黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用。


背景技术：

2.卵巢颗粒细胞与卵泡发育密切相关，并维持卵巢的正常生理功能，而外泌体是卵巢颗粒细胞调控卵泡发育的重要通讯介质，可通过旁分泌的方式在机体微环境中发挥作用，向周围细胞和组织传递信号。女性生殖系统的功能和成功受孕与卵泡生长状态、卵子生成、植入、胚胎发育有关，而这些均取决于细胞的主要调节因子外泌体。外泌体包含遗传和蛋白质组数据，可作为妊娠相关疾病的治疗靶点并在辅助生殖治疗中提供卵子质量的生物标志物。已有研究证实源自于老龄女性颗粒细胞可通过外泌体靶向调节凋亡相关信号通路，并将将衰老信号从卵巢传递到全身。因此，需要研究一种能够促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌的药物。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用，采用黑果枸杞花色苷处理卵巢颗粒细胞kgn，能够达到促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌的目的。
4.本发明所采用的技术方案是，黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用。
5.本发明的特点还在于：
6.采用黑果枸杞花色苷处理卵巢颗粒细胞kgn，达到促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌的目的。
7.黑果枸杞花色苷能够增加卵巢颗粒细胞外泌体的数量。
8.黑果枸杞花色苷能够提高卵巢颗粒细胞外泌体标志物表达水平。
9.黑果枸杞花色苷能够降低卵巢颗粒细胞外泌体分泌抑制蛋白表达水平。
10.本发明的有益效果是，黑果枸杞花色苷是紫黑色成熟黑果枸杞浆果提取的多酚类化合物，具有抑制肿瘤细胞增殖、抗炎、调节肠道菌群的作用，本发明利用黑果枸杞浆果提取物黑果枸杞花色苷，以卵巢颗粒细胞为靶点，采用体外培养技术、电镜分析和蛋白印迹方法，达到促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌的目的。
附图说明
11.图1是实施例2中黑果枸杞花色苷处理透射电镜下卵巢颗粒细胞外泌体的形态特征图；
12.图2(a)、图2(b)是实施例3中黑果枸杞花色苷处理nanosight对卵巢颗粒细胞外泌体粒径表征，图2(a)是对照组，图2(b)是实验组；
13.图3是实施例4中黑果枸杞花色苷处理卵巢颗粒细胞外泌体标志物表达水平显示图；
14.图4是实施例5中黑果枸杞花色苷处理卵巢颗粒细胞外泌体分泌抑制蛋白表达水平显示图。
具体实施方式
15.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
16.本发明黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用，采用黑果枸杞花色苷处理卵巢颗粒细胞kgn，达到促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌的目的。
17.实施例1
18.1)细胞培养：人卵巢颗粒细胞系kgn铺板于10厘米细胞培养皿中，对照组(生理盐水)和处理组(10μm浓度的黑果枸杞花色苷)处理细胞24小时后收集细胞。
19.2)外泌体收集：收集去除细胞和碎片的细胞培养基，将细胞培养基经0.22μm滤器过滤转移至超速离心管，10000rcf离心1小时后取上清，100000rcf离心2小时后取沉淀物，用预冷的pbs缓冲液重悬得到纯化的卵巢颗粒细胞外泌体溶液。
20.实施例2
21.在实施例1的基础上，进行外泌体形态表征：将新鲜得到的外泌体溶液滴加到100目载样铜网上，室温静置1分钟后用磷钨酸钠溶液(或乙酸双氧铀溶液)滴到铜网上负染1分钟，用滤纸吸去余液后将铜网放到透射电镜下观察外泌体形态为杯状结构，如图1所示，对照组和处理组的外泌体结构均为杯托状，可以证明黑果枸杞花色苷不改变卵巢颗粒细胞外泌体的形态特征。
22.实施例3
23.在实施例2的基础上，将超速离心获得的外泌体进行梯度稀释，用nanosight对卵巢颗粒细胞外泌体粒径表征：
24.取外泌体溶液用专用无粒子水稀释后充分混匀，采用0.22μm滤膜过滤分散，并用1ml注射器吸取稀释液，排空空气缓慢推注外泌体稀释液充满整个样品池至出口有液体滴出，调整仪器焦距及参数，用nanosight测定卵巢颗粒细胞外泌体的粒径大小及浓度，通过图2(a)、图2(b)对比可知：与对照组相比，处理组外泌体丰度显著增加，表明黑果枸杞花色苷处理增加卵巢颗粒细胞外泌数量。
25.实施例4
26.在实施例3的基础上，卵巢颗粒细胞外泌体标志物表达水平检测：
27.采用western blot，通过配胶、上样与电泳、转膜、洗膜、封闭、抗体孵育和显影一系列操作，选用β-actin作为内参对外泌体标志物cd63、alix和tsg101的表达水平进行检测，结果显示与对照组相比，cd63、alix和tsg101的条带加粗，表明黑果枸杞花色苷处理的卵巢颗粒细胞外泌体标志物表达水平显著升高，如图3所示。
28.实施例5
29.在实施例4的基础上，卵巢颗粒细胞外泌体分泌抑制蛋白表达水平检测：
30.采用western blot对外泌体分泌抑制蛋白isg15的表达水平进行检测(选用β-actin作为内参)，结果显示与对照组相比，isg15的条带变细，表明黑果枸杞花色苷处理的
卵巢颗粒细胞外泌体分泌抑制蛋白表达水平显著降低，如图4所示。
31.通过图1～图4结果显示，黑果枸杞花色苷可通过调节其分泌调控蛋白的表达水平促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌。


技术特征：
1.黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用。2.根据权利要求1所述的黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用，其特征在于：采用黑果枸杞花色苷处理卵巢颗粒细胞kgn，达到促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌的目的。3.根据权利要求1所述的黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用，其特征在于：所述黑果枸杞花色苷能够增加卵巢颗粒细胞外泌体的数量。4.根据权利要求1所述的黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用，其特征在于：所述黑果枸杞花色苷能够提高卵巢颗粒细胞外泌体标志物表达水平。5.根据权利要求1所述的黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用，其特征在于：所述黑果枸杞花色苷能够降低卵巢颗粒细胞外泌体分泌抑制蛋白表达水平。

技术总结
本发明公开了黑果枸杞花色苷在促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌中的应用，该方法采用黑果枸杞浆果提取物黑果枸杞花色苷，将细胞经黑果枸杞花色苷处理后，通过透射电镜进行卵巢颗粒细胞外泌体形态表征，通过NanoSight进行卵巢颗粒细胞外泌体粒径表征，分析黑果枸杞花色苷处理后卵巢颗粒细胞外泌体标志物及外泌体分泌抑制蛋白的表达水平，达到促进卵巢颗粒细胞外泌体分泌的目的。因此，该方法增加了黑果枸杞花色苷在外泌体研究和治疗领域的应用，也扩大了黑果枸杞花色苷在黑果枸杞产品的开发和应用范围。应用范围。应用范围。


技术研发人员：杨延周 高慧 潘朋歌 杨晋懿 裴秀英 马燕
受保护的技术使用者：宁夏医科大学
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/9/23