一种利用小分子药物诱导心肌细胞重编程为心脏祖细胞的方法

1.本发明涉及一种利用小分子药物诱导心肌细胞重编程为心脏祖细胞的方法，属于生物技术领域。


背景技术：

2.心力衰竭(heart failure，又称心肌衰歇或心衰)是一种在全世界都具有高发病率和死亡率的破坏性疾病。心衰通常发生在心肌梗塞之后，并伴随着心肌细胞(cardiomyocytes，cms)的大量损失。这些心肌细胞不能由成年哺乳动物的心脏再生。在哺乳动物的胚胎心脏发育过程中，cms主要来源于第一心域(fhf)和第二心域(shf)1。特别是isl1阳性的第二心域心脏祖细胞(cardiac progenitor cells，cpcs)同时具有增殖能力和分化成三种主要的心血管细胞类型，即心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的能力
2,3
。因此，诱导心脏中产生表达胚胎时期心脏发育关键基因isl1的cpcs是一种可行的促进心脏再生的策略。目前对表达isl1的cpcs的诱导产生可通过小鼠成纤维细胞的体外重编程4，或胚胎干细胞的体外分化5。然而，上述cpcs均为体外诱导获得，仍需体内移植后发挥作用。
3.因此，发现能够诱导哺乳动物心脏中内源心脏祖细胞产生的方法，将为促进哺乳动物心脏再生，以及再生医学和以治疗由心肌细胞损失引起的各种心脏疾病提供新的策略。
4.在低等生物(如斑马鱼)中，成熟的cms去分化为cpcs被认为是心脏损伤后心脏再生的关键特征/机制
9,10
，但该过程在哺乳动物中是缺乏的。在斑马鱼通过cms去分化实现心脏再生的过程中，cms重新激活表达了胚胎时期心脏发育的基因并发生肌节结构的解聚
10,11
。在出生第1天至第6天的小鼠心脏再生过程中，心肌细胞去分化的特点是发生肌节结构的解聚
12
，但未能表达胚胎时期心脏发育的基因。
5.因此，如果能够在哺乳动物心脏中重现cms去分化为表达胚胎时期心脏发育基因的cpcs这一过程，将有可能为促进哺乳动物心脏再生提供新的治疗策略。
6.小分子(small molecules)是指分子量小于1000道尔顿(尤其小于400道尔顿)，并具有生物学功能的化合物。此类化合物与细胞因子和蛋白不同，其可直接穿过细胞膜进入细胞，进而发挥相应的功能。小分子化合物的使用场景众多，已广泛应用于干细胞、类器官、免疫学、神经生物学、表观遗传学、细胞凋亡、离子通道、肿瘤学和信号转导等生命科学中诸多重要的研究领域。比如小分子药物chir99021是糖原合成酶激酶3(gsk3)的抑制剂，通过与gsk3的结合抑制其对下游β-catenin的磷酸化，从而实现对依赖wnt信号通路激活的细胞命运调控。
7.小分子药物a-485是一种有效的、选择性的、具有类药性的p300/cbp乙酰转移酶抑制剂，a-485可通过选择性抑制组蛋白h3k27乙酰化和h3k18乙酰化来降低基因的表达，从而实现对细胞状态的调节。因此，该小分子被广泛用于谱系特异性肿瘤细胞的增殖，包括几种血液恶性肿瘤、雄激素受体阳性的前列腺癌。
8.目前，针对心脏再生的主要策略分为不依赖细胞的疗法和细胞疗法。不依赖细胞的疗法集中在运用不同的方法诱导心脏中cms的增殖。在近期的已发表文章中使用了小分子chir99021促进hescs来源cms在体外的增殖，但未能实现给药后新生鼠体内cms的增殖
13
。另外，有研究表明使用由5个小分子物质(5sm)即phenylephrine、baricitinib、harmine、vo-ohpic trihydrate和azd3965构成的组合能够促进体外和体内的cms增殖，同时也证明了cms在增殖之前需要先进行去分化过程，即肌节结构解聚
14
。运用ips技术
15
，通过控制oskm(即oct4、sox2、klf4和c-myc这4种转录因子)的表达周期诱导cms部分去分化实现cms增殖，因此cms的增殖是在去分化之后
16
。在细胞疗法中，可用于移植的细胞类型除了心肌细胞外
17
，还包括isl1阳性的心脏祖细胞
5,18
，ssea1阳性的心血管祖细胞(cardiovascular progenitor cell，cvpcs)
19-21
，以及mesp1阳性的心脏中胚层细胞(cmcs)
22
。值得注意的是，无论cvpcs还是cmcs均表达isl1。因此，诱导哺乳动物体内内源cms去分化为isl1阳性cpcs是一种可行且前景广阔的方案。


技术实现要素：

9.发明要解决的问题
10.针对现有技术中存在的问题，本发明构建一种基于人胚胎干细胞来源的心肌细胞的高通量小分子药物筛选平台。具体来说，本发明首先构建和优化体外诱导不同的人胚胎干细胞(hescs)向心肌细胞分化的条件。在此基础上，运用crpispr-cas9技术构建了基因敲入的isl1
mcherry/+
人胚胎干细胞系，并基于不同的hescs来源的心肌细胞进行高通量小分子药物筛选，得到小分子药物组合chir99021和a-485(称为2c)。进一步，本发明运用高内涵拍照和分析系统对心脏祖细胞标志物isl1的表达进行统计分析，并通过体外鉴定(例如谱系追踪心肌细胞向心脏祖细胞的转变)和体内鉴定(例如诱导新生大鼠/成年小鼠心肌细胞向isl1阳性细胞转变)的方式来鉴定筛选得到的小分子药物组合2c诱导心肌细胞向心脏祖细胞重编程的过程。同时，还通过体外鉴定和体内鉴定的方式来鉴定小分子化合物诱导心肌细胞获得的isl1阳性心脏祖细胞的特性。另外，还通过小分子药物组合2c的体内递送验证了小分子药物组合2c对哺乳动物中的心肌细胞的去分化作用。本发明的技术路线图具体参见图12。
11.用于解决问题的方案
12.鉴于现有技术中存在的问题，本发明人进行了深入的研究。本发明人通过研究筛选了能够将心肌细胞重编程为心脏祖细胞的小分子药物组合。通过组合优化获得了由小分子chir99021和a-485构成的组合，将其命名为小分子药物组合2c(本发明中也简称为2c)。试验证明2c能够在体外有效地将人胚胎干细胞来源的心肌细胞和新生大鼠心脏中分离的原代心肌细胞重编程为isl1阳性的cpcs。进一步研究显示，将2c进行体内递送，2c能够强有力地诱导新生大鼠和成年小鼠心脏中的心肌细胞去分化为isl1阳性细胞，即诱导心肌细胞向心脏祖细胞的转变，从而完成了本发明。
13.本发明在第一方面提供了一种体外诱导人胚胎干细胞(hescs)向心肌细胞(cms)分化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
14.i)将hescs铺入12孔板中，在基础培养基a中饲养2天后进行起始分化培养；
15.ii)在起始分化培养的基础培养基b中添加终浓度为1
×
的b27-minus insulin、10
～25ng/ml hbmp4、10～25ng/ml havtivina和1～5μm chir99021；
16.iii)在起始分化的第2天、第5天和第8天分别更换培养基，分化培养至第14天；
17.iv)在分化培养的第14天，将培养基更换为不含葡萄糖的基础培养基c，并在其中添加3～5mm的乳酸盐；
18.v)对cms进行4天的纯化筛选，获得单层收缩的cms，使用tryple express酶进行消化，转移至含有血清的基础培养基b中，离心去上清；
19.vi)添加重悬培养基对cms进行重悬，以每个孔(0.5～1.5)
×
104个细胞的数量加入到被纤粘连蛋白处理过的384孔板中，24小时后更换培养基；经过4天培养，得到恢复收缩的单细胞cms。
20.在一些具体的实施方案中，其中所述hescs为未经过体内发育的受精14天以内的人胚胎分离的hescs。
21.在一些具体的实施方案中，其中所述基础培养基a为mtesr1培养基，所述基础培养基b为rpmi1640培养基，所述基础培养基c为dmem培养基。
22.在一些优选的实施方案中，其中所述步骤ii)中hbmp4、havtivina和chir99021的浓度分别为20ng/ml、20ng/ml和1.5μm。
23.在一些优选的实施方案中，其中所述步骤iii)中在起始分化的第2天、第5天和第8天分别更换为添加了2～8μm iwp2的rpmi/b27-ins
培养基、rpmi/b27-ins
培养基和rpmi/b27培养基；其中步骤vi)中所述重悬培养基为添加有3～10％的gfbs和2～8μm的y-27632的mem-α培养基，所述24小时后更换的培养基为rpmi/b27培养基；
24.在一些更优选的实施方案中，所述步骤iii)中在起始分化的第2天更换的培养基为添加了5μm iwp2的rpmi/b27-ins
培养基；
25.在一些更优选的实施方案中，所述步骤vi)中所述重悬培养基为添加有5％的gfbs和5μm的y-27632的mem-a培养基。
26.本发明在第二方面提供了一种体外诱导心肌细胞(cms)去分化为心脏祖细胞(cpcs)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
27.1)利用本发明第一方面中所述的方法获得心肌细胞(cms)
28.2)以0.05～0.2
‰
(v/v)或终浓度3～8μm在384孔板中加入2种以上的小分子药物化合物组合，体外诱导cms去分化为cpcs；
29.在一些优选的实施方案中，所述2种以上的小分子药物化合物组合在384孔板中的添加量为0.1
‰
(v/v)或终浓度5μm。
30.在一些具体的实施方案中，其中所述2种以上的小分子药物化合物组合选自由以下组合中的任一种：
31.(1)chir99021和a-485的组合；
32.(2)chir99021、a-485和bet-762的组合；
33.(3)chir99021、a-485和le135的组合；
34.(4)chir99021、a-485和sb431542的组合；
35.(5)chir99021、a-485、bet-762和sb431542的组合；
36.在一些优选的实施方案中，所述小分子药物化合物组合为chir99021和a-485的组合。
37.本发明在第三方面提供了一种人胚胎干细胞(hescs)细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
38.i)crispr-cas9质粒的设计与构建；
39.ii)转染人胚胎干细胞和筛选hescs阳性克隆；
40.iii)对步骤ii)筛选的hesc阳性克隆进行pcr鉴定，
41.其中，步骤i)中所述crispr-cas9质粒包括(1)模板质粒和(2)引导rna质粒；
42.所述模板质粒中包含左同源臂序列和右同源臂序列；在一些优选的实施方案中，所述左同源臂的正向引物和反向引物分别为seq id no:4和seq id no：10，所述右同源臂的正向引物和反向引物分别为seq id no:11和seq id no：12；
43.所述引导rna质粒为3个，其中分别包含seq id no：1～3所示的sgrna1、sgrna2和sgrna3；
44.其中步骤ii)的具体操作为：
45.(a)将步骤i)中构建的模板质粒和3个引导rna质粒同时分别转入人胚胎干细胞(hesc)h9细胞系和hues7细胞系；
46.(b)加入潮霉素进行筛选，待连续3天不存在明显的细胞漂浮后，在不含有潮霉素的培养基中对存活下来的细胞进行培养和鉴定；
47.(c)在上述鉴定为阳性的细胞系中转入表达cre重组酶的质粒，切除潮霉素的编码基因。
48.本发明在第四方面提供了小分子药物组合在诱导心肌细胞(cms)去分化为心脏祖细胞(cpcs)中的用途，其中所述小分子药物化合物组合选自由以下组合中的任一种：
49.(1)chir99021和a-485的组合；
50.(2)chir99021、a-485和bet-762的组合；
51.(3)chir99021、a-485和le135的组合；
52.(4)chir99021、a-485和sb431542的组合；
53.(5)chir99021、a-485、bet-762和sb431542的组合；
54.在一些优选的实施方案中，所述小分子药物化合物组合为chir99021和a-485的组合。
55.在一些具体的实施方案中，其中所述心肌细胞为hescs来源的心肌细胞或者为mcherry阴性的心肌细胞，所述心脏祖细胞为isl1阳性的心脏祖细胞或者为mcherry阳性的心脏祖细胞。
56.在一些具体的实施方案中，其中所述心肌细胞来源于哺乳动物，所述诱导为体外诱导或体内诱导；在一些优选的实施方案中，所述哺乳动物为大鼠或小鼠。
57.本发明在第五方面提供了小分子药物组合在制备诱导心肌细胞(cms)去分化为心脏祖细胞(cpcs)的制剂中的用途，其中所述小分子药物化合物组合选自由以下组合中的任一种：
58.(1)chir99021和a-485的组合；
59.(2)chir99021、a-485和bet-762的组合；
60.(3)chir99021、a-485和le135的组合；
61.(4)chir99021、a-485和sb431542的组合；
62.(5)chir99021、a-485、bet-762和sb431542的组合；
63.在一些优选的实施方案中，所述小分子药物化合物组合为chir99021和a-485的组合。
64.在一些具体的实施方案中，其中所述心肌细胞为hescs来源的心肌细胞或者为mcherry阴性的心肌细胞，所述心脏祖细胞为isl1阳性的心脏祖细胞或者为mcherry阳性的心脏祖细胞。
65.在一些具体的实施方案中，其中所述心肌细胞来源于哺乳动物，所述诱导为体外诱导或体内诱导；在一些优选的实施方案中，所述哺乳动物为大鼠或小鼠。
66.发明的效果
67.由本发明的技术方案可见，本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
68.1，本发明成功构建了基于hescs来源的cms的高通量小分子药物筛选平台。
69.2，本发明运用crispr-cas9技术以基因敲入的方式构建了分别来源于男性和女性的基因敲入isl1
mcherry/+
人胚胎干细胞系k7和k9。
70.3，本发明在体外实现了由两个小分子化合物chir99021和a-485的组合(2c)对心肌细胞向心脏祖细胞的转变。
71.4，本发明在体外实现了对心肌细胞向心脏祖细胞转变的谱系追踪。
72.5，本发明在哺乳动物体内实现了对两个小分子化合物chir99021和a-485的组合(2c)的腹腔注射给药。
73.6，本发明在哺乳动物体内验证了小分子药物组合2c诱导哺乳动物心脏中心肌细胞向心脏祖细胞的去分化。
附图说明
74.图1a示出了体外诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hescs)向心肌细胞(cardiomyocytes，cms)分化的流程图；图1b示出了诱导分化的第6天(d6)，通过对心脏祖细胞(cardiac progenitor cells，cpcs)标志物isl1表达的检测统计hescs向cpcs的分化效率；图1c示出了在不含葡萄糖的基础培养基(dmem(-)glu)中添加乳酸盐(lactate)，对心肌细胞进行4天的纯化筛选(sd4)后，cm标志物tnnt2的表达情况和hescs向cms的分化效率结果；图1d示出了体外基于由hescs来源cms的高通量小分子药物筛选流程；图1e示出了不同小分子药物组合诱导cms向cpcs转变过程中表达isl1的细胞比例结果，误差条表示为sd。
75.图2中的左图示出了sd4时单层收缩的cms；图2中的右图示出了经过4天的培养(md4)，单细胞状态的cms恢复收缩。
76.图3a示出了在人胚胎干细胞(hesc)h9细胞系中运用crispr-cas9技术构建在内源isl1启动子后敲入报告基因mcherry的设计策略。图3b示出了通过基因组pcr证实由图3a所示策略成功获得了在内源isl1基因座上敲入了荧光报告基因mcherry的杂合子h9，hes细胞系(isl1
mcherry/+
knock-in h9,hes cell line，简称k9)；pcr产物up由图3a中所示引物up_f和up_r扩增完成，pcr产物mid由图3a中所示引物mid_f和mid_r扩增完成。图3中c示出了通过免疫荧光染色证实了k9细胞系在未分化时(d0)表达hesc标记基因(oct4、nanog和sox2)，
在分化第五天(d5)表达cpcs标记基因(gata4、nkx2-5和tbx5)。图3d示出了通过实时定量荧光pcr(qpcr)结果显示了从k9细胞系向心肌细胞分化过程中特定时间点的基因相对表达，误差表示为sd。图3e示出了通过流式细胞分选技术(facs)分选出由k9细胞系分化至d6的mcherry阳性细胞并铺入细胞板，待细胞贴壁后通过免疫荧光染色检测cpc标志物isl1(绿色)和mcherry(红色)的表达。图3f示出了通过facs分析k9细胞系分化至sd4时指征cms的mcherry阴性细胞的比例,误差条表示为sd。图3g示出了通过facs分选出k9细胞系分化至sd4时的mcherry阴性细胞并铺入细胞板，待细胞贴壁后通过免疫荧光染色检测cm tnnt2(绿色)和myl2(红色)的表达。
77.图4a示出了通过免疫荧光染色证实了k7细胞系在未分化时(d0)表达esc标记基因(oct4、sox2、nanog和ssea4)，在d5时表达cpc标记基因(gata4、nkx2-5和tbx5)且几乎不表达心肌细胞标记基因mef2c。图4b示出了通过流式细胞分选技术(facs)分选出由k7细胞系分化至d6的mcherry阳性细胞并铺入细胞板，待细胞贴壁后通过免疫荧光染色检测cpc标志物isl1(绿色)和mcherry(红色)的表达。图4c示出了facs分析k7细胞系分化至d6时同时表达isl1和mcherry的双阳细胞比例。图4d示出了facs分析k7细胞系分化至sd4时指征cm的mcherry阴性细胞的比例。图4e示出了通过对tnnt2进行免疫荧光染色，统计k7细胞系分化至sd4时的cms细胞比例，其中以h9细胞系作为阳性对照。图4f示出了k7细胞系分化至sd4时的mcherry阴性细胞比例，误差条表示为sd。
78.图5a示出了由hescs分化来的cms经过dmso(nc)或小分子组合2c60小时处理后相差显微镜拍摄的细胞形态变化。图5b示出了细胞的细胞质面积和细胞核面积统计。图5c中的热图显示了通过qpcr检测到的指征心脏祖细胞的基因(mesp1，nr2f2，fut4，isl1)，指征心脏谱系的基因(gata4，tbx5)，以及指征心肌细胞的基因(mef2c，myl7，myl2，tnnt2)在转录水平上经过2c处理后相较于nc组的倍数变化。图5d示出了通过免疫印迹实验显示isl1在蛋白水平的表达。图5e示出了通过imagej软件分析了图5d中isl1在蛋白水平表达量的变化。图5f示出了通过免疫荧光染色显示cpcs标记基因isl1(绿色)和cms标记基因tnnt2(红色)的表达，dapi(蓝色)指征细胞核。图5g示出了通过高内涵拍照系统和分析软件分别对nc和2c处理后的总细胞量和isl1阳性细胞量进行统计。图5h示出了使用图5g同样的方法分别计算isl1和tnnt2的阳性细胞比例，误差条表示为sd。图5i示出了通过免疫荧光染色显示指征心脏祖细胞的基因(mesp1，nr2f2)，指征心脏谱系的基因(gata4，nkx2-5，tbx5)，以及指征心肌细胞的基因(mef2c)在蛋白水平的表达。图5j示出了通过高内涵拍照系统和分析软件分别对nc和2c在处理24小时，48小时和60小时后的tnnt2+/isl1-心肌细胞，tnnt2+/isl1+心脏中间态细胞，以及tnnt2-/isl1+心脏祖细胞进行细胞比例的计算。
79.图6a示出了在confocal培养皿中进行免疫荧光染色检测k9细胞系来源的mcherry阴性cms经过2c处理后，指征isl1的mcherry(红色)和cm标记基因tnnt2(绿色)的表达。图6b示出了在confocal培养皿中进行免疫荧光染色检测k7细胞系来源的mcherry阴性cms经过2c处理后的基因表达。图6c示出了facs分析(左)并统计(右)2c对k9细胞系来源mcherry阴性cms转变为mcherry阳性cpcs的去分化效率。图6d示出了facs分析(左)并统计(右)2c对k7细胞系来源mcherry阴性cms转变为mcherry阳性cpcs的去分化效率。图6e示出了qpcr检测分别来自k9细胞系和k7细胞系的mcherry阴性cms在经过2c处理后的基因在转录水平的表达变化。
80.图7a示出了通过谱系追踪系统用绿色荧光蛋白egfp标记cms后进行2c或nc处理的流程。图7b示出了通过免疫荧光染色检测不同的慢病毒浓度对cms的侵染效率以及egfp对cms的标记状态。图7c中的柱状图显示tnnt2阳性cms的数量，反应慢病毒侵染对cms存活的影响。图7d中的柱状图显示egfp阳性cms的比例，反应慢病毒侵染cms的效率。图7e示出了confocal显微镜对免疫荧光染色结果进行拍摄的结果，显示出egfp标记的cms表达cpc标记基因isl1(红色)。图7f示出了通过facs分析(左)并统计(右)谱系追踪系统用egfp标记k9细胞系来源mcherry阴性cms的效率。图7g示出了facs分析2c处理后诱导被egfp标记的k9细胞系来源mcherry阴性cms去分化为mcherry阳性cpcs的效率，误差条表示为sd。图7h示出了通过facs分析(左)并统计(右)谱系追踪系统用egfp标记k7细胞系来源mcherry阴性cms的效率。图7i示出了facs分析2c处理后诱导被egfp标记的k7细胞系来源mcherry阴性cms去分化为mcherry阳性cpcs的效率，误差条表示为sd。
81.图8a示出了用dmso(nc)或小分子药物组合2c处理60小时的原代新生大鼠心室cms(nrvcms)后进行isl1(绿色)和tnnt2(红色)的免疫荧光染色结果；其中在2c处理的细胞中，共同表达isl1和tnnt2的细胞用黄色箭头表示，单独表达isl1的细胞用白色箭头表示。图8b示出了用dmso(nc)或2c(20mg/kg chir99021和10mg/kg a-485)对新生sd大鼠进行给药的示意图，出生后1天为p1。图8c示出了在指定的时间点分别测量nc组或2c组给药新生大鼠的体重(左)并在p6计算心脏与体重的比率，误差条表示为sd；ns，不显著(p》0.05)；***p《0.001。图8d示出了对给药5天后的新生大鼠(p6)进行心脏横截面的免疫荧光染色结果；其中，ao，主动脉；pa，肺动脉；la，左心房；ra，右心房；cg,心脏神经节；lv，左心室；rv，右心室。
82.图9a示出了免疫荧光染色显示在2c或dmso(nc)处理后的成年129svj品系小鼠的横截面心脏中isl1(绿色)和tnnt2(红色)的表达。
83.图10a示出了对k9细胞系来源的mcherry阴性cms进行dmso(nc)或2c处理60小时的批量rna-seq分析方案。图10b中的热图显示nc或2c处理60小时的isl1/mcherry阴性cms的差异表达基因(degs)。图10c中的火山图显示在2c处理60小时后有明显变化的基因。图10d和图10e示出了与nc组细胞相比，2c处理60小时后isl1/mcherry阴性cms中下调(图10d)和上调(图10e)基因的基因功能(go)分析。图10f示出了用cnetlpot绘制出go分析中2c处理后上调基因的点图。图10g示出了k9细胞系来源的isl1/mcherry阴性cms经2c处理60小时后特异性基因的相对表达倍数变化，误差条表示为sd。
84.图11a示出了通过umap分析显示用dmso(nc)和2c处理60小时，从k9细胞系来源的mcherry阴性cms中诱导出7个细胞群，根据特定标记基因的表达，主要属于心肌细胞(cms)、心脏祖细胞(cpcs)和中间态细胞(ics)；其中，与nc条件(灰色)相比，2c处理(粉红色)使第2簇细胞数量发生了巨大的变化。图11b中的热图显示了7个指定集群的细胞中差异表达的基因。图11b的右边列出了7个指定集群的代表性标记基因。图11c中的小提琴图显示了7个集群的细胞中cms(myl2，myh6)、ics(col1a1，acta2)和cpcs(isl1，bmp4，fgf20)的标记基因的表达水平。图11d示出了通过umap分析显示第2簇的二级聚类为4个子群组(左)，在2c或nc条件下表现出显著的区别(右)。图11e示出了通过umap分析显示cpcs标记基因在0亚群中的表达。图11f中的热图显示了第2群的4个亚群的细胞之间的差异表达基因；与cpcs相关的基因在右边的绿色区块中突出显示。图11g和图11h示出了拟时序轨迹显示2c处理后各种细胞状态的变化，这些变化以不同的发育伪时间点(图11g)和细胞状态(图11h)呈现。图11i中的曲
线显示cpcs(isl1，fgf20)、ics(col1a1)和cms(tnnt2)各自的特异性基因沿指定的伪时间点的动态表达。
85.图12示出了本发明的技术路线图。
具体实施方式
86.以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
87.另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
88.如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
89.本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
90.本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
91.本说明书中，使用“数值a～数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
92.本说明书中，使用“常温”、“室温”时，其温度可以是10-40℃。
93.术语“心肌细胞”通常指心肌细胞的前体细胞和成熟的心肌细胞。在本文中所提及的心肌细胞系体外分化获得的未成熟心肌细胞细胞、前体细胞或心肌细胞可等同于处于心肌细胞个体发育任何阶段的细胞，如上文所定义并无限制，除非另有说明。
94.术语“动物”指人类或其他动物，包括禽类、牛、犬、马、猫、鼠类、绵羊和猪等动物。术语“哺乳动物”指任意种类的哺乳动物。
95.各种类型的胚胎细胞包含于ppscs(灵长动物多能干细胞)的定义中，其例子为：人胚胎干细胞(hescs)；灵长动物的胚胎干细胞，例如恒河猴干细胞(thomson等，proc.natl.acad.sci.usa 92：7844，1995)、狨猴干细胞(thomson等，biol.reprod.55：254，1996)和人胚胎生殖细胞(heg细胞)(shamblott等，proc.natl.acad.sci.usa 95：13726，1998)。可以建立的细胞系形式提供这些细胞类型。其它类型的多能细胞也包括在该术语中。ppscs不延生于恶性来源。理想的是(但并非总是必须)所述细胞的核型是正常的。
96.术语“心脏祖细胞”可以指来源于人类心脏组织的祖细胞的群体。
97.术语“祖细胞”是指具有分化成特定细胞类型以及复制产生与其自身基本等同的子细胞的能力的细胞。在一些情况下，祖细胞经历有限的自我更新，使得它不会无限地自我复制。
98.术语“培养”是指在适于存活的受控条件下(通常在身体之外(例如，离体或体外))
生长细胞或组织。当提及培养过程中的细胞培养时，该术语包括“扩增”、“传代”、“维持”等。培养细胞可以导致细胞生长、分化和/或分裂。
99.实施例
100.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
101.实施例1：建立基于人胚胎干细胞来源的心肌细胞高通量小分子药物筛选平台
102.【实验概述】
103.a.发明人在本实施例中优化了诱导hescs向cms的分化流程。具体来说，在已有报道的基础上6，本发明人调整了起始分化时(d0)人重组蛋白bmp4(hbmp4)和activina(hactivina)，以及chir99021的浓度，从而在d6获得了比例超过99％的cpcs(具体参见图1b)，并在sd4获得了比例超过92％的cms(具体参见图1c)。
104.b.本发明人开发了能够显著提高经过tryple express酶(thermo fisher)消化后的cm单细胞存活率的方法。体外由hescs诱导分化获得的cms呈现为致密的单层收缩状态，无法统计具体的细胞数量。经过tryple express酶的消化7，单层收缩的cms将成为可计数的单细胞状态，此时的cms难以在新的培养环境中存活。本发明人通过在mem-a培养基(gibco)中添加5％的来自gibco公司的血清(gfbs)和5μm的y-27632(selleck)来促进cms在384孔板中的存活，从而为高通量筛选提供基础。
105.【实验流程】
106.体外诱导人胚胎干细胞向心肌细胞分化流程的优化(具体参见图1a)：将5
×
105个利用未经过体内发育的受精14天以内的人胚胎分离的hescs铺入12孔板的1个孔中(d-2)，在mtesr1培养基(stem cell，货号#85850)中饲养2天后起始分化。起始分化(d0)的基础培养基为rpmi1640(gibco，货号11875500bt)，添加1
×
b27-minus insulin(rpmi/b27-ins
)(50
×
，thermo fisher)后，再加入20ng/ml的hbmp4，20ng/ml的havtivina(r&d)，以及1.5μm的chir99021(mce)。分化第2天(d2)的培养基为rpmi/b27-ins
并添加5μm的iwp2(mce)。分化第5天(d5)，更换培养基为rpmi/b27-ins
。分化第8天(d8)，更换为在基础培养基rpmi1640中添加1
×
b27 supplement(又称为rpmi/b27)(50
×
，thermo fisher)，直至分化第14天(d14)。此时(d14/sd0)，基础培养基为不含葡萄糖的dmem(dmem(-)glu，货号11966-025(gibco))，在添加4mm的乳酸盐(lactate，sigma，货号l7022)后，对cms进行4天的筛选纯化(sd4)。sd4时单层收缩的cms(具体参见图2中的左图)经由tryple express酶在37℃环境下消化12分钟，后将细胞吹下并转移至含有20％普通血清(fbs，hyclone)的rpmi1640培养基中，1000rpm转速离心5分钟。去除上清后，cms被添加含有5％的gfbs(gibco)和5μm的y-27632的mem-a培养基进行重悬，并以每个孔(0.5～1.5)
×
104个细胞的数量加入到被纤粘连蛋白(货号354008(bd))于37℃环境下过夜处理过的384孔板的各个孔中(md0)。24小时后，更换培养基为rpmi/b27(具体配置方法为在rpmi1640基础培养基中添加终浓度为1
×
的b27 supplement(17504-044，gibco)构成rpmi/b27培养基)。经过4天的培养(md4)，单细胞状态的cms恢复收缩(具体参见图2中的右图)。
107.此时，使用echo550纳升级声波移液系统以1
‰
或终浓度5μm在384孔板的第3至第
22列中打入即将筛选的小分子化合物。本实施例中待筛选的小分子化合物包括购买自sigma公司的lopac化合物库，购买自selleck公司的fda化合物库和本发明人自己收集的由235个小分子构成的化合物库(具体参见表1)。在第2列和第23列，加入等体积的dmso，作为对照。处理3天后，使用来自dshb公司的抗体isl1(dshb39.4d5-s)和来自sigma公司的抗体tnnt2(ma5-12960)对细胞进行免疫荧光染色(具体筛选流程示意图请参见图1d)。通过高内涵成像显微镜(pe)和harmony分析软件(pe)对表达isl1的细胞进行计数并计算比例(具体结果参见图1e)。
108.表1：基于假设的化合物库
109.110.111.112.113.114.115.[0116][0117]
【实验结论】
[0118]
(1)根据本实施例构建了基于hescs来源的cms的高通量小分子药物筛选平台。利用所述筛选平台实现了单层收缩的cms经过tryple消化以单细胞铺入384孔板后的细胞存活与收缩，为所有基于hescs或ipscs来源的针对cms的高通量药物筛选提供了基础。
[0119]
(2)根据图1e所示的柱状体可以看出，通过如图1d所示的筛选流程获得的小分子药物进行组合和优化，获得了最有效的诱导cms向cpcs转变的小分子药物组合：即chir99021和a-485(又称为2compounds，简称为2c)。
[0120]
实施例2运用crispr-cas9技术构建基因敲入的isl1
mcherry/+
人胚胎干细胞系
[0121]
实验流程：
[0122]
a.设计crispr-cas9质粒。
[0123]
如图3a示出了运用crispr-cas9构建在内源isl1启动子后敲入报告基因mcherry的设计策略。具体来说，以isl1起始密码子atg前的约1kb基因组作为左同源臂，第一个内含子之后的901bp序列作为右同源臂。连接在报告基因mcherry后面的是一段在两侧插入loxp切割位点表达潮霉素(hygromycin)的抗性基因。三条引导rna(sgrna1：ugucucccauaucuguaaga(seq id no：1)；sgrna2：agaggcuauuuuaccuugug(seq id no：2)；sgrna3：ucuuacagauaugggagaca(seq id no：3))分布在切割位点上下游50bp范围内，三条sgrna分别设计在isl1的exon1、intron1中(具体来说，sg3设计在exon1中，sg1和sg2设计在
intron1中)。在构建人胚胎干细胞系时，将三个引导rna质粒一同导入以提高切割效率。具体构建方法和质粒、引物的相关信息如下：
[0124]
crispr-cas9质粒包括用于同源重组的(1)模版质粒和用于识别插入位点的(2)引导rna质粒。
[0125]
其中，所述模版质粒基于购自addgene公司的pl552质粒(货号68407)改造完成，并被命名为pzw7.2。所述pzw7.2的构建方法为：将经由限制性内切酶bamhi(neb，货号r0136s)和noti(neb，货号r0189s)线性化处理过的pl552片段(来源于pl552质粒)、左同源臂片段、右同源臂片段、荧光蛋白片段以及潮霉素基因片段按hifidna(neb，货号e2621s)说明书提供的组装反应体系进行混合后室温孵育1个小时。取孵育后的产物进行转化后鉴定。pzw7.2中关键序列是两条用于同源重组的同源臂，包括isl1基因座起始密码子atg上游1067bp长度的左同源臂(扩增引物为正向引物
[0126]
f:ccgcgggcccgggatccgtcagtccgcggagtcaac(seq id no：4)；反向引物
[0127]
r:caaggagtaatgtccacaaggagatagtggttgtacagttg(seq id no：10))和atg下游901bp的右同源臂(扩增引物为正向引物
[0128]
f:ctagggagacatgggagatccaccaaaaagtaagcgtttgttttacctagtg(seq id no：11)；反向引物
[0129]
r:tagagtcgcggccgcgccgcaaccaacacata(seq id no：12))。质粒中的其他序列为常规序列。
[0130]
所述引导rna质粒有3个，均基于购自addgene公司的px459(20323)构建完成，并被命名为px459-sg1，px459-sg2和px459-sg3。引导rna质粒中关键序列是引导rna的序列，本发明使用的三条引导rna均位于isl1基因座，包括sgrna1:ugucucccauaucuguaaga(seq id no:1)、sgrna2:agaggcuauuuuaccuugug(seq id no:2)和sgrna3:ucuuacagauaugggagaca(seq id no:3)。
[0131]
另外，在使用电转试剂盒p3原代细胞4d-nucleofector
tm
x kit(lonza，货号v4xp-2012)对人胚胎干细胞(hesc)h9细胞系和hues7细胞系分别进行质粒转染的时候，需要同时转入pzw7.2质粒和三个引导rna质粒(即上文所述px459-sg1、px459-sg2和px459-sg3)。
[0132]
之后，待克隆汇合度达到30％-40％时，加入500ng/ml潮霉素b进行为期7天左右的筛选。筛选时间在不同细胞系(例如h9细胞系、hesc和hues7细胞系)中略有不同，标准是连续3天不再有明显的细胞漂浮。在不含有潮霉素的培养基中对存活下来的细胞进行培养，待克隆出现后，进行基因组上插入序列的鉴定。将成功敲入荧光报告基因的克隆进行第二次转染，通过转入表达cre重组酶的质粒，完成对抗性基因hygromycin的切除。具体来说，针对成功实现基因敲入的人胚胎干细胞系即knock-in h9(k9)和knock-in hues7(k7)，通过转入表达cre重组酶的质粒(购自addgene的pegfp-n3(62043)，并在该质粒中插入由cag启动子启动的cre后完成对抗性基因潮霉素(hygromycin)进行切除，从而避免因潮霉素表达对k9和k7向心肌细胞分化产生的影响。
[0133]
本发明提供的构建方法，在启动子的atg密码子之后进行荧光报告基因的敲入，并且同时使用了3条grna，提高了构建的成功率。
[0134]
b.对基因敲入的不含抗性基因hygromycin的hesc单克隆进行pcr鉴定。
[0135]
由上游引物(up_f：
[0136]
ccgcgggcccgggatccgtcagtccgcggagtcaac(seq id no：4)和下游引物(up_r：tagagtcgcggccgcgccgcaaccaacacata(seq id no：5))扩增出的up条带说明片段插入到了基因组中isl1的后面。由中间引物(mid_f：gggcccgggatccgaaggaagaggaaga(seq id no：6)和mid_r：gaggtcgagatcctaagcttggc(seq id no：7))扩增出mid条带说明构建的hesc细胞系是杂合子(具体扩增结果参见图3中的(b))，成功获得了在内源isl1基因座上敲入了荧光报告基因mcherry的杂合子h9人胚胎干细胞系，即isl1
mcherry/+
h9人胚胎干细胞系。
[0137]
c.对构建成功的isl1
mcherry/+
h9人胚胎干细胞系(又称为k9细胞系)进行诱导分化。
[0138]
通过免疫荧光染色对未分化(即d0)的k9细胞系进行多能性基因(oct4，nanog和sox2)的表达鉴定。诱导k9向心肌细胞分化，并在d5对cpc特异性基因(gata4，nkx2-5和tbx5)进行检测(具体结果参见图3c)，d6分选出mcherry阳性细胞并检测isl1和mcherry的共定位(具体结果参见图3e)，通过facs分析k9细胞系分化至sd4时指征cm的mcherry阴性细胞的比例(具体结果参见图3f)，在sd4对mcherry阴性细胞检测cm特异性基因tnnt2和myl2的表达(具体结果参见图3g)。此外，在d0，d3，d4，d5，d6对基因mesp1，isl1，mcherry，gata4，nkx2-5，mef2c和tnnt2进行转录水平的检测(具体检测结果参见图3d)。
[0139]
d.运用本实施例a中相同的crispr-cas9基因敲入策略，在雄性来源的hues7人胚胎干细胞系中进行荧光报告基因mcherry在内源isl1启动子之后的敲入，并获得isl1
mcherry/+
knock-in hues7人胚胎干细胞系(简称k7)
[0140]
图4示出了运用crispr-cas9技术构建基因敲入的isl1
mcherry/+
hues7人胚胎干细胞系(k7)及其相关试验结果。
[0141]
【实验结论】
[0142]
根据本实施例建立了由内源cpc特异性转录因子isl1驱动表达荧光蛋白的人胚胎干细胞系k9和k7。以isl1的表达作为标志物的第二心域心脏祖细胞在哺乳动物心脏发育过程中具有增殖和分化为三种主要的心血管细胞类型，即cm，平滑肌细胞(smc)和内皮细胞(ec)的能力
2,3
。因此，在体外构建内源isl1驱动荧光报告基因的hes细胞系对与理解和操控isl1阳性cpcs都非常重要。
[0143]
实施例3：由chir99021和a-485构成的小分子组合2c能够将hesc来源的cms转变为isl1阳性的cpcs
[0144]
实验流程：
[0145]
a.配制诱导hescs来源cms去分化的培养基。本发明人在基础培养基mcdb131(thermo fisher)中加入终浓度为25μg/l的nahco3，1％的谷氨酰胺(thermo fisher)，20mm的葡萄糖，1
×
n2 supplement(100
×
，thermo fisher)，以及20％的1
×
b-27
tm
supplement，minus vitamin a(50
×
，thermo fisher)，从而获得诱导cms去分化的培养基mcdb131+。
[0146]
b.对hescs来源cms进行小分子处理。在mcdb131+培养基中加入终浓度为10μm的chir99021(mce)和0.5μm的a-485(mce)构成2c培养基。在mcdb131+中加入与2c等体积的dmso构成nc培养基。将md4时用于维持cms的培养基rpmi/b27更换为上述2c培养基或nc培养基，分别在处理24小时、48小时和60小时进行以下检测：
[0147]
(i)相差显微镜拍照记录细胞形态(具体结果参见图5a)，(ii)ccd显微镜记录cms收缩状态，分别对细胞的细胞质面积和细胞核面积进行统计(具体结果参见图5b)，(iii)免疫荧光染色检测不同阶段细胞标志物的表达(具体结果参见图5f和图5i)，(iv)提取mrna，
通过qpcr检测基因在转录水平的表达(具体结果参见图5c)，(v)通过高内涵拍照系统和分析软件对细胞总量和isl1阳性细胞量进行统计(具体结果参见图5g)，并分析细胞比例(具体结果参见图5h和图5j)，(vi)免疫印迹实验检测蛋白表达量的水平和isl1在蛋白水平表达量的变化(具体结果分别参见图5d和图5e)。
[0148]
c.对k9细胞系和k7细胞系来源的cms进行小分子处理。将筛选纯化4天(sd4)的心肌细胞进行facs分选，收集mcherry阴性的cms(具体参见图3f和图4d)并铺入到被纤粘连蛋白于37℃环境下过夜处理过的24孔细胞培养板(nest)或confocal细胞培养皿(bd)中。在md4时，将培养基由rpmi/b27培养基更换为2c培养基或nc培养基并处理细胞60小时。分别对处理后的细胞进行以下检测：
[0149]
(i)免疫荧光染色检测指征cpc标记基因isl1的mcherry的表达和cm标记基因tnnt2的表达(k9细胞系和k7细胞系的结果具体分别参见图6a图6b)，(ii)facs分析mcherry阳性细胞比例检测2c对mcherry阴性cms的去分化效率(k9细胞系和k7细胞系的结果具体分别参见图6c和图6d)，(iii)提取mrna，通过qpcr检测分别来自k9细胞系和k7细胞系的mcherry阴性cms在经过2c处理后的tnnt2、myl2、isl1和mcherry基因在转录水平的表达(k9细胞系和k7细胞系的结果具体参见图6e)。
[0150]
【实验结论】
[0151]
根据本实施例实现了在体外诱导人胚胎干细胞来源的心肌细胞去分化为心脏祖细胞的过程。在体外诱导终末分化的细胞向其前体细胞或者祖细胞去分化的研究可以帮助认识和了解细胞在发育过程中的不可逆性，为诱导体内终末分化细胞的去分化打下基础。
[0152]
实施例4：体外谱系追踪2c诱导k9和k7来源的mcherry阴性cms向mcherry阳性cpcs的转变
[0153]
【实验流程】：(具体流程参见图7a)
[0154]
a.构建用于谱系追踪的慢病毒质粒。
[0155]
通过pcr从hesc分化出的cm基因组dna中扩增出cm标记基因tnnt2的启动子(tnnt2p)，pcr中使用的引物分别为引物f：gtcatggagaagacccacctt(seq id no：8)和引物r：gatcctggaggcgtctgc(seq id no：9)。
[0156]
通过限制性酶消化或pcr从购自addgene的质粒中获得并生成末端重叠约20bp的其它dna片段，包括ert2-cre-ert2，loxp-stop-loxp-egfp。
[0157]
所述ert2-cre-ert2的核苷酸序列如下所示：
[0158]
gctggagacatgagagctgccaacctttggccaagcccgctcatgatcaaacgctctaagaagaacagcctggccttgtccctgacggccgaccagatggtcagtgccttgttggatgctgagccccccatactctattccgagtatgatcctaccagacccttcagtgaagcttcgatgatgggcttactgaccaacctggcagacagggagctggttcacatgatcaactgggcgaagagggtgccaggctttgtggatttgaccctccatgatcaggtccaccttctagaatgtgcctggctagagatcctgatgattggtctcgtctggcgctccatggagcacccagtgaagctactgtttgctcctaacttgctcttggacaggaaccagggaaaatgtgtagagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggctacatcatctcggttccgcatgatgaatctgcagggagaggagtttgtgtgcctcaaatctattattttgcttaattctggagtgtacacatttctgtccagcaccctgaagtctctggaagagaaggaccatatccaccgagtcctggacaagatcacagacactttgatccacctgatggccaaggcaggcctgaccctgcagcagcagcaccagcggctggcccagctcctcctcatcctctcccacatcaggcacatgagtaacaaaggcatggagcatctgtacagcatgaagtgcaagaacgt
ggtgcccctctatgacctgctgctggaggcggcggacgcccaccgcctacatgcgcccactagccgtggaggggcatccgtggaggagacggaccaaagccacttggccactgcgggctctacttcatcgcattccttgcaaaagtattacatcacgggggaggcagagggtttccctgccacagctgtcgacaatttactgaccgtacaccaaaatttgcctgcattaccggtcgatgcaacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacatgttcagggatcgccaggcgttttctgagcatacctggaaaatgcttctgtccgtttgccggtcgtgggcggcatggtgcaagttgaataaccggaaatggtttcccgcagaacctgaagatgttcgcgattatcttctatatcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagcaacatttgggccagctaaacatgcttcatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacagcaatgctgtttcactggttatgcggcggatccgaaaagaaaacgttgatgccggtgaacgtgcaaaacaggctctagcgttcgaacgcactgatttcgaccaggttcgttcactcatggaaaatagcgatcgctgccaggatatacgtaatctggcatttctggggattgcttataacaccctgttacgtatagccgaaattgccaggatcagggttaaagatatctcacgtactgacggtgggagaatgttaatccatattggcagaacgaaaacgctggttagcaccgcaggtgtagagaaggcacttagcctgggggtaactaaactggtcgagcgatggatttccgtctctggtgtagctgatgatccgaataactacctgttttgccgggtcagaaaaaatggtgttgccgcgccatctgccaccagccagctatcaactcgcgccctggaagggatttttgaagcaactcatcgattgatttacggcgctaaggatgactctggtcagagatacctggcctggtctggacacagtgcccgtgtcggagccgcgcgagatatggcccgcgctggagtttcaataccggagatcatgcaagctggtggctggaccaatgtaaatattgtcatgaactatatccgtaacctggatagtgaaacaggggcaatggtgcgcctgctggaagatggcgatctcgagccatctgctggagacatgagagctgccaacctttggccaagcccgctcatgatcaaacgctctaagaagaacagcctggccttgtccctgacggccgaccagatggtcagtgccttgttggatgctgagccccccatactctattccgagtatgatcctaccagacccttcagtgaagcttcgatgatgggcttactgaccaacctggcagacagggagctggttcacatgatcaactgggcgaagagggtgccaggctttgtggatttgaccctccatgatcaggtccaccttctagaatgtgcctggctagagatcctgatgattggtctcgtctggcgctccatggagcacccagtgaagctactgtttgctcctaacttgctcttggacaggaaccagggaaaatgtgtagagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggctacatcatctcggttccgcatgatgaatctgcagggagaggagtttgtgtgcctcaaatctattattttgcttaattctggagtgtacacatttctgtccagcaccctgaagtctctggaagagaaggaccatatccaccgagtcctggacaagatcacagacactttgatccacctgatggccaaggcaggcctgaccctgcagcagcagcaccagcggctggcccagctcctcctcatcctctcccacatcaggcacatgagtaacaaaggcatggagcatctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctctatgacctgctgctggaggcggcggacgcccaccgcctacatgcgcccactagccgtggaggggcatccgtggaggagacggaccaaagccacttggccactgcgggctctacttcatcgcattccttgcaaaagtattacatcacgggggaggcagagggtttccctgccaca(seq id no：13)
[0159]
所述loxp-stop-loxp-egfp的核苷酸序列如下所示：
[0160]
ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcgcgatgaataaatgaaagcttgcagatctgcgactctagaggatctgcgactctagaggatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatctgcgactctagaggatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatctgcgactctagaggatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacc
tgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatccccatcaagctgatccggaacccttaatataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattaggtccctcgacctgcgctgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctatggagtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa(seq id no：14)
[0161]
将上述dna片段与hifi dna组装母液(new england biolabs)以1:1的体积比混合，并在50℃下孵育约30分钟。孵育后的产物被转化到trans1-t1感受态细胞中(transgen biotech)。在含有抗生素的细菌培养板中挑选转化后的单克隆并进行pcr鉴定。对单克隆进行扩大培养后提取质粒备用，并将该质粒命名为lenti-tcle。
[0162]
b.慢病毒的包装和病毒悬液的收集。
[0163]
慢病毒的包装在hek293t细胞中进行。将hek293t细胞提前铺至培养皿或细胞培养板中，待细胞密度达到70％时进行转染。将本实施例a中构建得到的慢病毒质粒lenti-tcle与两个病毒包装质粒pspax2(addgene)和pmd2.g(addgene)按照4:3:1的比例进行混合，利用脂质体3000(thermo fisher)进行转染。将转染混合物逐滴加入待转染的hek293t细胞中，37℃培养箱培养8-12个小时，随后更换新鲜培养基。转染48小时后，收取细胞培养上清液，用0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片，随后使用超速离心机在25，000rpm和4℃环境下离心2小时。去除上清液后，用少量rpmi/b27培养基重悬浓缩后的病毒获得用于侵染cms的病毒悬液。
[0164]
c.收集被egfp标记的心肌细胞(cms)。
[0165]
将本实施例b中制备的病毒悬液与新鲜的cm培养基(rpmi/b27)按不同的比例(分别为1:25、1:10、1:5和1:2)进行混合获得梯度稀释后的病毒悬液。通过换液，将稀释后的病毒悬液加入饲养cms的培养板中侵染48小时。更换病毒悬液为用含有2μm他莫昔芬(tamoxifen，selleck)的cm培养基再培养6天。随后，将facs分选出的被egfp标记的cms按单细胞培养方式进行贴壁培养，待cms恢复收缩后进行含有10μm的chir99021和0.5μm的a-485的2c培养基或含有等体积dmso的nc培养基处理。通过免疫荧光检测不同的慢病毒浓度对cms的侵染效率以及对egfp对cms的标记状态，并统计tnn2阳性cms的数量和egfp阳性cms的比例(具体结果参见图7b-图7d)。
[0166]
d.诱导egfp标记的心肌细胞去分化。
[0167]
通过facs分别收集来自h9细胞系来源，k9细胞系来源和k7细胞系来源的被egfp标记的cms。在2c处理60小时后，通过免疫荧光染色检测h9来源egfp阳性cms的去分化后cpc标记基因isl1和被标记cm中egfp的表达(具体参见图7e)。通过facs分析统计k9来源mcherry
阴性cms被egfp标记的效率(具体参见图7f)以及2c处理后的去分化效率(具体参见图7g)。同样的分析方法也被用于k7来源mcherry阴性cms中(具体参见图7h和图7i)。
[0168]
【实验结论】：
[0169]
根据本实施例，通过对起始细胞进行荧光蛋白的标记，追踪被标记细胞在药物处理后的命运改变，可直接证明2c将心肌细胞诱导去分化为心脏祖细胞的作用。同时，该谱系追踪的系统也将排除因起始细胞不纯造成的由其他细胞类型向心脏祖细胞的去分化。
[0170]
实施例5小分子药物组合2c诱导新生大鼠心肌细胞去分化为心脏祖细胞
[0171]
本实施例进一步通过体内鉴定的方式来验证小分子药物组合2c对体内心肌细胞向心脏祖细胞的去分化作用。由于新生鼠相较于成年鼠，其心脏中的心肌细胞处于未成熟状态8，因此更易于被诱导去分化。此外，相较于新生小鼠而言，新生大鼠的个体更大，易于给药。基于上述原因，本实施例中选择新生大鼠作为试验对象。
[0172]
实验流程：
[0173]
a.验证小分子药物组合2c对原代新生大鼠心室心肌细胞(nrvcms)的去分化作用。
[0174]
从清华大学实验动物中心订购新生1-5天的sd大鼠，解剖新生鼠心脏，分离获得原代心肌细胞。所用手术器械需提前高压灭菌。具体方法如下：(i)用异弗烷麻醉新生鼠，将其全身浸泡过75％的酒精后，用剪刀打开胸腔。快速取出跳动的心脏，并将其转移到含有30ml预冷hbss(gibco)的50ml bd管中。每5个新生sd大鼠的心脏收集到同一支bd管。倒去hbss，将5个心脏转移到置于冰上的无菌10cm培养皿中。去除心脏组织中的血管和其他非心脏组织，加10ml预冷的hbss清洗。将心脏转移到新的置于冰上的无菌10cm培养皿中，用小剪刀将心脏组织充分剪碎到1mm3左右大小。加10ml含终浓度为50μg/ml胰蛋白酶(trypsin)的预冷hbss。用封口膜密封10cm培养皿，避光保存在4℃冰箱，过夜消化。(ii)次日。在取出消化后的心脏组织前，用0.1％明胶(gelatin)提前包被培养板待用。随后，转移消化过夜的组织到50ml bd管中，加5％胎牛血清(fbs)进行中和。在37℃培养箱中温热过夜消化的细胞。30分钟后，加入5ml终浓度为94unit/ml的胶原酶。继续在37℃消化45分钟，在170-200rpm的摇床上轻轻晃动。用酒精擦拭管口以防污染。以3ml/秒的速度吹打消化后的组织，将充分混匀的组织过滤70μm滤网。用5ml含有终浓度为5mm丙酮酸钠的mem培养基重悬充分消化的组织，进一步过滤，并用另外2ml含有终浓度为5mm丙酮酸钠的mem培养基清洗滤网。将过滤后细胞在操作台中静置60分钟。离心机用100g转速离心5分钟，用含有10％fbs和2
×
青链霉素混合液(100
×
penicillin-streptomycin，thermo fisher)的dmem培养基重悬细胞。在离心过程中，准备两个10cm细胞培养板。将重悬后的细胞等分于培养板中，在37℃培养箱中静置1个小时，目的是让成纤维细胞贴壁。取出培养板，转移含有心肌细胞的培养基到50mlbd管中，100g离心5分钟。在离心过程中，配置含有10％fbs、1
×
青链霉素混合液和终浓度为0.1mm 5-溴脱氧尿苷(brdu)的dmem培养基。用该培养基重悬细胞并计数。将细胞以4800个/mm2的密度，均匀铺入0.1％ gelatin包被过的培养板中。摇匀后置于37℃培养箱中过夜贴壁至少24小时，期间不要晃动。(iii)第3日。更换培养基为含5％fbs、1
×
青链霉素混合液和终浓度0.1mm brdu的dmem。(iv)第4日。更换培养基为含有5％fbs和1
×
青链霉素混合液的dmem/mem培养基。随后，每2-3天更换一次培养基。待心肌细胞恢复收缩，先检测心肌细胞标记基因的表达，确定细胞状态后进行2c或dmso(nc)的处理。经过72小时处理，免疫荧光染色结果显示2c能够将nrvcms诱导去分化为表达isl1的cpcs(具体参见8a))。
[0175]
b.对新生大鼠通过腹腔注射的方式进行小分子药物组合2c或dmso(nc)给药。
[0176]
从清华大学实验动物中心订购孕18天的大鼠，待子鼠出生后观察一天。自出生1天(p1)开始进行连续5天的腹腔注射给药(具体参见图8b)。新生鼠随机分为两组，药物组2c的给药终浓度为20mg/kg chir99021和10mg/kg a-485，对照组dmso是溶解对应药物chir99021和a-485在配制过程中的相同体积，并在给药过程中每天对两组新生鼠进行称重(具体参见图8c中的左图)。对结束给药(p5)后再饲养一天(p6)的新生鼠进行麻醉，摘取心脏并称重计算心脏体重比(具体参见图8c中的右图)。将摘取的心脏用pbs清洗后置于4％的多聚甲醛固定液(pfa)中固定，随后在30％的蔗糖溶液中脱水。对脱水后的心脏进行oct(optimal cutting temperature)包埋和冰冻切片。切片的方向为横向自心脏外流管处的心底(base)区向心尖处的心尖(apex)区进行，切片的厚度为5μm。
[0177]
c.检测小分子药物组合2c对体内cms的去分化效果。
[0178]
将收集的所有切片在室温过夜干燥。通过免疫荧光实验检测cpc标记基因isl1和cm标记基因tnnt2在心脏不同区域的表达。与给了dmso的nc组相比，2c能够显著诱导isl1阳性的细胞出现在心脏的左右心房，主动脉根部，心脏神经节以及左右心室中(具体参见图8d)。
[0179]
实施例6小分子药物组合2c诱导新生大鼠心肌细胞去分化为心脏祖细胞
[0180]
在实施例5验证了成功诱导新生大鼠心脏中心肌细胞(cms)向心脏祖细胞(cpcs)去分化的基础上，本发明人继续研究小分子药物组合2c对成年小鼠中的cms去分化作用。
[0181]
实验流程：
[0182]
a.验证小分子药物组合2c对成年小鼠心脏中cms的去分化作用的效果。
[0183]
从清华大学实验动物中心订购8周的129svj品系小鼠，在饲养环境中适应1周左右后，开始进行连续5天的腹腔注射给药。
[0184]
成年小鼠随机分为两组，每组4只，药物组(称为2c组)小分子组合2c的给药终浓度为20mg/kg chir99021和10mg/kg a-485，对照组(称为nc组)dmso是溶解对应药物chir99021和a-485在配制过程中的相同体积。给药过程中每天对两组小鼠进行称重。对结束给药后再饲养一天的小鼠进行麻醉，摘取心脏并用pbs清洗后置于4％的pfa中固定，随后在30％的蔗糖溶液中脱水。对脱水后的心脏进行oct包埋和冰冻切片。切片的方向为横向自心脏外流管处的base区向心尖处的apex区进行，切片的厚度为5μm。
[0185]
b.检测2c对体内cms的去分化效果。
[0186]
将收集的所有切片在室温过夜干燥。通过免疫荧光实验检测cpcs标记基因isl1和cms标记基因tnnt2在心脏不同区域的表达。检测结果表明，与施用了dmso的nc组相比，小分子药物组合2c能够显著诱导isl1阳性的细胞出现在心脏的右心房和主动脉根部(具体参见图9a)。
[0187]
实施例7通过bulk-rna测序和单细胞测序验证小分子药物组合2c诱导心肌细胞去分化为心脏祖细胞
[0188]
7.1通过bulk-rna测序验证小分子药物组合2c可诱导心肌细胞(cms)转变为心脏祖细胞(cpcs)
[0189]
本发明人对用dmso(称为nc组)或小分子药物组合2c(称为2c组)处理60小时的k9来源的isl1/mcherry阴性cms进行了bulk rna-seq分析(具体参见图10a)。对差异表达基因
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技术特征：
1.一种体外诱导人胚胎干细胞(hescs)向心肌细胞(cms)分化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：i)将hescs铺入12孔板中，在基础培养基a中饲养2天后进行起始分化培养；ii)在起始分化培养的基础培养基b中添加终浓度为1
×
的b27-minus insulin、10～25ng/ml hbmp4、10～25ng/ml havtivina和1～5μm chir99021；iii)在起始分化的第2天、第5天和第8天分别更换培养基，分化培养至第14天；iv)在分化培养的第14天，将培养基更换为不含葡萄糖的基础培养基c，并在其中添加3～5mm的乳酸盐；v)对cms进行4天的纯化筛选，获得单层收缩的cms，使用tryple express酶进行消化，转移至含有血清的基础培养基b中，离心去上清；vi)添加重悬培养基对cms进行重悬，以每个孔(0.5～1.5)
×
104个细胞的数量加入到被纤粘连蛋白处理过的384孔板中，24小时后更换培养基；经过4天培养，得到恢复收缩的单细胞cms。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述hescs为未经过体内发育的受精14天以内的人胚胎分离的hescs。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基础培养基a为mtesr1培养基，所述基础培养基b为rpmi1640培养基，所述基础培养基c为dmem培养基。4.根据权利要求1～4任一项中所述的方法，其中所述步骤ii)中hbmp4、havtivina和chir99021的浓度分别为20ng/ml、20ng/ml和1.5μm。5.根据权利要求1～4任一项中所述的方法，其中所述步骤iii)中在起始分化的第2天、第5天和第8天分别更换为添加了2～8μm iwp2的rpmi/b27-ins
培养基、rpmi/b27-ins
培养基和rpmi/b27培养基；其中步骤vi)中所述重悬培养基为添加有3～10％的gfbs和2～8μm的y-27632的mem-α培养基，所述24小时后更换的培养基为rpmi/b27培养基；优选的，所述步骤iii)中在起始分化的第2天更换的培养基为添加了5μmiwp2的rpmi/b27-ins
培养基；优选的，所述步骤vi)中所述重悬培养基为添加有5％的gfbs和5μm的y-27632的mem-a培养基。6.一种体外诱导心肌细胞(cms)去分化为心脏祖细胞(cpcs)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)利用权利要求1～5中任一项所述的方法获得心肌细胞(cms)2)以0.05～0.2
‰
(v/v)或终浓度3～8μm在384孔板中加入2种以上的小分子药物化合物组合，体外诱导cms去分化为cpcs；优选的，所述2种以上的小分子药物化合物组合在384孔板中的添加量为0.1
‰
(v/v)或终浓度5μm。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述2种以上的小分子药物化合物组合选自由以下组合中的任一种：(1)chir99021和a-485的组合；(2)chir99021、a-485和bet-762的组合；(3)chir99021、a-485和le135的组合；
(4)chir99021、a-485和sb431542的组合；(5)chir99021、a-485、bet-762和sb431542的组合；优选的，所述小分子药物化合物组合为chir99021和a-485的组合。8.一种人胚胎干细胞(hescs)细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：i)crispr-cas9质粒的设计与构建；ii)转染人胚胎干细胞和筛选hescs阳性克隆；iii)对步骤ii)筛选的hesc阳性克隆进行pcr鉴定，其中，步骤i)中所述crispr-cas9质粒包括(1)模板质粒和(2)引导rna质粒；所述模板质粒中包含左同源臂序列和右同源臂序列；优选的，所述左同源臂的正向引物和反向引物分别为seq id no:4和seq id no：10，所述右同源臂的正向引物和反向引物分别为seq id no:11和seq id no：12；所述引导rna质粒为3个，其中分别包含seq id no：1～3所示的sgrna1、sgrna2和sgrna3；其中步骤ii)的具体操作为：(a)将步骤i)中构建的模板质粒和3个引导rna质粒同时分别转入人胚胎干细胞(hesc)h9细胞系和hues7细胞系；(b)加入潮霉素进行筛选，待连续3天不存在明显的细胞漂浮后，在不含有潮霉素的培养基中对存活下来的细胞进行培养和鉴定；(c)在上述鉴定为阳性的细胞系中转入表达cre重组酶的质粒，切除潮霉素的编码基因。9.小分子药物组合在诱导心肌细胞(cms)去分化为心脏祖细胞(cpcs)中的用途，其中所述小分子药物化合物组合选自由以下组合中的任一种：(1)chir99021和a-485的组合；(2)chir99021、a-485和bet-762的组合；(3)chir99021、a-485和le135的组合；(4)chir99021、a-485和sb431542的组合；(5)chir99021、a-485、bet-762和sb431542的组合；优选的，所述小分子药物化合物组合为chir99021和a-485的组合。10.根据权利要求9所述的用途，其中所述心肌细胞为hescs来源的心肌细胞或者为mcherry阴性的心肌细胞，所述心脏祖细胞为isl1阳性的心脏祖细胞或者为mcherry阳性的心脏祖细胞。11.根据权利要求9或10所述的用途，其中所述心肌细胞来源于哺乳动物，所述诱导为体外诱导或体内诱导；优选的，所述哺乳动物为大鼠或小鼠。12.小分子药物组合在制备诱导心肌细胞(cms)去分化为心脏祖细胞(cpcs)的制剂中的用途，其中所述小分子药物化合物组合选自由以下组合中的任一种：(1)chir99021和a-485的组合；(2)chir99021、a-485和bet-762的组合；(3)chir99021、a-485和le135的组合；
(4)chir99021、a-485和sb431542的组合；(5)chir99021、a-485、bet-762和sb431542的组合；优选的，所述小分子药物化合物组合为chir99021和a-485的组合。13.根据权利要求12所述的用途，其中所述心肌细胞为hescs来源的心肌细胞或者为mcherry阴性的心肌细胞，所述心脏祖细胞为isl1阳性的心脏祖细胞或者为mcherry阳性的心脏祖细胞。14.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述心肌细胞来源于哺乳动物，所述诱导为体外诱导或体内诱导；优选的，所述哺乳动物为大鼠或小鼠。

技术总结
本发明涉及利用小分子药物诱导心肌细胞重编程为心脏祖细胞的方法。本发明提供了一种体外诱导人胚胎干细胞(hESCs)向心肌细胞(CMs)分化的方法以及小分子药物组合在诱导心肌细胞去分化为心脏祖细胞中的用途。本发明成功构建了基于hESCs来源的CMs的高通量小分子药物筛选平台。本发明运用CRISPR-Cas9技术以基因敲入的方式构建了分别来源于男性和女性的基因敲入ISL1


技术研发人员：丁胜 周伟 马天骅
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/9/23