利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺的制作方法

1.本发明属于微生物发酵生产黄原胶技术领域，具体涉及利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺。
技术背景
2.黄原胶(xanthan gum)是由野油菜黄单胞菌(xanthomonas campestris)发酵产生的一种酸性胞外杂多糖，其主链由β-1,4糖苷键连接的d-葡萄糖构成，三糖侧链由d-甘露糖、d-葡萄糖醛酸和d-甘露糖连接而成并通过α-1,3糖苷键连接到主链上的葡萄糖残基上，侧链末端甘露糖残基部分发生丙酮酸化，内部甘露糖残基大部分发生乙酰化，丙酮酸和乙酰基取代的水平因菌株及其代谢环境的差异而变化，在此结构基础之上黄原胶分子能够形成更为复杂的二级及三级结构。黄原胶分子独特的结构使其水溶液具有独特的剪切稀释性能、良好的增稠性、乳化稳定性及耐酸碱环境、耐温性，因而广泛应用于食品、石油开采、医药、农业、化工等众多行业，是一种具有重要商业价值的微生物多糖。
3.目前，黄原胶作为增稠剂、悬浮剂广泛应用于食品、石油、农业等行业。随着应用领域扩展，对黄原胶的性能提出了更高的要求，通过提高黄原胶产品的粘度即产品耐稀释性能可在减少黄原胶使用量的情况下保持相同粘度或达到更高粘度，降低使用成本，在石油、农业等对于应用成本敏感的行业具有更好的应用前景。
4.黄原胶的产量和性能受发酵菌株和发酵生产工艺的影响。现有技术对产黄原胶的原始菌株进行了基因工程改良，获得产量和性能改善的基因工程菌。例如：
5.cn103695453 a公开了一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因在黄原胶生产中的应用，用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌，该基因工程菌携带该基因的重组质粒pl0495,通过将pl0495导入野油菜黄单胞菌野油菜变种的野生型菌株8004获得。研究发现，xcc8004菌株基因组中编码巯基-二硫键氧化还原酶基因与黄原胶产量有关，该基因可用于构建，选育黄原胶高产的基因工程菌株。
[0006]“野油菜黄单胞菌中gumd基因的过表达对产黄原胶的影响，中国生化药物杂志”，在野油菜黄单胞菌中过量表达产胶基因gumd，提高黄原胶发酵产量和质量。通过pcr扩增，将重组质粒pbbr-gumd转入原始菌xc58。结果工程菌与原始菌相比，黄原胶产量提高11.19％，黏度提高6.31％,重均分子质量提高20.21％，乙酰基含量提高77.07％，丙酮酸含量下降6.34％。结论改造后的菌株的黄原胶发酵产量和质量都较原始菌株有所提高。
[0007]
也有现有技术对黄原胶发酵工艺进行了改进，例如：cn101560537a公开一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法,将发酵培养阶段设计为基础培养基发酵培养阶段包括补料培养基a流加,料培养基b流加，ph调控环节。在严格控制发酵液光密度的情况下依次分两步流加淀粉和含有淀粉质粗农产品，逐步增加碳氮比,通过酸碱中和液控制发酵ph值,达到了将工艺发酵时间从60-75小时缩短至40-48小时,高成本的工业原料改进为低成本的初农产品替代，原料成本降低15～20％,发酵时间缩短使能源消耗降低25～30％，通过试验数据表明，原料转化率达到85～90％，黏度提高10～20％。


技术实现要素：

[0008]
本发明要解决的技术问题提高黄原胶产品的性能，使得低浓度溶液具有高粘度。为了解决上述技术问题，本发明提供了利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺。
[0009]
本发明是通过以下技术方案实现的。
[0010]
利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
[0011]
步骤1)菌株活化：
[0012]
将基因工程菌xanthomonas campestrisδgumf-27接种于斜面lb培养基上，32℃静置培养1天，获得活化菌种；
[0013]
步骤2)黄原胶发酵生产种子液制备：
[0014]
挑取经斜面活化培养的菌种，接种于种子培养液里，32℃培养20h，获得成熟种子液；
[0015]
步骤3)黄原胶发酵生产：
[0016]
将成熟种子液接种到发酵培养液中，通过分阶段控制发酵条件，生产获得高分子量黄原胶产物。
[0017]
优选地，所述分阶段控制发酵条件为：
[0018]
0-18h：温度32℃、ph自然、通风量1.2v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧30％；18-60h：温度28℃、每隔6h流加碱液调控发酵液ph至6.8、通风量1.8v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧10％。
[0019]
优选地，所述种子培养液由如下组分组成：玉米淀粉20g/l，大豆蛋白胨5g/l，nacl 2g/l,硫酸锰1ppm,聚醚消泡剂0.2g/l,其他为水,ph 7.0-7.2。
[0020]
优选地，所述发酵培养液由如下组分组成：玉米淀粉35g/l，甘油10g/l，大豆蛋白胨2g/l，nacl 2g/l，硫酸锰2ppm，硫酸锌2ppm，聚醚消泡剂0.22ppm，其他为水；ph 7.0-7.2。
[0021]
更优选地，所述发酵培养液由如下组分组成：玉米淀粉35g/l，甘油10g/l，大豆蛋白胨2g/l，nacl 2g/l，硫酸锰2ppm，硫酸锌2ppm，聚醚消泡剂0.2g/l，甜菜碱10-50g/l，其他为水；ph 7.0-7.2。
[0022]
优选地，所述xanthomonas campestrisδgumf-27菌种按照如下方法构建：将敲除质粒pk18mobsacb-δgumf转入到xanthomonas campestris nrrl b-1459，筛选出gumf基因敲除的工程菌株xanthomonas campestrisδgumf-27。
[0023]
优选地，所述敲除质粒pk18mobsacb-δgumf的序列如seq id no.6所示。
附图说明
[0024]
图1：pk18mobsacb-δgumf载体图谱。
具体实施方式
[0025]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0026]
为了使本领域技术人员能够更加清楚了解本发明公开的技术方案，以下结合具体的实施例详细说明本发明公开的技术方案。
[0027]
实施例1
[0028]
产高分子量黄原胶生产菌株工程菌株xanthomonas campestrisδgumf-27的构建：
[0029]
(1)从合成普通黄原胶菌株xanthomonas campestris nrrl b-1459基因组上扩增获得gumf(seq id no.1)的上下游同源臂基因，上游同源臂基因的扩增引物为：seq id no.2和3，下游同源臂基因的扩增引物为：seq id no.4和5；通过双酶切获得pk18mobsacb线性化载体，利用t5 dna连接酶将gumf的上下同源臂片段插入到质粒上的多克隆位点，构建获得乙酰基转移酶gumf的敲除质粒pk18mobsacb-δgumf(seq id no.6，注：序列表中的小写字母为δgumf序列)，载体图谱见图1。
[0030]
(2)将敲除质粒pk18mobsacb-δgumf转化至dh-5α菌株，获得转化子，得到重组菌株dh-5α/pk18mobsacb-δgumf。
[0031]
(3)将从重组菌株dh-5α/pk18mobsacb-δgumf中提取的质粒通过电击转化的方式转移至xanthomonas campestris nrrl b-1459，kanamycin平板筛选单交换菌株，蔗糖致死平板筛选已敲除gumf的双交换菌命名为xanthomonas campestrisδgumf-27。
[0032]
(4)利用菌株xanthomonas campestrisδgumf-27发酵获得低乙酰基高丙酮酸基黄原胶产品。
[0033]
实施例2
[0034]
高分子量黄原胶发酵生产：
[0035]
(1)菌株活化：
[0036]
将处于-80℃保藏的xanthomonas campestrisδgumf-27菌种无菌接种于斜面lb培养基上，32℃静置培养1天，获得活化菌种，用于发酵生产种子液制备。
[0037]
(2)高分子量黄原胶发酵生产种子液制备：
[0038]
挑取经斜面活化培养的生产菌种(xanthomonas campestrisδgumf-27)2-3环，接种于种子培养液里，32℃培养20h，获得成熟种子液。
[0039]
所述种子培养液由如下组分组成(单位g/100ml)：玉米淀粉2.0；大豆蛋白胨0.5；nacl 0.2；硫酸锰1ppm(终浓度)；聚醚消泡剂0.02；其他为软化水；ph 7.0-7.2。
[0040]
(3)高分子量黄原胶发酵生产：
[0041]
将培养成熟的xanthomonas campestrisδgumf-27菌株种子液接种到经灭菌的发酵培养液中，调整发酵培养液的ph，进行通气搅拌发酵培养，通过分阶段控制发酵条件，生产获得高分子量黄原胶产物。
[0042]
所述发酵培养液如下组分组成(单位g/100ml)：玉米淀粉4.5；大豆蛋白胨0.2；nacl 0.2；硫酸锰、硫酸锌各2ppm(终浓度)；聚醚消泡剂0.02；其他为软化水；ph 7.0-7.2。
[0043]
所述发酵控制条件如下：
[0044]
0-18h：温度32℃、ph自然、通风量1.2v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧30％；
[0045]
18h-放罐(60h)：温度28℃、每隔6h流加碱液调控发酵液ph至6.8、通风量1.8v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧10％。
[0046]
获得高分子量黄原胶。
[0047]
实施例3
[0048]
高分子量黄原胶发酵生产：
[0049]
(1)菌株活化：
[0050]
将处于-80℃保藏的xanthomonas campestrisδgumf-27菌种无菌接种于斜面lb培养基上，32℃静置培养1天，获得活化菌种，用于发酵生产种子液制备。
[0051]
(2)高分子量黄原胶发酵生产种子液制备：
[0052]
挑取经斜面活化培养的生产菌种(xanthomonas campestrisδgumf-27)2-3环，接种于发酵种子液里，32℃培养20h，获得成熟种子液。
[0053]
所述种子培养液由如下的组分组成(单位g/100ml)：玉米淀粉2.0；大豆蛋白胨0.5；nacl 0.2；硫酸锰1ppm(终浓度)；聚醚消泡剂0.02；其他为软化水；ph 7.0-7.2。
[0054]
(3)高分子量黄原胶发酵生产：
[0055]
将培养成熟的xanthomonas campestrisδgumf-27菌株种子液接种到经灭菌的发酵培养液中，调整发酵培养液的ph，进行通气搅拌发酵培养，通过分阶段控制发酵条件，生产获得高分子量黄原胶产物。
[0056]
所述发酵培养液如下的组分组成(单位g/100ml)：玉米淀粉3.5，甘油1；大豆蛋白胨0.2；nacl 0.2；硫酸锰、硫酸锌各2ppm(终浓度)；聚醚消泡剂0.02；其他为软化水；ph 7.0-7.2。
[0057]
所述发酵控制条件如下：
[0058]
0-18h：温度32℃、ph自然、通风量1.2v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧30％；
[0059]
18h-放罐(60h)：温度28℃、每隔6h流加碱液调控发酵液ph至6.8、通风量1.8v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧10％。
[0060]
获得高分子量黄原胶。
[0061]
实施例4
[0062]
应用上述方法制备的高分子量黄原胶的性能指标检测结果如下：
[0063]
(1)多糖产率测定
[0064]
根据文献中一般采用的方法如下：
[0065]
a.所用仪器：恒温干燥箱、分析天平(0.001g)。
[0066]
b.测定方法：准确量取一定体积的发酵液，缓慢加入90-95％的乙醇沉淀多糖，过滤后再用90-95％的乙醇洗涤一遍，滤干后置于105℃恒温干燥箱干燥至恒重，降温后称重。
[0067]
多糖产率＝样品干重/发酵液体积
×
100％。
[0068]
(2)多糖分子量测定
[0069]
a.所用仪器：凝胶渗透色谱仪(gpc)。
[0070]
b.测定方法：蒸馏水配制0.1％(w/v)浓度的黄原胶溶液，并以10,000
×
g离心30min，采用0.22μm水系膜过滤上清液制备待测样品。使用gpc系统测定多糖分子量，配有差示折射检测器和多角度激光散射检测器。nano3溶液(0.1％)作为流动相，流速1ml/min，柱温30℃。
[0071]
(3)多糖乙酰基与丙酮酸含量测定
[0072]
a.所用仪器：高效液相色谱仪(hplc)。
[0073]
b.测定方法：参照cheetham和punruckvong的方法测定不同黄原胶样品的乙酰基和丙酮基含量。h.c n w,acharaporn p.an hplc method for the determination of acetyl and pyruvyl groups in polysaccharides[j].carbohydrate polymers,1985,5
(6).
[0074]
(4)多糖产物粘度测定
[0075]
a.所用仪器：brookfield dv
‑ⅱ
型旋转粘度计，62#转子，60r/min，20℃测定。
[0076]
b.测定方法：准确称取采用本发明方法制备的黄原胶产品或对比黄原胶产品0.6g溶于300.0ml蒸馏水中，1000r/min搅拌至溶解，静置30min，测定其粘度。
[0077]
c.测定结果见表1：
[0078]
表1
[0079][0080]
其中，对比例1是使用原始菌株进行与实施例2的相同工艺发酵，与实施例2的区别在于发酵菌株的不同，具备可比较性；对比例2为市售食品级黄原胶产品。由上表1测定结果对比知，实施例3通过优化培养基组分，降低了玉米淀粉的使用量，补充甘油作为碳源，提高了发酵产量20％以上，但是乙酰基含量、分子量以及丙酮酸含量等指标并没有明显变化。此外，发明人尝试用等量的蔗糖、葡萄糖、糖蜜、麦芽糖来替换甘油，发酵产量较实施例2没有明显变化；发明人还尝试在对比例1中使用甘油作为部分替代碳源(即，使用实施例3相同的发酵培养液)，对黄原胶产量并无明显的上调作用，说明甘油对野生型的xanthomonas campestris nrrl b-1459和xanthomonas campestrisδgumf-27的作用机理不相同，具体机制尚待进一步明确。
[0081]
结论，本发明构建菌种xanthomonas campestrisδgumf-27合成的黄原胶具有乙酰基含量低、分子量高、丙酮酸含量高、发酵产率高、低含量溶液粘度高，实现了耐稀释高分子量新型黄原胶的高效发酵生产。
[0082]
实施例5
[0083]
甜菜碱对xanthomonas campestrisδgumf-27的产胶能力测试。
[0084]
在实施例3的基础上，继续优化培养基，发酵工艺同实施例3，在实施例3中的发酵培养液中添加不同浓度的甜菜碱，考察甜菜碱对产黄原胶能力的影响。发酵菌株采用xanthomonas campestris nrrl b-1459和xanthomonas campestrisδgumf-27，具体黄原胶产量(％)见表2。
[0085]
表2
[0086]
[0087]
结论：甜菜碱能够提高xanthomonas campestrisδgumf-27的发酵黄原胶的产量，最适添加量为1-5g/100ml，添加量过大反而会导致黄原胶产量下降；甜菜碱对黄原胶分子量、丙酮酸含量以及粘稠度等指标均没有明显影响。
[0088]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：步骤1)菌株活化：将基因工程菌xanthomonas campestrisδgumf-27接种于斜面培养基上，32℃静置培养1天，获得活化菌种；步骤2)黄原胶发酵生产种子液制备：挑取经斜面活化培养的菌种，接种于种子培养液里，32℃培养20h，获得成熟种子液；步骤3)黄原胶发酵生产：将成熟种子液接种到发酵培养液中，通过分阶段控制发酵条件，生产获得高分子量黄原胶产物。2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述分阶段控制发酵条件为：0-18h：温度32℃、ph自然、通风量1.2v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧30％；18-60h：温度28℃、每隔6h流加碱液调控发酵液ph至6.8、通风量1.8v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧10％。3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述种子培养液由如下组分组成：玉米淀粉20g/l，大豆蛋白胨5g/l，nacl 2g/l,硫酸锰1ppm,聚醚消泡剂0.2g/l,其他为水,ph 7.0-7.2。4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养液由如下组分组成：玉米淀粉35g/l，甘油10g/l，大豆蛋白胨2g/l，nacl 2g/l，硫酸锰2ppm，硫酸锌2ppm，聚醚消泡剂0.2g/l，其他为水；ph 7.0-7.2。5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养液由如下组分组成：玉米淀粉35g/l，甘油10g/l，大豆蛋白胨2g/l，nacl 2g/l，硫酸锰2ppm，硫酸锌2ppm，聚醚消泡剂0.2g/l，甜菜碱10-50g/l，其他为水；ph 7.0-7.2。6.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养液由如下组分组成：玉米淀粉35g/l，甘油10g/l，大豆蛋白胨2g/l，nacl 2g/l，硫酸锰2ppm，硫酸锌2ppm，聚醚消泡剂0.2g/l，甜菜碱25g/l，其他为水；ph 7.0-7.2。7.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述xanthomonas campestrisδgumf-27菌种按照如下方法构建：将敲除质粒pk18mobsacb-δgumf转入到xanthomonas campestris nrrl b-1459，筛选出gumf基因敲除的工程菌株xanthomonas campestrisδgumf-27。8.根据权利要求7所述的工艺，其特征在于，所述敲除质粒pk18mobsacb-δgumf的序列如seq id no.6所示。

技术总结
本发明属于微生物发酵生产黄原胶技术领域，公开了利用基因工程菌发酵生产高分子量黄原胶的工艺，其包括如下步骤：步骤1)菌株活化，步骤2)黄原胶发酵生产种子液制备，步骤3)黄原胶发酵生产，将成熟种子液接种到发酵培养液中，通过分阶段控制发酵条件，生产获得高分子量黄原胶产物。量黄原胶产物。量黄原胶产物。


技术研发人员：赵兰坤 王言东 伏广好 陈晓妮 李树标 徐淑科 周敬 许志颖
受保护的技术使用者：内蒙古阜丰生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/9/23