所述多通道激发光源包括底座和光束整形机构；
[0011]
所述底座设有若干光源座，每一所述光源座设有一单色光源；所述单色光源可以为发光二极管led与带通滤光片的组合，或激光二极管ld；所述滤光片的通过波长半高宽不超过
±
5 nm，截止率不低于od6，通过波长与所述led的中心波长相应；所述单色光源发出的激发光，经所述滤光片筛选波长后进入所述光束整形机构；
[0012]
优选地，所述底座还连接有散热机构，以鳍状或针状金属结构导走所述单色光源工作时产生的热能，保证光源工作性能稳定。
[0013]
所述光束整形机构设有透镜座、反射镜座和镜筒，所述透镜座设有第一透镜，所述第一透镜与底座成90
°
角，可对所述单色光源发出的激发光进行初步光束整形，减小发散角、降低光能损耗；所述反射镜座设有反射镜，所述反射镜与底座成45
°
角，其可改变所述激发光方向至与底座环形结构同轴；所述镜筒设有第二透镜，其与底座平行，可对所述改变方向后的激发光精细整形，使其接近准直出射，以近似点光源的形式辐照于被测样品；
[0014]
优选地，所述反射镜可以为按阵列排布的反射镜组；所述单色光源发出的激发光
经所述第一透镜整形后，被所述反射镜组的各子反射镜，依照各自排布角度投射为由多个近似点光源组成的阵列，辐照于同样按阵列排布的多个被测样品。
[0015]
优选地，所述第二透镜可以为n
×
1合束光纤（n≤12）；所述单色光源发出的激发光经所述反射镜变向后，由合束光纤1端入射、n端出射，辐照于按光纤端口位置排布的多个被测样品。
[0016]
所述光束整形机构还连接有步进电机，其运动时可带动光束整形机构整体转动，配合每一所述单色光源的开启或关闭，可将不同波长的激发光依次辐照至被测样品；
[0017]
所述荧光采集模块设置于所述被测样品的一侧，用于采集被测样品受激发光辐照后发出的发射光；
[0018]
优选地，所述荧光采集模块可以是光谱仪、法布里－珀罗干涉仪或连续滤光片与探测器的组合；所述被测样品发出的发射光，由所述光谱仪采集，或经所述法布里-珀罗干涉仪或连续滤光片筛选通过波长后，由所述探测器采集；所述荧光采集模块检测光谱的波长范围至少为340-850 nm；所述荧光采集模块能够检测到全部所述激发光和所述发射光。
[0019]
优选地，所述反射镜可以为半透半反镜；所述荧光采集模块与底座位于所述半透半反镜的同一侧；所述半透半反镜仅允许所述激发光单向透射，并使与所述发射光同向的激发光反射，即仅使所述发射光透过后由所述荧光采集模块采集，避免信号干扰。
[0020]
优选地，所述单色光源发出的激发光，一部分由一光电二极管接收，另一部分继续经所述光束整形机构调制后辐照向所述被测样品；所述光电二极管的响应波长范围至少为340-800 nm，其可根据采集到的所述激发光光功率pn与预设光功率pn0，对所述单色光源的驱动电流in进行负反馈调节，使之等于
[0021][0022]
从而使所述激发光达到稳定的预设光功率，避免因光源工作发热等原因导致光功率浮动。
[0023]
优选地，所述荧光采集模块采集所述发射光并转换为数字信号后，还要经过串扰校正算法处理。具体来说，先通过试验计算得到邻近荧光通道的荧光物质在一同被激发时，发射光的强度比例系数；再以所述系数形成串扰校正算法，从采集到的本通道发射光信号中，扣除邻近通道信号与所述系数的乘积，即可得到单纯本通道发射光的强度数值。
[0024]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0025]
（1）本发明提供的荧光激发采集系统，可大幅提升pcr仪类仪器光学系统的荧光通道数，进而提升单次、单管检测的可检测靶标数；
[0026]
（2）本发明提供的多波长激发光源采用体积较小的发光、滤光和光束整形模块，满足仪器高集成度的同时，还能保证高控制精度；
[0027]
（3）本发明提供的荧光采集模块结合串扰校正算法，可确保相邻荧光通道间的荧光串扰强度不超过阳性判别阈值，支撑提升荧光通道数的可行性；
[0028]
（4）本发明提供的光功率负反馈控制，可根据驱动、耦合效率等进行自适应性地强度补偿，保证光源的光功率保持一致。
附图说明
[0029][0030]
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
[0031]
图1为本发明实施例的光源-芯片-光谱仪结构示意图；
[0032]
图2为本发明实施例的光源-芯片-光谱仪光路示意图；
[0033]
图3为本发明实施例的多波长激发光源整体结构示意图；
[0034]
图4为本发明实施例的多波长激发光源部分结构示意图；
[0035]
图5为本发明实施例的多波长激发光源部分光路示意图。
[0036]
图6为本发明实施例的芯片装置结构示意图；
[0037]
图7为本发明实施例的第一组荧光物质的吸收谱、发射谱与采集波长；
[0038]
图8为本发明实施例的第二组荧光物质的吸收谱、发射谱与采集波长；
[0039]
图9为本发明实施例的第三组荧光物质的吸收谱、发射谱与采集波长。
具体实施方式
[0040][0041]
下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。
[0042]
需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0043]
此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0044]
请参阅图1所示，其为本发明实施例的光源-芯片-光谱仪结构示意图；本实施例系统包括：多波长激发光源1、荧光采集模块2、芯片装置3以及温控模块4。
[0045]
参阅图2所示，其为本发明实施例的光源-芯片-光谱仪光路示意图；所述多波长激发光源1发出预设波长的激发光，辐照至所述芯片装置3的pcr反应仓321，其内的所述被测样本进行pcr反应时，发出的所述发射光由所述荧光采集模块2采集，所述温控模块4控制其自身与所述芯片装置3前端pcr反应仓321的温度，使其内部达到最佳的反应状态。
[0046]
参阅图3所示，其为本发明实施例的多波长激发光源的整体结构示意图。图4为本实施例的多波长激发光源的部分结构示意图，除底座、光束整形机构外仅包含一个光源座，以便观察内部结构。所述多波长激发光源1包括底座11，用以承载各所述光源座12。在实施例中，每一所述光源座12上设有一pcb板13，可承载、控制led光源14，每一所述led光源14前设置一滤光片15，用以对led光源发出的激发光进行波长筛选，以得到预设波长的激发光。
[0047]
具体而言，本发明实施例中各led光源的中心波长为：361、405、450、468、495、528、558、587、649、675、740及790nm。
[0048]
所述环形底座11中心是所述光束整形机构16，下方还设有步进电机17和pcb板18，用于控制、驱动所述光束整形机构16的工作、运动。图5为本实施例的多波长激发光源的部分光路示意图。所述光束整形机构16上设有透镜座161、反射镜座162以及镜筒163，透镜座161上设有第一透镜，用以将发散角较大的激发光初步整形，减少光能损耗；反射镜座162上设有反射镜，其与底座11成45
°
角，用以改变初步整形的激发光方向至与底座11同轴向上；镜筒163内设有第二透镜，其与底座11整体平行，用以对所述激发光再次整形至近准直出射。本实施例中，镜筒163上端还设有第二反射镜164，可再次改变激发光方向，最终辐照于所述芯片装置3前端的pcr反应仓321。
[0049]
参阅图6所示，其为本发明实施例的芯片装置结构示意图。本实施例提供的所述芯片装置3包括加样层31和管路层32，所述加样层、管路层从上至下依次设置。所述加样层31包括加样孔311和试剂管312，所述加样孔用于加入样品,所述试剂管用于预制核酸提取纯化试剂,所述管路层32包括pcr反应仓321,所述pcr反应仓321内预置有风干试剂,所述风干试剂包含荧光标记物质，其中,加样孔内的样品和核酸提取纯化试剂反应后混合进入所述pcr反应仓，从而得到所述被测样品。
[0050]
在本发明实施例中，所述荧光标记物质包括：amca、cf405l、atto425、alexafluor430、fam、hex、cy3、rox、cy5、cy5.5、cy7以及alexafluor790，其吸收波长与发射波长如表1所示。
[0051]
表1各荧光染料的吸收波长与发射波长。
[0052]
通道吸收波长（nm）荧光染料采集波长（nm）1361amca4482405cf405l5463450atto4254684468alexafluor4305465495fam5206528hex5507558cy35658587rox6089649cy566010675cy5.570011740cy776012790alexafluor790805
[0053]
所述荧光采集模块2设置在所述发射光的光路上，用以采集所述发射光。在本实施例中，所述荧光采集模块2可以为光谱仪。具体地，本实施例中的光谱仪不包括滤光片，因此可以同时检测多个波长的所述激发光，以及受激发生的所述发射光。如光谱仪可以为滨松的c12880ma。
[0054]
采集到所述发射光信号后，还需经过串扰校正算法处理，以从各个邻近荧光通道混合信号中，解耦得到单纯的本通道荧光信号。具体地，本实施例中按各通道发生串扰的相
关性，将12种荧光染料分为三组；再按照各组荧光物质的吸收谱与发射谱数据，设计各通道的激发-采集-解耦算法为——
[0055]
参阅图7所示：（1）amca选择361nm激发、448nm采集，仅造成atto 425不足满额荧光值3%的串扰，可忽略。可得amca净荧光值；（2）atto 425选择450nm激发、468nm采集，不激发amca、cf405l，仅激发alexa fluor 430，且不采集alexa fluor 430。可得atto 425净荧光值；（3）alexa fluor 430选择468nm激发、546nm采集，可造成atto 425 20%激发
×
23%采集≈5%，可忽略；以及cf405l 4.4%激发
×
100%采集=4.4%串扰，可忽略。可得alexa fluor 430净荧光值；（4）cf405l选择405nm激发、546nm采集，可造成amca不足10%激发
×
不足10%amca采集《1%，可忽略；atto 425 40%激发
×
25%采集≈10%；以及alexa fluor 430 60%激发
×
100%采集≈60%。结合（2）、（3），扣除可得cf405l净荧光值。
[0056]
参阅图8所示：（5）fam选择495nm激发、520nm采集。可得fam净荧光值；（6）cy3选择558nm激发、565nm采集。可得cy3净荧光值；（7）hex选择528nm激发、550nm采集，可造成cy3 50%激发
×
33%采集≈16.7%。结合（6），扣除可得hex净荧光值；（8）rox (nhs-ester)选择587nm激发、608nm采集。可得rox净荧光值。
[0057]
参阅图9所示：（9）cy5选择649nm激发、660nm采集，可造成cy5.5 50%激发
×
10%采集=5%串扰，可忽略。可得cy5净荧光值；（10）cy5.5选择675nm激发、700nm采集，可造成cy5 25%激发
×
20%采集=12.5%串扰。结合（9），扣除可得cy5净荧光值；（11）cy7选择740nm激发、760nm采集，可造成alexa fluor 790 40%激发
×
10%采集≈4%，可忽略。可得cy7净荧光值；（12）alexa fluor 790选择790nm激发、805nm采集，可造成cy7 20%激发
×
47%采集≈25%。结合（11），扣除可得alexa fluor 790净荧光值。
[0058]
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种多波长荧光激发采集系统，其特征在于，包括：多波长激发光源和荧光采集模块；所述多波长激发光源包括底座和光束整形机构；所述底座设有若干光源座，每一所述光源座设有一单色光源；所述单色光源可以为发光二极管led与带通滤光片的组合，或激光二极管ld；所述光束整形机构设有透镜座、反射镜座和镜筒，三者分别设有第一透镜、反射镜和第二透镜，各自与底座呈90
°
、45
°
和0
°
夹角；每一所述单色光源发出的激发光经过所述第一透镜、反射镜和第二透镜后近准直出射，辐照于被测样品；所述光束整形机构还连接有步进电机，可带动所述光束整形机构转动，配合每一所述单色光源轮流开关，将不同波长的激发光依次辐照至被测样品；所述荧光采集模块设置于所述被测样品的一侧，用于采集被测样品受激发光辐照后发出的发射光。2.根据权利要求1所述的多波长荧光激发采集系统，其特征在于，所述反射镜为按阵列排布的反射镜组；所述单色光源发出的激发光经所述第一透镜整形后，被所述反射镜组的各子反射镜，按各自排布角度投射为由多个近似点光源组成的阵列，辐照于同样按阵列排布的多个被测样品。3.根据权利要求1所述的多波长荧光激发采集系统，其特征在于，所述荧光采集模块为光谱仪、法布里－珀罗干涉仪或连续滤光片与探测器的组合；所述被测样品发出的发射光，由所述光谱仪采集，或经所述法布里-珀罗干涉仪或连续滤光片筛选通过波长后，由所述探测器采集。4.根据权利要求1所述的多波长荧光激发采集系统，其特征在于，所述第二透镜为n
×
1合束光纤（n≤12）；所述单色光源发出的激发光经所述反射镜变向后，由合束光纤1端入射、n端出射，辐照于按光纤端口位置排布的多个被测样品。5.根据权利要求1所述的多波长荧光激发采集系统，其特征在于，所述反射镜为半透半反镜；所述荧光采集模块置于所述半透半反镜的一侧（底座相对于半透半反镜的同侧）；所述被测样品发出的发射光经所述半透半反镜后由荧光采集模块采集。6.根据权利要求1所述的多波长荧光激发采集系统，其特征在于，所述单色光源发出的激发光，一部分由一光电二极管接收，另一部分射向所述光束整形机构；所述光电二极管根据接受到的激发光强度与预设强度对比，对所述单色光源的光功率进行负反馈调节，使之处于稳定的预设功率，避免因光源工作发热导致的光功率浮动。

技术总结
本发明提供一种多波长荧光激发采集系统，属于荧光检测技术领域，包括多波长激发光源和荧光采集模块；所述多波长激发光源包括底座和光束整形机构；所述底座设有若干单色光源；所述光束整形机构设有第一透镜、反射镜和第二透镜；每一所述单色光源发出的激发光经过所述光束整形机构后近准直出射，辐照于被测样品；配合每一所述单色光源的轮流开关，所述光束整形机构不断转动，将不同波长的激发光依次辐照至被测样品；所述荧光采集模块设置于所述被测样品的一侧，用于采集被测样品受激发光辐照后发出的发射光。出的发射光。出的发射光。


技术研发人员：任鲁风 蒋鹏翀 范东雨 王宏伟 吴世超 顾陈 高静 蔡亦梅
受保护的技术使用者：北京中科生仪科技有限公司
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/9/23