一种抑制B7-H3基因表达的干扰RNA及其应用的制作方法

一种抑制b7-h3基因表达的干扰rna及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，特别涉及一种抑制b7-h3表达的干扰rna，特别是sirna，及其应用。


背景技术：

2.t细胞介导的细胞免疫在抗癌过程中发挥着重要作用。t细胞的活化需要依赖两部分信号，第一个信号来自于t细胞受体tcr对抗原呈递细胞(antigen-presenting cells，apc)表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)的特异性识别，第二个信号来自于apc表面的共刺激分子(如b7家族成员)或其他分子。除了共刺激分子之外，apc表面还有起协同抑制作用的共抑制分子，可以抑制t细胞，防止其过度活化。共刺激分子和共抑制分子之间的平衡决定着t细胞的功能和耐受(nurieva r，embo j，2006；ni l,immunol rev,2017)，这些分子也称为免疫检查点(immune checkpionts)。免疫检查点不仅表达在apc的表面，同样也存在于肿瘤细胞表面。肿瘤细胞通过其表面的共抑制分子与t细胞表面相应的受体互作，抑制t细胞的免疫反应，从而实现免疫逃逸。
3.b7-h3(cd276，gene id:80381)是b7家族中的一员，位于人15号染色体，具有4个转录本。b7-h3是i型跨膜蛋白，定位于细胞膜上，存在4igb7-h3和2igb7-h3两个亚型。早期的研究发现，b7-h3是一种共刺激分子，可以诱导t细胞的免疫反应(chapoval ai,nat immunol,2001)；而随后越来越多的研究表明，b7-h3更多的是作为共抑制分子发挥作用，帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸。最近的研究表明，b7-h3可以促进肿瘤细胞(包括头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌等)的增殖、侵袭、转移等。此外，研究还表明b7-h3能够增强肿瘤细胞对放射性药物和化疗药物的耐药性(zhang w,int j oncol,2015；wang c,cell stem cell,2021)。b7-h3蛋白在多种肿瘤中均有表达，如胃癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、口腔癌、膀胱癌、乳腺癌等(ni l,immunol rev.2017；kontos f,clin cancer res,2021)，而在正常组织中限制性表达(yuan h,j urol,2011)，这使得通过抑制b7-h3的表达来治疗癌症成为可能。
4.专利cn100574803公开了一种用于治疗肿瘤性疾病的抗体疗法，使用免疫调节抗体，优选为抗b7抗体和抗cd20抗体，以引发人抗体效应机制，导致靶细胞的凋亡或死亡。专利cn113402619b公开了一种靶向b7-h3共表达il-21的全人源嵌合抗原受体、inkt细胞及其用途，所述嵌合抗原受体包含b7-h3抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号结构域以及il-21，经实验验证制备得到的靶向b7-h3的b7-h3.car/il-21-inkt细胞具有较强的细胞因子释放能力和肿瘤细胞杀伤能力，能够有效清除肿瘤细胞。
5.目前抑制免疫检查点的药物以抗体药为主，但抗体药的研发受限于蛋白分子的空间结构，这使得一些靶点“难以成药”。干扰rna(如sirna)是一段约20nt的短rna，也是risc沉默复合体(rna-induced silencing complex)的组成部分之一，干扰rna利用碱基互补配对原则帮助沉默复合体特异地靶向mrna，并诱导后者沉默或降解。相比抗体药的局限性，干扰rna理论上可以沉默任何基因。因此，本技术采用干扰rna沉默b7-h3。


技术实现要素：

6.本发明克服了现有技术中存在的缺陷，提供了一种干扰rna，其能够特异性靶向b7-h3的mrna并使其沉默，降低b7-h3的表达进而削减肿瘤细胞对t细胞的抑制作用，增强免疫反应，从而用于治疗实体瘤(例如头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌)。
7.本发明第一方面，提供了一种靶向b7-h3的干扰rna。
8.具体地，所述的干扰rna抑制b7-h3 mrna的表达。
9.具体地，上述干扰rna包含正义链和与其反向互补配对的反义链。
10.具体地，上述的正义链包含seq id no：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72和74中的任一个或两个以上所示的核苷酸序列；
11.具体地，上述的反义链包含seq id no：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、67、69、71、73和75中的任一个或两个以上所示的核苷酸序列。
12.具体地，上述干扰rna选自：sirna、dsrna、shrna、airna、mirna及其组合。
13.在本发明的一个实施方式中，上述干扰rna为sirna。具体为一段长度在19-23nt的双链rna，进入细胞后经过一系列酶的加工，与其他蛋白组成risc复合体，通过碱基互补配对的方式，特异性的靶向目的基因并使其沉默。
14.在本发明的一个实施方式中，上述干扰rna是化学合成的。
15.具体地，上述干扰rna的靶序列包含如seq id no：1-25任一个或两个以上(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个)所示的核苷酸序列。
16.具体地，上述干扰rna的靶序列由如seq id no：1-25任一个或两个以上(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个)所示的核苷酸序列组成。
17.具体地，所述干扰rna还包括悬挂碱基；优选的，所述的干扰rna包含1-10个悬挂碱基。
18.具体地，所述的悬挂碱基位于所述的干扰rna的正义链和/或反义链的3’末端。
19.在本发明的一个实施方式中，所述的悬挂碱基为脱氧核苷。
20.在本发明的一个实施方式中，所述的悬挂碱基为dtdt、dtdc或dudu。
21.在一些实施方案中，上述干扰rna还包括至少一个修饰，修饰的干扰rna具有比相应未修饰的干扰rna更佳的性质，如更高的稳定性，更低的免疫刺激性等。
22.具体地，所述的修饰包括在碱基、糖环和/或磷酸盐的化学结构上进行的修饰。
23.具体地，碱基的修饰包括但不限于5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰和/或5-溴尿嘧啶取代。
24.具体地，所述的糖环的修饰包括但不限于2'-oh被h、oz、z、halo、sh、sz、nh2、nhz、nz2或cn等基团取代，其中z为烷基基团。优选地，所述的修饰还包括具有肌苷、辫苷、黄嘌呤、2'-甲基核糖、非天然磷酸二酯键(如甲基膦酸酯、硫代膦酸酯)和/或肽的核苷酸。
25.在一些实施方案中，上述干扰rna分子为修饰的干扰rna，其包含如seq id no：80-91任一个或两个以上所示的核苷酸序列。
26.在一些实施方案中，上述修饰的干扰rna，其包含正义链和与其反向互补配对的反义链。
27.在一些实施方案中，上述修饰的干扰rna，其正义链包含如seq id no：80所示的核苷酸序列，其反义链包含如seq id no：81所示的核苷酸序列。
28.在一些实施方案中，上述修饰的干扰rna，其正义链包含如seq id no：82所示的核苷酸序列，其反义链包含如seq id no：83所示的核苷酸序列。
29.在一些实施方案中，上述修饰的干扰rna，其正义链包含如seq id no：84所示的核苷酸序列，其反义链包含如seq id no：85所示的核苷酸序列。
30.在一些实施方案中，上述修饰的干扰rna，其正义链包含如seq id no：86所示的核苷酸序列，其反义链包含如seq id no：87所示的核苷酸序列。
31.在一些实施方案中，上述修饰的干扰rna，其正义链包含如seq id no：88所示的核苷酸序列，其反义链包含如seq id no：89所示的核苷酸序列。
32.在一些实施方案中，上述修饰的干扰rna，其正义链包含如seq id no：90所示的核苷酸序列，其反义链包含如seq id no：91所示的核苷酸序列。
33.本发明第二方面，提供一种递送系统，所述的递送系统包含第一方面所述的干扰rna和载体。
34.具体地，所述的载体为病毒载体或非病毒载体。
35.具体地，所述病毒载体包括：慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体或疱疹病毒载体中一种或两种及以上的组合。具体地，所述非病毒载体包括：脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、多肽、抗体、适配体中任一种或两种及以上的组合。
36.具体地，所述脂质纳米颗粒/脂质体包括：阳离子脂质、中性脂质、聚乙二醇脂质、磷脂、固醇、阴离子脂质中的一种或两种以上组合。
37.具体地，所述阳离子脂质包括：十八酰胺(sa)、溴化月桂基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、溴化肉豆蔻基三甲基铵、溴化二甲基二-十八铵(ddab)、((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6，1-二基)双(2-己基癸酸酯)(alc-0315)、1,2-二油酰基氧基-3-(三甲基铵基)丙烷(dotap)、1,2-二-(9z-十八烯酰基)-3-三甲基铵-丙烷和1,2-二-十六酰基-3-三甲基铵-丙烷、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(dc胆固醇)、二甲基二十八烷基铵(dda)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、二棕榈酰(c16:0)三甲基铵丙烷(dptap)、二硬脂酰基三甲基铵丙烷(dstap)、n-[1-(2,3-二烯丙氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n,n-二油酰基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-3-乙基磷酸胆碱(doepc)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(dodap)、1,2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二-十四酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-十六酰基-3-二甲基铵-丙烷和1,2-二-十八酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基铵)-丁酰基-sn-甘油(dotb)、二-十八酰胺-丙氨酰基精胺、saint-2、聚阳离子脂质2,3-二油酰基氧基-n-[2(精胺-羧酰氨基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(dospa)、
[0038]
[0039][0040]
等中的一种或两种以上的组合。
[0041]
具体地，所述中性脂质包括：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dmpe)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(dopg)、油酰磷脂酰胆碱(popc)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、胆固醇等中的一种或两种以上的组合。
[0042]
具体地，所述聚乙二醇脂质包括：2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-二十四烷基乙酰胺(alc-0159)1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(peg-dmg)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](peg-dspe)、peg-二甾醇基甘油(peg-dsg)、peg-二棕榈油基、peg-二油基、peg-二硬脂基、peg-二酰基甘油酰胺(peg-dag)、peg-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(peg-dppe)或peg-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(peg-c-dma)、
[0043]
[0044][0045]
等中的一种或两种以上的组合；
[0046]
其中，n选自20-300的整数。
[0047]
具体地，所述聚乙二醇脂质为单一分子量的聚乙二醇脂质，优选的，所述的聚乙二醇脂质包括：
[0048][0049]
具体地，所述阳离子脂质为类固醇-阳离子脂质化合物：
[0050]
所述化合物的结构为：所述化合物的结构为：
[0051]
[0052]
[0053]
[0054][0055]
具体地，所述阴离子脂质体包括：二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰乙醇胺等中的一种或两种以上的组合。
[0056]
具体地，所述的固醇包括：燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇、羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸中的一种或两种以上的组合。
[0057]
具体地，上述载体可以采用任何适于将本发明上述干扰rna递送于靶组织或靶细胞等的载体，如现有技术(例如陈中华，朱德生，李军，黄展勤.“非病毒sirna载体研究进展”.中国药理学通报.2015，31(7)：910-4；王锐，曲炳楠，杨婧.“载sirna的纳米制剂研究进展”.中国药房.2017，28(31)：4452-4455)中公开的那些。
[0058]
本发明第三方面，提供一种b7-h3表达降低的细胞的制备方法，所述的制备方法包括将第一方面所述的干扰rna或第二方面所述的递送系统导入到细胞中。
[0059]
具体地，上述细胞为免疫细胞或肿瘤细胞，所述的免疫细胞优选为淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞，进一步优选为t细胞，所述的肿瘤细胞优选为头颈癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、白血病细胞、宫颈癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、口腔癌细胞、卵巢癌细胞、骨肉瘤细胞、脑瘤细胞或胶质细胞瘤细胞。
[0060]
本发明第四方面，提供一种细胞，所述的细胞中包含第一方面所述的干扰rna或第二方面所述的递送系统。
[0061]
具体地，上述细胞为免疫细胞或肿瘤细胞，所述的免疫细胞优选为淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞，进一步优选为t细胞，所述的肿瘤细胞优选为头颈癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、白血病细胞、宫颈癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、口腔癌细胞、卵巢癌细胞、骨肉瘤细胞、脑瘤细胞或胶质细胞瘤细胞。
[0062]
本发明第五方面，提供一种药物组合物，其包括第四方面所述的细胞，第一方面所述的干扰rna或第二方面所述的递送系统，以及药学上可接受的辅料。
[0063]
本发明第六方面，提供一种第四方面所述的细胞，第一方面所述的干扰rna或第二方面所述的递送系统在制备预防和/或治疗b7-h3相关的疾病的药物中的应用。
[0064]
具体地，上述疾病包括，但不限于，癌症、炎症、血液系统恶性疾病等，特别是，癌症。
[0065]
具体地，上述癌症包括，但不限于，头颈癌(头颈部鳞状细胞癌)、前列腺癌、肺癌(如非小细胞肺癌)、肝癌、食管癌、白血病(髓系白血病)、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、口腔癌(口腔上皮癌)、卵巢癌、骨肉瘤、脑瘤、胶质细胞瘤等。
[0066]
具体地，上述炎症包括，但不限于，类风湿关节炎、脑膜炎(细菌性脑膜炎)、胰腺炎(急性胰腺炎)、肺炎、前列腺炎。
[0067]
本发明第七方面，提供一种第四方面所述的细胞，第一方面所述的干扰rna或第二方面所述的递送系统在设计用于预防和/或治疗b7-h3相关的疾病的药物中的应用。
[0068]
具体地，上述疾病包括，但不限于，癌症、炎症、血液系统恶性疾病等，特别是，癌症。
[0069]
具体地，上述癌症包括，但不限于，头颈癌(头颈部鳞状细胞癌)、前列腺癌、肺癌(如非小细胞肺癌)、肝癌、食管癌、白血病(髓系白血病)、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、口腔癌(口腔上皮癌)、卵巢癌、骨肉瘤、脑瘤、胶质细胞瘤等。
[0070]
具体地，上述炎症包括，但不限于，类风湿关节炎、脑膜炎(细菌性脑膜炎)、胰腺炎(急性胰腺炎)、肺炎、前列腺炎。
[0071]
本发明第八方面，提供一种第四方面所述的细胞，第一方面所述的干扰rna、第二方面所述的递送系统或第五方面所述的药物组合物在抑制活细胞中b7-h3基因表达的应用。
[0072]
本发明第九方面，提供一种在需要其的受试者中抑制b7-h3基因表达的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的本发明上述干扰rna和/或包含上述干扰rna的载体和/或b7-h3表达降低的细胞和/或本发明所述药物组合物的步骤。
[0073]
本发明第十方面，提供一种预防和/或治疗b7-h3相关的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明上述干扰rna和/或包含上述干扰rna的载体和/或b7-h3表达降低的细胞和/或本发明所述药物组合物的步骤。
[0074]
具体地，上述疾病包括，但不限于，癌症、炎症、血液系统恶性疾病等，特别是，癌症。
[0075]
具体地，上述癌症包括，但不限于，头颈癌(头颈部鳞状细胞癌)、前列腺癌、肺癌(如非小细胞肺癌)、肝癌、食管癌、白血病(髓系白血病)、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、口腔癌(口腔上皮癌)、卵巢癌、骨肉瘤、脑瘤、胶质细胞瘤等。
[0076]
具体地，上述炎症包括，但不限于，类风湿关节炎、脑膜炎(细菌性脑膜炎)、胰腺炎(急性胰腺炎)、肺炎、前列腺炎。
[0077]
本发明第十一方面，提供一种药物或试剂盒，所述的药物或试剂盒包含第一方面所述的干扰rna、第二方面所述的递送系统或第四方面所述的细胞。
[0078]
本发明第十二方面，提供一种抗体-核酸偶联药物，所述的抗体-核酸偶联药物中包含第一方面所述的干扰rna或第二方面所述的递送系统。
[0079]
具体地，所述的抗体-核酸偶联药物的通式(i)为：
[0080][0081]
其中，r为权利要求1-8任一所述的干扰rna；
[0082]
x1为1-144的整数；优选的，x1为1-9的整数；更优选的，x1为1-3的整数；
[0083]
x2为1-8的整数；优选的，x2为1-2的整数；
[0084]
ab为抗体、蛋白质、多肽或寡核苷酸；
[0085]
l为连接ab与r之间的连接单元。
[0086]
具体地，所述的ab选自单克隆抗体、多克隆抗体；优选的，ab为单克隆抗体；
[0087]
具体地，所述ab选自：抗her2抗体、抗egfr抗体、抗pmsa抗体、抗vegfr抗体、抗cd30抗体、抗cd22抗体、抗cd56抗体、抗cd29抗体、抗gpnmb抗体、抗cd138抗体、抗cd74抗体、抗enpp3抗体、抗nectin-4抗体、抗egfrviii抗体、抗slc44a4抗体、抗间皮素抗体、抗et8r抗体、抗cd37抗体、抗ceacam5抗体、抗cd70抗体、抗muc16抗体、抗cd79b抗体、抗muc16抗体、抗muc1抗体。
[0088]
在本发明的一些实施方式中，所述的抗体-核酸偶联药物具有如下结构：
[0089][0090]
所述n1、n2独立的选自4-100的整数，优选为4-24。
[0091]
本技术的发明人通过设计、合成，得到一种干扰rna(例如，sirna)，其可有效抑制b7-h3基因表达，为预防或治疗b7-h3相关疾病(特别是b7-h3相关的癌症)提供了新的选择。
[0092]
术语“干扰rna”，包括单链rna(例如，成熟mirna、ssrna寡核苷酸、ssdna寡核苷酸)或双链rna(例如，sirna、dsrna、shrna、airna、或前体mirna)，当干扰rna与靶基因或序列处于同一细胞中时，能够降低或抑制靶基因或序列的表达(例如，通过介导降解和/或抑制与干扰rna序列互补的mrna的翻译)。
[0093]
其中，sirna为小干扰rna，其分子的每条链包含长度为约15至约60的核苷酸(例如，长度为约15-60、15-50、15-40、15-30、15-25、或19-25的核苷酸，或者长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25的核苷酸)。在一个具体实施方式中，sirna可以是化学合成的。本发明的sirna分子能够在体外和/或体内沉默靶序列的表达。在一些实施方式中，sirna可以不含有修饰的核苷酸；在其他实施方式中，sirna包含至少一个修饰的核苷酸，例如sirna在双链区中包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个修饰的核苷酸。dsrna或前体rna分子包括在体内由核酸内切酶加工以产生活性sirna的任何前体分子。shrna为小发夹rna或短发夹rna，包括产生紧密发夹转角(hairpin turn)的短rna序列，所述发夹转角可以用于通过rna干扰来沉默基因表达，shrna发夹结构可由细胞
机器裂解为sirna。mirna(微rna)是长度约21-23个核苷酸的调节基因表达的单链rna分子。
[0094]
术语“抑制靶基因的表达”是指本发明的干扰rna(例如，sirna)沉默、降低、或抑制靶基因(例如，b7-h3基因)表达的能力。
[0095]
术语“治疗有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学应答的对象化合物的量。术语“治疗有效量”包括以下的活性成分的量：当被施用时，其足以预防治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗有效量将根据活性成分、待治疗的疾病及其严重程度、以及受试者的年龄、体重、性别等而变化。
[0096]
术语“受试者”可以为哺乳动物，如，人类、猴、狗、兔、小鼠、大鼠等；在本发明的一个实施例中，上述受试者为人类。
[0097]
术语“包含”或“包括”为开放式写法，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。例如，本技术中的seq id no：1、2、3为sirna靶向b7-h3的靶位点序列，由于sirna长度可以为15-60nt，优选19-23nt，因此，将seq id no：1、2、3的两端或一端减少几nt的核苷酸，或者按照靶位点序列在seq id no：1、2、3的两端或一段加上几nt或几十nt的核苷酸，只要具有沉默b7-h3活性即在本技术的保护范围内。因此，本领域技术人员熟知，对于靶序列的选择主要在于位置，不只在于实际的长度。
附图说明
[0098]
图1所示为靶序列由如seq id no：1所示的核苷酸序列组成的sirna的正义链(上图)和反义链(下图)的质谱图。
[0099]
图2所示为靶序列由如seq id no：2所示的核苷酸序列组成的sirna的正义链(上图)和反义链(下图)的质谱图。
[0100]
图3所示为靶序列由如seq id no：3所示的核苷酸序列组成的sirna的正义链(上图)和反义链(下图)的质谱图。
[0101]
图4所示为sirna-1、sirna-2、sirna-3在293t细胞中对b7-h3基因的抑制作用，其中，blank为空白对照，是等体积opti-mem培养基；mock为无sirna的转染试剂对照；sinc-1为阴性对照，购买自广州市锐博生物科技有限公司，货号为sin0000001-1-5。
[0102]
图5所示为sirna-1至sirna-25在a375细胞中对b7-h3基因的抑制作用，其中，blank为空白对照，是等体积opti-mem培养基；mock为无sirna的转染试剂对照；sinc-1和sinc-2为阴性对照，sinc-1购买自广州市锐博生物科技有限公司，sinc-2购买自北京擎科生物科技有限公司。
[0103]
图6所示为sirna-4的正义链质谱图。
[0104]
图7所示为sirna-4的反义链质谱图。
[0105]
图8所示为sirna-5的正义链质谱图。
[0106]
图9所示为sirna-5的反义链质谱图。
[0107]
图10所示为sirna-6的正义链质谱图。
[0108]
图11所示为sirna-6的反义链质谱图。
[0109]
图12所示为sirna-7的正义链质谱图。
[0110]
图13所示为sirna-7的反义链质谱图。
[0111]
图14所示为sirna-8的正义链质谱图。
[0112]
图15所示为sirna-8的反义链质谱图。
[0113]
图16所示为sirna-9的正义链质谱图。
[0114]
图17所示为sirna-9的反义链质谱图。
[0115]
图18所示为sirna-10的正义链质谱图。
[0116]
图19所示为sirna-10的反义链质谱图。
[0117]
图20所示为sirna-11的正义链质谱图。
[0118]
图21所示为sirna-11的反义链质谱图。
[0119]
图22所示为sirna-12的正义链质谱图。
[0120]
图23所示为sirna-12的反义链质谱图。
[0121]
图24所示为sirna-13的正义链质谱图。
[0122]
图25所示为sirna-13的反义链质谱图。
[0123]
图26所示为不同种类的sib7-h3对b7-h3表达的抑制效果。
[0124]
图27所示为lnp-sib7-h3-m4的有效粒径。
[0125]
图28所示为lnp-sib7-h3在pc-或rm-1中抑制b7-h3基因表达的柱状图。
[0126]
图29所示为不同剂量的lnp-sib7-h3-m4组对肿瘤生长的抑制率。
具体实施方式
[0127]
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
[0128]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0129]
在本技术中为了检验基因沉默的程度，使测试样品(例如，来自表达靶基因的目标生物体的生物样品或在培养物中的表达靶基因的细胞的样品)与沉默、降低、或抑制靶基因的表达的干扰rna(例如，sirna)接触，将测试样品中靶基因的表达与未与干扰rna(例如，sirna)接触的样品中靶基因的表达进行对比，可以将对照样品(例如，表达靶基因的样品)设定为100％的值。在具体的实施方式中，当测试样品相对于对照样品的值为约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、10％、5％、或0％时，实现靶基因的表达的沉默、抑制或降低。适合的测定包括但不限于，利用本领域技术人员已知的技术检验蛋白质或mrna水平，诸如，例如点印迹、northern印迹、real-time rt-pcr、原位杂交、elisa、免疫沉淀、酶功能、以及本领域技术人员已知的表型测定。
[0130]
b7-h3 sirna(编号1-3)由广州市锐博生物科技有限公司合成，b7-h3 sirna(编号4-25)由北京擎科生物科技有限公司合成，靶序列及位置如表1，sirna序列如表2。
[0131]
表1.b7-h3靶序列
[0132]
编号位置靶序列seq id no：1720caacgagcagggcttgtttseq id no：121551gtctgtctgtctcattgcaseq id no：231595gctggagaaagatcaaacaseq id no：34987gcagctgacagacaccaaaseq id no：451011ggtgcacagtttcaccgaaseq id no：561875agaccactgtgcagccttaseq id no：672645agatgtcagcactgtgttaseq id no：781585gctttcgtgtgctggagaaseq id no：891710agaagatgatggacaagaaseq id no：9101713agatgatggacaagaaataseq id no：10111901caatggacatgattcccaaseq id no：11121905ggacatgattcccaagtcaseq id no：12131971ccttagttctctaagtcatseq id no：13142109gatgcaatattcagactgaseq id no：14152314ccttcctcctcttgctctaseq id no：15162615ccattcagttgatgtttatseq id no：16172622gttgatgtttattgagcaaseq id no：17182625gatgtttattgagcaactaseq id no：18192688gataaagttcctccctcaaseq id no：19202721gctgggagacagacaactaseq id no：20212725ggagacagacaactaactaseq id no：21222727agacagacaactaactacaseq id no：22232806gctcaaggcttcctggataseq id no：23243139ggtagagtgagacttcagaseq id no：24253209gtgaggacttctaatttaaseq id no：25
[0133]
表2.b7-h3sirna序列
[0134]
[0135]
[0136][0137]
靶序列由如seq id no：1、seq id no：2、或seq id no：3所示的核苷酸序列组成的sirna的正义链和反义链的质谱图分别如图1-3所示，其分子量分别为13441.41、13482.5、13355.28。图6-25分别为sirna-4至13的正义链和反义链质谱图。
[0138]
实施例1：sirna在293t细胞中的抑制效果
[0139]
1、将靶向seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3所示序列的sirna分别转染入293t细胞中，其正义链和反义链见表2。
[0140]
1)第一天铺板，将293t细胞于12孔板，2
×
105个细胞/孔，1ml含10％fbs(胎牛血清)的无抗生素培养基，37℃、5％co2过夜培养待细胞贴壁；
[0141]
2)取50μl opti-mem培养基稀释sirna，浓度为100nm(阴性对照组为同浓度的sinc-1，购买自广州市锐博生物科技有限公司，货号为sin0000001-1-5)；另取50μl opti-mem培养基稀释3μl lipofectamine
tm 3000转染试剂；将二者混匀，室温静置15min；
[0142]
3)每孔先加入900μl培养基，然后加入上述100μl混合液，最终转染体系为1ml；
[0143]
4)培养48小时后，收集细胞，用于提取rna进行后续检测。
[0144]
2、rna提取
[0145]
1)trizol裂解：将已加入trizol溶液的样本室温孵育5min；
[0146]
2)加入0.2倍体积(0.2ml/1mltrizol)的氯仿，涡旋震荡15s，室温静置5min；
[0147]
3)4℃，12000rpm离心15min，出现分层，小心吸取上层水相到新的1.5ml离心管中；
[0148]
4)加入与上清液等体积的异丙醇(约0.6ml)，上下颠倒混匀，-20℃沉淀1h以上；
[0149]
5)4℃，12000rpm离心30min，管底可见白色沉淀，去掉上清液；
[0150]
6)加入1ml 75％的乙醇，轻弹管壁使沉淀飘浮，4℃，12000rpm离心5min，重复一
次；
[0151]
7)去掉上清液后短暂离心，吸干剩余液体，将离心管盖打开干燥，待沉淀干燥至半透明状后加入适量rnase-free h2o溶解。
[0152]
3、q-pcr检测
[0153]
1)使用紫外分光光度计检测rna的质量和浓度，按表3体系反转录1μgrna：
[0154]
表3反应体系
[0155][0156]
rt primer类型：(a)oligo-dt(b)random primer(c)gene/mirna specific primer。将以上体系混匀，离心收集液体至管底。设置反应程序：42℃60min，72℃10min；产物即为cdna模板，稀释5倍后进行后续测试。
[0157]
2)按照表4配置q-pcr体系，检测b7-h3基因的水平：
[0158]
表4反应体系
[0159][0160]
以gapdh为内参，检测基因表达水平，所用引物序列如下：
[0161]
gapdh-f：tctgacttcaacagcgacac(seq id no：76)
[0162]
gapdh-r：gccaaattcgttgtcatacc(seq id no：77)
[0163]
b7-h3-f：gtgtgctggagaaagatcaaac(seq id no：78)
[0164]
b7-h3-r：tggtcaggctatttcttgtcc(seq id no：79)
[0165]
图4的结果表明，在转染sirna培养48小时后的293t细胞中，与mock和sinc-1相比，三个靶向b7-h3的sirna均可以抑制b7-h3的表达。其中sirna-1(抑制了65.7％)和sirna-3(抑制了71.0％)的抑制效果优于sirna-2(抑制了37.3％)。
[0166]
实施例2：sirna在a375细胞中的抑制效果
[0167]
1、将靶向seq id no：1-25所示序列的sirna分别转染入a375细胞中，其正义链和反义链见表2。
[0168]
1)第一天铺板，将a375细胞于24孔板，8
×
104个细胞/孔，500μl含10％fbs和1％penicillin-streptomycin的dmem培养基，37℃、5％co2培养24小时待细胞贴壁；第二天转染前更换为450μl不含抗生素的培养基；
[0169]
2)取100μl opti-mem培养基稀释sirna，阴性对照组为同浓度的sinc-1(购买自广州市锐博生物科技有限公司)和sinc-2(购买自北京擎科生物科技有限公司)。另取100μl opti-mem培养基稀释lipofectamine
tm
rnaimax转染试剂；将二者混匀，室温静置5min；
[0170]
3)每孔加入上述混合液50μl，最终转染体系为500μl，sirna终浓度为50nm；
[0171]
4)培养48小时后，收集细胞，用于提取rna进行后续检测。
[0172]
2、rna提取
[0173]
1)加入300μl eastep
tm super总rna提取试剂盒中的rna裂解液和300μl rna稀释液，混匀后转移至新的1.5ml离心管中；
[0174]
2)14000g离心5min，小心吸取上清到新的1.5ml离心管中；
[0175]
3)加入0.5倍体积的无水乙醇，反复颠倒混匀10-20次后转移至离心柱中，12000-14000g离心1min，弃滤液；
[0176]
4)加入600μl rna洗液，12000-14000g离心1min，弃滤液；
[0177]
5)加入50μl dna酶i孵育液孵育15min；
[0178]
6)加入600μl rna洗液，12000-14000g离心1min，弃滤液，重复1次；将离心柱安置回收集管中，12000-14000g离心2min后将离心柱将置于收集管中；
[0179]
7)加入适量rnase-free h2o，静置10min，12000-14000g离心1min收集rna，-70℃保存。
[0180]
3、q-pcr检测流程
[0181]
1)使用nanodrop
tm
检测rna的质量和浓度，配置rnatemplate：取1μg rna，加rnase-free h2o至体积为10μl；70℃5min，冰浴5min备用；
[0182]
2)按照表5建立反应体系：
[0183]
表5反应体系
[0184][0185]
3)将以上反应体系混匀，离心收集液体至管底，25℃5min，42℃60min，72℃15min，产物即为cdna；
[0186]
4)按照表6配置q-pcr体系，检测b7-h3基因的水平，所用引物与实施例1相同：
[0187]
表6反应体系
[0188][0189]
图5的结果表明，在转染sirna培养48小时后的a375细胞中，与mock和sinc相比，靶向b7-h3的sirna均可以抑制b7-h3的表达。其中sirna-3(抑制了94.6％)、sirna-4(抑制了95.0％)、sirna-5(抑制了92.7％)、sirna-6(抑制了94.9％)、sirna-17(抑制了94.0％)和sirna-18(抑制了93.4％)的抑制效果较好。
[0190]
实施例3：sib7-h3修饰序列抑制基因的表达
[0191]
1、对sirna-4序列进行化学修饰，修饰方法如下表：
[0192]
[0193][0194]
其中，m为甲基修饰(2
′‑
o-methyl)；f为氟代修饰(2
′‑
deoxy-2
′‑
fluoro)；-为硫代磷酸化修饰(phosphorothioate)；ψ为假尿嘧啶修饰(pseudouridine)。
[0195]
2、将修饰序列转染入人前列腺癌细胞pc-3中
[0196]
1)第一天铺板，将pc-3细胞按1.5
×
105个细胞/孔铺板于24孔板，含10％fbs和1％penicillin-streptomycin的f12k培养基500μl，37℃、5％co2培养24小时待细胞贴壁；第二天转染前更换为450μl不含抗生素的培养基。
[0197]
2)取100μl opti-mem培养基稀释修饰过的sirna，阳性对照为同浓度的sirna-4，阴性对照为同浓度的sinc；另取100μl opti-mem培养基稀释lipofectamine
tm
rnaimax转染试剂；将二者混匀，室温静置5min。
[0198]
3)每孔加入上述混合液50μl，最终转染体系为500μl，sirna终浓度为50nm。
[0199]
4)培养48小时后，收集细胞，提取rna进行后续检测。
[0200]
3、检测b7-h3的表达水平
[0201]
按照实施例2中的方法，提取细胞总rna，并用qpcr的方法检测b7-h3的表达水平。图26的表明，在转染48小时后的pc-3细胞中，与mock和sinc相比，六种修饰的sib7-h3均可以抑制b7-h3的表达。其中sib7-h3-m4抑制效果最好(抑制了97.3％)，其次是sib7-h3-m6(抑制了47.9％)、sib7-h3-m2(抑制了44.5％)、sib7-h3-m3(抑制了43.6％)、sib7-h3-m5
(抑制了33.1％)和sib7-h3-m1(抑制了32.5％)。
[0202]
实施例4：lnp-sib7-h3的制备
[0203]
1)配制各组分母液：
[0204]
称取sm-102(jenkem)213.06mg，加入无水etoh 10ml，溶解得sm-102母液；称取m-dmg-2000(jenkem)748.5mg，加入无水etoh 10ml，溶解得peg母液；称取dspc(sigma)237.06mg，加入无水etoh 10ml，溶解得dspc母液；称取胆固醇(sigma)115.98mg，加入无水etoh 10ml，溶解得胆固醇母液。
[0205]
2)分别取sm-102母液2160μl、peg母液64.8μl、dspc母液432μl、胆固醇母液1664μl，混合均匀得lnp/etoh溶液；取sib7-h3-m4450nmol，加入50mm柠檬酸缓冲液(ph＝4.0)6.5ml，得sib7-h3-m4/buffer溶液；
[0206]
3)微流控制备：lnp/etoh溶液使用通路1，溶液体积2ml，流速5ml/min；sib7-h3-m4/buffer溶液使用通路2，溶液体积6ml，流速15ml/min；取微流控制备溶液4ml，使用pbs(ph＝7.4)透析16h，得到lnp-sib7-h3-m4，sib7h3终浓度0.45mg/ml。使用nanobrook 90plus pals粒度仪检测lnp-sib7-h3-m4的有效粒径为98.26nm，多分散系数0.033(图27)。
[0207]
实施例5：lnp-sib7-h3抑制基因的表达
[0208]
1)转染前一天，将人前列腺癌细胞pc-3按照1.5
×
105个细胞/孔铺于24孔板中，含10％fbs和1％penicillin-streptomycin的f12k培养基500μl。将小鼠前列腺癌细胞rm-1按照5
×
104个细胞/孔铺于24孔板中，含10％fbs和1％penicillin-streptomycin的rpmi 1640培养基500μl。细胞培养板置于37℃、5％co2培养箱中24小时待细胞贴壁。每组设置3复孔。
[0209]
2)转染当天更换为450μl不含抗生素的培养基。
[0210]
3)取适量opti-mem培养基稀释lnp-sib7-h3-m4，对照组为同浓度不含sirna的lnp及没有递送系统的sib7-h3-m4。
[0211]
4)每孔加入上述溶液50μl，最终转染体系为500μl，sirna的工作浓度为50nm。
[0212]
5)转染后培养48小时后，收集细胞。
[0213]
6)按照实施例2中的方法提取细胞总rna并检测b7-h3 mrna的水平。
[0214]
图28的结果表明，实施例4制备的lnp-sib7-h3-m4可以抑制人前列腺癌细胞pc-3和小鼠前列腺癌细胞rm-1中b7-h3的表达。
[0215]
实施例6：lnp-sib7h3抑制小鼠肿瘤生长
[0216]
选取6-8周c57bl/6雄性小鼠，在温度20-26℃、湿度40-70％的环境中饲养，使用辐照灭菌的常规饲料喂养。将处于对数生长期的小鼠前列腺癌细胞rm-1接种于小鼠右侧胁肋部皮下，在肿瘤生长至平均体积为100mm3左右时分组，每组6只，共分为6组：vehicle组(溶媒组)、静脉注射lnp-mock组、静脉注射lnp-sib7-h3-m4低剂量组(0.1mg/kg,iv)、lnp-sib7-h3-m4中剂量组(0.3mg/kg,iv)、lnp-sib7-h3-m4高剂量组(1mg/kg,iv)和瘤内注射lnp-sib7-h3中剂量组(0.3mg/kg,it)，单次给药后测量肿瘤体积的大小。实验结果显示，lnp-sib7-h3-m4组对肿瘤的生长有一定的抑制作用，且抑制作用呈现计量依赖，给药后第4天高剂量组的肿瘤抑制率达到40％(图29)。
[0217]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0218]
本文描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
[0219]
本发明中，仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。

技术特征：
1.一种靶向b7-h3的干扰rna，其靶序列包含如seq id no：1-25任一个或两个以上所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的干扰rna，其特征在于，所述干扰rna选自：sirna、dsrna、shrna、airna、mirna及其组合。3.根据权利要求1或2所述的干扰rna，其特征在于，所述干扰rna还包括悬挂碱基；优选的，所述的干扰rna包含1-10个悬挂碱基。4.根据权利要求3所述的干扰rna，其特征在于，所述的悬挂碱基位于所述的干扰rna的正义链和/或反义链的3’末端。5.根据权利要求3或4所述的干扰rna，其特征在于，所述的悬挂碱基为脱氧核苷；优选的，所述的悬挂碱基为dtdt、dtdc或dudu。6.根据权利要求1-5任一所述的干扰rna，所述的干扰rna包含正义链和/或反义链；优选的，所述的正义链包含seq id no：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72和74中的任一个或两个以上所示的核苷酸序列；优选的，所述的反义链包含seq id no：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、67、69、71、73和75中的任一个或两个以上所示的核苷酸序列。7.根据权利要求1-6任一所述的干扰rna，其特征在于，所述干扰rna还包括至少一个修饰；所述的修饰包括在碱基、糖环和/或磷酸盐的化学结构上进行的修饰；优选的，碱基的修饰包括但不限于5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰和/或5-溴尿嘧啶取代；优选的，所述的糖环的修饰包括但不限于2'-oh被h、oz、z、halo、sh、sz、nh2、nhz、nz2或cn等基团取代，其中z为烷基基团。8.根据权利要求7所述的干扰rna，其特征在于，所述的修饰还包括具有肌苷、辫苷、黄嘌呤、2'-甲基核糖、非天然磷酸二酯键和/或肽的核苷酸。9.一种包含权利要求1-8任一所述的干扰rna的递送系统，其特征在于，所述的递送系统包含权利要求1-8任一所述的干扰rna和载体。10.根据权利要求9所述的递送系统，其特征在于，所述的载体为病毒载体或非病毒载体；优选的，所述病毒载体包括：慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体或疱疹病毒载体中一种或两种及以上的组合；优选的，所述非病毒载体包括：脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、多肽、抗体、适配体中任一种或两种及以上的组合。11.根据权利要求10所述的递送系统，其特征在于，所述脂质纳米颗粒/脂质体包括：阳离子脂质、中性脂质、聚乙二醇脂质、磷脂、固醇、阴离子脂质中的一种或两种以上组合。12.根据权利要求11所述的递送系统，其特征在于，所述阳离子脂质包括：十八酰胺(sa)、溴化月桂基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、溴化肉豆蔻基三甲基铵、溴化二甲基二-十八铵(ddab)、((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6，1-二基)双(2-己基癸酸酯)(alc-0315)、1,2-二油酰基氧基-3-(三甲基铵基)丙烷(dotap)、1,2-二-(9z-十八烯酰基)-3-三甲基铵-丙烷和1,2-二-十六酰基-3-三甲基铵-丙烷、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(dc胆固醇)、二甲基二十八烷基铵(dda)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、二棕榈酰(c16:0)三甲基铵丙烷(dptap)、二硬脂酰基三甲基铵丙烷
(dstap)、n-[1-(2,3-二烯丙氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n,n-二油酰基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-3-乙基磷酸胆碱(doepc)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(dodap)、1,2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二-十四酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-十六酰基-3-二甲基铵-丙烷和1,2-二-十八酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基铵)-丁酰基-sn-甘油(dotb)、二-十八酰胺-丙氨酰基精胺、saint-2、聚阳离子脂质2,3-二油酰基氧基-n-[2(精胺-羧酰氨基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(dospa)、(sm-102)、102)、等中的一种或两种以上的组合。13.根据权利要求11所述的递送系统，其特征在于，所述中性脂质包括：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dmpe)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(dopg)、油酰磷脂酰胆碱(popc)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、胆固醇等中的一种或两种以上的组合。14.根据权利要求11所述的递送系统，其特征在于，所述聚乙二醇脂质包括：2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-二十四烷基乙酰胺(alc-0159)1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(peg-dmg)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](peg-dspe)、peg-二甾醇基甘油(peg-dsg)、peg-二棕榈油基、peg-二油基、peg-二硬脂基、peg-二酰基甘油酰胺(peg-dag)、peg-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(peg-dppe)或peg-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(peg-c-dma)、
等中的一种或两种以上的组合；其中，n选自20-300的整数。15.根据权利要求11所述的递送系统，其特征在于，所述聚乙二醇脂质为单一分子量的聚乙二醇脂质，优选的，所述的聚乙二醇脂质包括：16.根据权利要求11所述的递送系统，其特征在于，所述阳离子脂质为类固醇-阳离子脂质化合物：所述化合物的结构为：
17.根据权利要求11所述的递送系统，其特征在于，所述阴离子脂质体包括：二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰乙醇胺等中的一种或两种以上的组合。18.根据权利要求11所述的递送系统，其特征在于，所述的固醇包括：燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇、羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸中的一种或两种以上的组合。19.一种细胞，其特征在于，所述的细胞中包含权利要求1-8任一所述的干扰rna或权利要求9-18任一所述的递送系统。20.一种细胞的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将权利要求1-8任一所述的干扰rna或权利要求9-18任一所述的递送系统导入到细胞中。21.一种药物或试剂盒，其特征在于，所述的药物或试剂盒包含权利要求1-8任一所述的干扰rna、权利要求9-18任一所述的递送系统或权利要求19所述的细胞。22.一种抗体-核酸偶联药物，其特征在于，所述的抗体-核酸偶联药物中包含权利要求1-8任一所述的干扰rna或权利要求9-18任一所述的递送系统。23.根据权利要求22所述的抗体-核酸偶联药物，其特征在于，所述的抗体-核酸偶联药物的通式(i)为：其中，r为权利要求1-8任一所述的干扰rna；x1为1-144的整数；优选的，x1为1-9的整数；更优选的，x1为1-3的整数；x2为1-8的整数；优选的，x2为1-2的整数；ab为抗体、蛋白质、多肽或寡核苷酸；l为连接ab与r之间的连接单元。24.根据权利要求22所述的抗体-核酸偶联药物，其特征在于，所述的ab选自单克隆抗体、多克隆抗体；优选的，ab为单克隆抗体；
更优选的，所述ab选自：抗her2抗体、抗egfr抗体、抗pmsa抗体、抗vegfr抗体、抗cd30抗体、抗cd22抗体、抗cd56抗体、抗cd29抗体、抗gpnmb抗体、抗cd138抗体、抗cd74抗体、抗enpp3抗体、抗nectin-4抗体、抗egfr
ⅷ
抗体、抗slc44a4抗体、抗间皮素抗体、抗et8r抗体、抗cd37抗体、抗ceacam5抗体、抗cd70抗体、抗muc16抗体、抗cd79b抗体、抗muc16抗体、抗muc1抗体。25.根据权利要求23或24所述的抗体-核酸偶联药物，其特征在于，其具有如下结构：所述n1、n2独立的选自4-100的整数，优选为4-24。26.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含包含权利要求1-8任一所述的干扰rna、权利要求9-18任一所述的递送系统或权利要求19所述的细胞，以及药学上可接受的辅料。27.一种权利要求1-8任一所述的干扰rna、权利要求9-18任一所述的递送系统或权利要求19所述的细胞在制备预防和/或治疗b7-h3相关疾病的药物中的应用。28.根据权利要求1所述的干扰rna，其特征在于，所述干扰rna为修饰的干扰rna，其包含如seq id no：80-91任一个或两个以上所示的核苷酸序列。

技术总结
本发明公开了一种抑制B7-H3表达的干扰RNA及其应用、一种B7-H3表达降低的细胞的制备方法。特别是，上述干扰RNA为siRNA，其靶序列包含如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列，其可有效抑制B7-H3基因表达，为预防或治疗B7-H3相关疾病(特别是B7-H3相关的癌症)提供了新的选择。供了新的选择。供了新的选择。


技术研发人员：杨脉 林美娜 贾宏丽 王庆彬 陈晓萌 赵宣
受保护的技术使用者：北京键凯科技股份有限公司
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/9/23