PLPP3调控细胞氧化应激在人卵巢颗粒细胞中的应用

plpp3调控细胞氧化应激在人卵巢颗粒细胞中的应用
技术领域
1.本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及plpp3调控细胞氧化应激在人卵巢颗粒细胞中的应用。


背景技术：

2.氧化应激是细胞衰老的主要驱动因素，当体内活性氧(reactive oxygen species,ros)超过细胞的抗氧化和清除能力时，氧化应激水平就会提高。研究表明，氧化应激水平与女性年龄呈正相关，氧化应激诱导卵泡闭锁、卵母细胞数量和质量逐渐下降，最终导致卵巢衰老和卵巢相关疾病，如多囊卵巢综合征。卵巢衰老与哺乳类动物颗粒细胞中失活的抗氧化途径、ros水平和细胞凋亡水平增加有关。sod1是主要的内源性抗氧化剂，可抵御由ros过度积累带来的氧化应激，研究表明，跟正常小鼠相比，敲除sod1的小鼠，其卵泡发育受到抑制。而ros的过度累积会导致颗粒细胞凋亡、端粒缩短和线粒体功能紊乱，促进黄体退化，降低卵巢卵母细胞的质量，进而导致卵泡闭锁并加速卵巢衰老。这些都揭示了氧化应激在调控卵巢颗粒细胞凋亡和卵泡发育中的作用。
3.磷脂磷酸酶作为一种糖蛋白定位于细胞质膜上，可水解溶血磷脂酸和短链磷脂酸，把磷脂酸转化为二酰甘油，在甘油脂类的新生合成及受体激活的信号通路中发挥作用。此外，有报道称plpp3还可水解磷酸神经酰胺和磷酸醇。通过生成的这些产物，plpp3基因参与细胞黏附、细胞间互作、血管形成及其相关疾病炎症反应和细胞侵袭等。尽管plpp3基因具有以上重要的生物学功能，但其在卵巢颗粒细胞和卵泡发育中的作用尚不清楚。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供plpp3在调控人卵巢颗粒细胞氧化应激中的应用。
5.plpp3调控细胞氧化应激在人卵巢颗粒细胞中的应用。
6.本发明构建了plpp3基因的超表达质粒pcdna3.1-plpp3(oe-plpp3)，并合成了其干扰序列si-plpp3(东泽公司合成)，接着分别进行了超表达和干扰效率检测，并选择1000ng pcdna3.1-plpp3和100nm si-plpp3进行后续的转染实验。通过ros检测试剂盒检测plpp3基因对颗粒细胞中ros水平的影响；通过qrt-pcr和western blotting(wb)蛋白实验方法检测plpp3基因对氧化应激信号通路标志基因mrna和蛋白水平的影响；通过rna免疫沉淀(rip)和共免疫沉淀(co-ip)实验，检测plpp3蛋白跟氧化应激信号通路标志基因在mrna和蛋白水平的互作情况；对关键抗氧化基因的cds进行截断处理(分为5’utr，5个外显子区和3’utr区域，分别设计相应区域的定量引物进行扩增)，检测其与plpp3蛋白的特异性结合区域；通过rna和蛋白核质分离实验，检测plpp3基因和氧化应激信号通路标志基因的在细胞质和细胞核的表达定位及互作；通过生信网站发现plpp3蛋白包含一个acidppc结构域(130aa-271aa)和两个跨膜区域(transr)，于是构建了gfp-plpp3分段融合蛋白，分别为full(含plpp3蛋白全长，1aa-311aa)、transr-acidppc(1aa-275aa)和transr(1aa-125aa)，
检测氧化应激关键蛋白与plpp3蛋白互作的特异性位点；通过组织免疫荧光实验在卵巢组织水平检测plpp3基因和氧化应激关键蛋白的互作。通过edu和cck8方法检测plpp3对人卵巢颗粒细胞增殖和细胞活性的影响；通过annexin v/pi实验方法探究plpp3对人卵巢颗粒细胞凋亡的影响。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.plpp3在调控人卵巢颗粒细胞氧化应激中的应用，所述的应用为如下应用中的任意一种或多种：
9.i.超表达外源性plpp3基因在体外环境下促进卵巢颗粒细胞氧化应激的应用；
10.ii.抑制plpp3基因表达在体外环境下抑制卵巢颗粒细胞氧化应激的应用。
11.进一步地，超表达外源性plpp3基因，卵巢颗粒细胞中ros水平显著升高，内源性抗氧化基因sod1、sod2和cat的mrna及蛋白水平显著降低；抑制plpp3基因表达，卵巢颗粒细胞中ros水平显著降低，内源性抗氧化基因sod1、sod2和cat的mrna及蛋白水平显著升高。
12.plpp3调控细胞氧化应激在人卵巢颗粒细胞中的应用，所述的应用为如下应用中的任意一种或多种：
13.iii.在体外环境下，超表达外源性plpp3基因，卵巢颗粒细胞氧化应激水平升高，抑制卵巢颗粒细胞增殖；
14.iv.在体外环境下，抑制plpp3基因表达，卵巢颗粒细胞氧化应激水平下降，促进卵巢颗粒细胞增殖；
15.v.在体外环境下，超表达外源性plpp3基因，卵巢颗粒细胞氧化应激水平升高，促进卵巢颗粒细胞凋亡；
16.vi.在体外环境下，抑制plpp3基因表达，卵巢颗粒细胞氧化应激水平下降，抑制卵巢颗粒细胞凋亡的应用。
17.进一步地，超表达外源性plpp3基因，卵巢颗粒细胞中增殖信号通路标志基因cdk4、sp1、pcna、ikba和p65的mrna水平显著降低，cdk4和pcna基因的蛋白水平显著升高；抑制plpp3基因表达，卵巢颗粒细胞中增殖信号通路标志基因cdk4、sp1、pcna、ikba和p65的mrna水平显著升高，cdk4，pcna和p65基因的蛋白水平显著降低。
18.进一步地，超表达外源性plpp3基因，卵巢颗粒细胞中凋亡信号通路标志基因casp3、casp8、casp9、bid、p53、plcy1、bax和bim的mrna水平显著升高，mcl1和creb1的mrna水平显著降低，其中，bim、bax和casp9的蛋白水平显著升高，mcl1的蛋白水平显著降低；抑制plpp3基因表达，卵巢颗粒细胞中凋亡信号通路标志基因casp3、casp8、casp9、bid、p53、plcy1、bax和bim的mrna水平显著降低，mcl1和creb1的mrna水平明显升高，其中，bim、bax和casp9的蛋白水平显著降低，mcl1的蛋白水平显著升高。
19.plpp3在调控人卵巢颗粒细胞sod1基因转录和/或翻译活性中的应用，所述的应用为如下应用中的任意一种或多种：
20.vii.超表达外源性plpp3基因在体外环境下抑制sod1基因转录和/或翻译活性的应用；
21.viii.抑制plpp3基因表达在体外环境下促进sod1基因转录和/或翻译活性的应用。
22.进一步地，所述的超表达外源性plpp3基因通过基因超表达技术实现。
23.更进一步地，所述的基因超表达技术采用的基因超表达质粒通过如下方式制备得到：
24.(1)提取卵巢颗粒细胞的cdna，以cdna为模板进行pcr扩增，得到目的片段；
25.(2)将目的片段连接到用限制性内切酶xbai和kpnl酶切后的pcdna3.1载体上，得到重组质粒。
26.更进一步地，步骤(1)中进行pcr扩增所用引物如下所示：
27.forward：5
′‑
ggggtaccccatgctgatggtcctccttgtatc-3
′
；
28.reverse：5
′‑
gctctagagcctacaccatgttgtggtgattgtt-3
′
。
29.进一步地，所述的抑制plpp3基因表达通过rna干扰技术实现。
30.更进一步地，所述的rna干扰技术采用的小干扰片段序列如下：
31.si-plpp3：5
′‑
ctgatggtcctccttgtat-3
′
。
32.抑制plpp3基因表达的试剂在制备促进卵泡发育的药物中的应用。
33.进一步地，所述的抑制plpp3基因表达的试剂为小干扰片段，序列如下：
34.si-plpp3：5
′‑
ctgatggtcctccttgtat-3
′
。
35.本发明以蛋白之间互作为切入点，采用细胞生物学方法研究plpp3调控细胞氧化应激在颗粒细胞中的应用。具体的，本发明以plpp3对颗粒细胞中的ros水平及氧化应激信号通路标志基因的调控为研究对象，来分析plpp3对颗粒细胞氧化应激水平的影响。利用plpp3基因超表达质粒转染颗粒细胞，发现plpp3基因提高了颗粒细胞中的氧化应激水平。此外，通过rip和co-ip实验发现，plpp3蛋白跟sod1在mrna及蛋白水平均有互作且plpp3基因负调控sod1基因的表达。进一步，通过gfp-plpp3融合蛋白的co-ip实验，确定了sod1蛋白跟plpp3蛋白的acidppc结构域互作。最后，验证了超表达plpp3基因抑制了人卵巢颗粒细胞增殖和细胞活力，促进了颗粒细胞凋亡。本发明通过探究plpp3通过跟sod1互作调控颗粒细胞中氧化应激水平，从而影响人卵巢颗粒细胞功能，对研究plpp3基因参与卵泡发育调控及卵巢衰老分子机制研究具有具有很好的应用价值。
36.本发明的验证结果如下：
37.体外环境下，超表达plpp3基因，能够显著提高人卵巢颗粒细胞中的ros水平；而干扰plpp3基因的表达，则显著降低颗粒细胞中的ros水平。
38.体外环境下，超表达plpp3基因，能够显著降低内源性抗氧化基因sod1，sod2和cat的mrna及蛋白水平；而干扰plpp3基因，能够显著提高sod1，sod2和cat的mrna和蛋白水平。
39.体外环境下，anti-plpp3抗体能够显著富集sod1 mrna和sod1蛋白；且anti-sod1抗体能够显著富集plpp3蛋白。
40.体外环境下，anti-plpp3抗体能够显著富集sod1基因的外显子2，外显子3，外显子5和3’utr区域。
41.体外环境下，plpp3基因能够跟sod1 mrna及sod1蛋白在细胞质和细胞核中共定位，并负调控sod1基因的表达。
42.体外环境下，sod1蛋白能够跟plpp3蛋白的acidppc结构域特异性结合。
43.体外环境下，在人的卵巢组织中，anti-plpp3抗体能够明显富集sod1蛋白。plpp3蛋白和sod1蛋白在人的卵巢组织中共定位，在中年人(约40岁)卵巢组织中，plpp3蛋白表达量低，但sod1蛋白表达量高；而在老年人(约60岁)卵巢组织中，plpp3蛋白表达量高，但sod1
蛋白表达量低。
44.体外环境下，超表达plpp3基因，能够显著降低人卵巢颗粒细胞增殖率；而干扰plpp3基因的表达，则显著提高提高颗粒细胞增殖率。
45.体外环境下，超表达plpp3，能够显著降低人卵巢颗粒细胞活力，而干扰plpp3基因的表达，则显著提高颗粒细胞活力。
46.体外环境下，超表达plpp3，能够显著降低颗粒细胞中增殖信号通路标志基因cdk4，sp1，pcna，ikba和p65的mrna水平，且显著降低cdk4和pcna基因的蛋白水平；而干扰plpp3基因的表达，则显著提高了增殖信号通路标志基因cdk4，sp1，pcna，ikba和p65的mrna水平，且显著提高cdk4，pcna和p65基因的蛋白水平。
47.体外环境下，超表达plpp3，能够显著提高颗粒细胞凋亡率，而干扰plpp3基因的表达能显著降低颗粒细胞凋亡率。
48.体外环境下，超表达plpp3能够显著提高颗粒细胞中凋亡信号通路标志基因casp3、casp8、casp9、bid、p53、plcy1、bax和bim的mrna水平影响，降低mcl1和creb1的mrna水平；而干扰plpp3的表达能够显著降低凋亡信号通路标志基因casp3、casp8、casp9、bid、p53、plcy1、bax和bim的mrna水平影响，提高mcl1和creb1的mrna水平；超表达plpp3能够显著提高促凋亡标志蛋白bim、bax和casp9的表达，降低抗凋亡标志蛋白mcl1的表达，而si-plpp3能够显著降低促凋亡标志蛋白bim、bax和casp9的表达，提高抗凋亡标志蛋白mcl1的的表达。
49.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
50.本发明技术方案设计周详，结果可靠。为证实plpp3调控细胞氧化应激对人卵巢颗粒细胞功能的影响，本发明从多层次、多角度验证，首先在细胞表型、氧化应激信号通路标志基因的mrna及蛋白水平调控验证plpp3对氧化应激水平的调控；接着又用rip、co-ip及构建gfp-plpp3融合蛋白来验证plpp3跟氧化应激信号通路标志蛋白之间的互作关系，确定plpp3蛋白跟氧化应激关键蛋白互作的特异性区域；最后，通过检测plpp3对人卵巢颗粒细胞增殖、细胞活力和凋亡的影响验证plpp3调控氧化应激对颗粒细胞功能的影响。
51.本发明首次发现，超表达plpp3基因，能够显著提高人卵巢颗粒细胞氧化应激水平，抑制颗粒细胞增殖，促进颗粒细胞凋亡；而干扰plpp3基因的表达，则显著降低人卵巢颗粒细胞氧化应激水平，促进颗粒细胞增殖，抑制颗粒细胞凋亡，进而促进卵泡发育。
52.本发明对研究氧化应激调控在卵巢卵泡发育、繁殖能力及卵巢相关疾病中的影响机制具有很好的应用价值，在卵巢功能保护和卵巢相关疾病治疗中具有重要临床参考价值。
附图说明
53.图1是plpp3基因对颗粒细胞中ros水平的影响情况研究结果图；其中，a、b是plpp3基因的超表达效率检测；c、d是plpp3基因的干扰效率检测；e是超表达plpp3基因和干扰plpp3基因表达分别对颗粒细胞中ros水平的影响；f是oe-plpp3和si-plpp3对氧化应激信号通路标志基因cyp2e1，ahr，cyp1b1，sod1，sod2和cat的mrna水平影响；g是plpp3对内源性抗氧化酶sod1，sod2和cat和的蛋白水平影响。
54.图2是plpp3跟sod1基因在mrna和蛋白水平互作情况研究结果图；其中，a是rip实
验中，氧化应激信号通路标志基因在anti-plpp3抗体上的mrna富集情况；b是在co-ip实验中，氧化应激信号通路标志蛋白在anti-plpp3抗体上的蛋白富集情况；c是在co-ip实验中，plpp3蛋白在anti-sod1抗体上的蛋白富集情况；d是rip实验中，sod1基因的cds区截断片段在anti-plpp3抗体上的mrna富集情况；e、f是rna和蛋白质核质分离实验中，plpp3基因跟sod1基因在细胞质和细胞核中mrna(e)及蛋白质(f)的互作情况。
55.图3是sod1蛋白跟plpp3蛋白结合的特异性位点情况研究结果图；其中，a是plpp3的蛋白结构域及gfp-plpp3融合蛋白截断处理示意图；b、c是gfp-plpp3融合蛋白在颗粒细胞中表达荧光图(b)和wb蛋白水平检测情况(c)；d是co-ip实验中，sod1蛋白跟plpp3蛋白特异位点结合情况。
56.图4是plpp3蛋白跟sod1蛋白在人的卵巢组织中互作情况研究结果图；其中，a是人的卵巢颗粒细胞中sod1蛋白在anti-plpp3抗体上的蛋白富集情况；b是组织免疫荧光实验中，plpp3蛋白和sod1蛋白在中年人(middle age)(约40岁)和老年人(old age)(约60岁)的卵巢组织中共定位及互作情况。
57.图5是plpp3对颗粒细胞增殖和细胞活力的影响情况研究结果图；其中，a、b是edu实验中，oe-plpp3和si-plpp3对颗粒细胞增殖率影响荧光图(a)和细胞增殖率统计(b)；c、d是oe-plpp3(c)和si-plpp3(d)对颗粒细胞活性的影响；e是oe-plpp3和si-plpp3对增殖信号通路标志基因cdk4，sp1，pcna，ikba和p65的mrna水平影响；f是oe-plpp3及si-plpp3对增殖通路标志基因cdk4，pcna和p65的蛋白水平影响。
58.图6是plpp3对颗粒细胞凋亡水平的影响情况研究结果图；其中，a、b是oe-plpp3(a)和si-plpp3(b)对颗粒细胞凋亡率的影响；c是oe-plpp3和si-plpp3对细胞凋亡通路标志基因casp3、casp8、casp9、bid、p53、plcy1、bax，bim，mcl1和creb1的mrna水平影响；d是oe-plpp3和si-plpp3对凋亡通路标志基因bim、bax和casp9的蛋白水平影响。
具体实施方式
59.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
60.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
61.下列实施例中应用统计学方法，分析各实施例中3次独立实验的结果，分别计算“平均值
±
标准差”，使用单因素方差分析进行差异显著性分析(图中“*”表示p《0.05，“**”表示p《0.01)。
62.实施例1：人卵巢癌颗粒细胞cov434细胞系的培养
63.本发明使用的cov434细胞系(atcc)，采用完全培养基(含10％小牛血清和1％双抗)，置于37℃，5％co2培养箱进行培养，待细胞融合度达到50％-70％进行转染或者药物处理，24h后可进行后续实验。
64.实施例2：构建plpp3基因的超表达质粒
65.(1)利用ncbi网站设计引物，以抽提的人颗粒细胞的cdna为模板扩增plpp3基因的cds区(gene id：8613)；扩增的片段经纯化回收、连接pmd18t载体(takara公司，日本)、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提普通质粒。
66.(2)在plpp3基因上下游引物分别加上xba i和kpn i酶切位点序列。以plpp3基因
的cds区重组pmd18t普通质粒为模版，进行pcr扩增；片段经纯化回收、双酶切、连接pcdna3.1载体、转化、筛选和测序鉴定正确后，采用无内毒素质粒快速抽提盒(magen公司，美国)抽提无内毒素质粒，命名为pcdna3.1-plpp3。
67.本发明所用到的plpp3基因cds区引物：
68.forward：5
’‑
ggggtaccccatgctgatggtcctccttgtatc-3’；
69.reverse：5
’‑
gctctagagcctacaccatgttgtggtgattgtt-3’。
70.(3)设计并委托东泽公司合成plpp3基因的的小干扰片段序列：
71.si-plpp3：5
′‑
ctgatggtcctccttgtat-3
′
。
72.(4)观察细胞状态，当细胞融合度达到50％-70％左右时，分别将1000ng/ml浓度的plpp3超表达载体(oe-plpp3)和超表达对照(oe-nc)及100nmol/l浓度的plpp3干扰片段(si-plpp3)和干扰对照(si-nc)转染至细胞，24h后可进行后续实验。
73.实施例3：qrt-pcr
74.本发明中基因的qrt-pcr检测采用yeasen公司的sybrgreenqpcrmastermix(2x)试剂盒。实验采用比较ct值法检测样品基因的含量，具体计算公式如下：
75.基因相对表达量＝2-{〈﹙实验组目的基因ct值﹚-﹙实验组内参基因ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因ct值﹚-﹙对照组内参基因ct值﹚〉}
76.检测基因用gapdh做内参，本发明所用到的qrt-pcr引物为：
77.qplpp3forward：5
′‑
ggaggagcaggaggagccg-3
′
；
78.reverse：5
′‑
agtccaaggggaagagagc-3
′
；
79.qsod1forward：5
′‑
ctcactctcaggagaccattgc-3
′
；
80.reverse：5
′‑
ccacaagccaaacgacttccag-3
′
；
81.qcatforward：5
′‑
gtgcggagattcaacactgcca-3
′
；
82.reverse：5
′‑
cggcaatgttctcacacagacg-3
′
；
83.qsod2forward：5
′‑
ctggacaaacctcagccctaac-3
′
；
84.reverse：5
′‑
agccttggacaccaacagatgca-3
′
；
85.qcyp1b1forward：5
′‑
gccactatcactgacatcttcgg-3
′
；
86.reverse：5
′‑
cacgacctgatccaattctgcc-3
′
；
87.qcyp2e1forward：5
′‑
gagcaccatcaatctctggacc-3
′
；
88.reverse：5
′‑
cacggtgataccgtccattgtg-3
′
；
89.qgapdhforward：5
′‑
tcaccagggctgcttttaact-3
′
；
90.reverse：5
′‑
cttgactgtgccgtggaact-3
′
；
91.细胞的总rna提取参照上海飞捷公司rnafast200―总rna极速抽提试剂盒操作说明书，具体步骤如下：
92.(1)往用胰酶消化下来的颗粒细胞中，加入500μlra2液，充分颠倒混匀1min。
93.(2)将样本裂解物吸入或倒入内套管，离心1min。
94.(3)弃去外套管中液体，内套管中加入500μl洗液，离心1min。再重复此过程洗一次。
95.(4)取出内套管，弃去外套管中液体，仍然套回内套管，不加洗液，离心1min。
96.(5)将内套管移入新的eppendorf管中，在膜中央加入洗脱液(或ph》7.0的depc处
理水)25-50μl，室温静置1min，离心1min，获得总rna。
97.使用takara公司的primescript
tm rt master mix(perfect real time)cdna反转录试剂盒反转录总rna。
98.实施例4：western blot
99.(1)细胞总蛋白抽提
100.①
配置蛋白裂解液：ripa蛋白裂解液(白鲨公司)中加入1％的蛋白酶体抑制剂，上下颠倒混匀。
101.②
每孔(六孔板)加入120μl蛋白裂解液，置于冰上裂解10-15min，中间拿出来轻轻晃动，促进细胞脱落。
102.③
收集裂解的血细胞，12,000g，4℃离心10min，小心吸取上清液，去除下层沉淀。
103.(2)sds-page：
104.①
蛋白定量(碧云天bca蛋白定量试剂盒)：使用多功能酶标仪测定a
562
波长的od值，绘制标准曲线，通过回归方程和各个蛋白标准的平均od值，计算各蛋白样品浓度；
105.②
样品制备：混合20μg总蛋白与5
×
上样缓冲液按5:1，煮沸10min；
106.③
制胶点样：每孔加入20ug蛋白，跑胶电压120～150v，约40min(当溴芬蓝跑至离胶底端1～2cm左右，停止电泳；或根据具体情况调整跑胶电压与时间)；
107.④
根据蛋白marker的分子量标准切下含有目的蛋白的胶条，选择转膜电流300ma，20min；
108.⑤
转膜结束后，用tbst轻轻冲洗膜5min，用5％的脱脂奶粉室温封闭2h；
109.⑥
用tbst轻轻冲洗膜2次，每次5min，用tbst按照抗体说明书的比例稀释一抗plpp3(购自北京博奥森公司)，4℃孵育过夜；
110.⑦
用tbst轻轻冲洗膜3次，每次10min，1:10000稀释二抗goat anti-rabbit igg(购自sab公司)，室温孵育2h；
111.⑧
用tbst轻轻冲洗膜3次，每次10min；
112.⑨
用极超敏ecl化学发光试剂盒(碧云天公司，中国)显色，使用天能成胶系统(天能公司，中国)观察蛋白条带并进行拍照，采用image j软件分析胶片中的蛋白条带。
113.实施例5：rip实验
114.使用ez-magna rip试剂盒(millipore，美国)根据制造商的说明进行rip检测。用胰酶从6孔板里消化并收集颗粒细胞，再用试剂盒里的裂解液进行裂解后，分为ip，igg和input三组，ip组用anti-plpp3抗体在4℃免疫沉淀过夜，以同源igg作为对照。洗涤、洗脱后，采用rt-qpcr检测富集的rna样本。rt-qpcr的特异性引物详见实施例3。
115.实施例6：co-ip实验
116.使用ez-magna co-ip试剂盒(millipore，美国)进行co-ip实验。收集的细胞用plpp3(博奥森，中国)或cat(affinity，美国)、sod1(affinity，美国)、cyp1b1(affinity，美国)和cyp2e1抗体(affinity，美国)在4℃下免疫共沉淀过夜，进行阴性验证，以igg为对照。用wb法检测富集的蛋白。
117.实施例7：rna核质分离实验
118.使用细胞质和细胞核rna提取试剂盒(norgen biotek，加拿大)来提取和纯化细胞质和细胞核rna。具体操作步骤如下：
119.①
将消化下来的细胞转移至无rnase的试管，离心10min，收集细胞沉淀。往沉淀中加入lysis buffer j，涡旋以致充分裂解细胞。
120.②
将裂解液转移至新无rnase的微量离心管中，台式离心机最大转速离心10min，将含有细胞质rna的上清液转移至另一个无rnase的试管。沉淀部分即为细胞核rna组分。
121.③
提取并纯化rna。向含有细胞质rna的上清液中和含有细胞核rna的沉淀中分别加入buffer，涡旋混合10s，再加入96％-100％的乙醇，涡旋混匀10s。离心1min后用wash solution a洗涤三次，用elution buffer e洗脱纯化rna。
122.④
纯化的rna反转录成cdna后用qrt-pcr检测目标基因的表达量。
123.实施例8：蛋白核质分离实验
124.使用ne-per nuclear and cytoplasmic extraction reagents(美国，赛默飞)进行细胞质和细胞核蛋白质的提取和纯化。具体操作步骤如下：
125.①
向收集的细胞沉淀中加入冰冷的细胞质萃取试剂i(cer i)，涡旋15s，使细胞颗粒完全悬浮，冰上孵育10min。
126.②
加入冰冷的细胞质萃取试剂iicer ii，涡旋5s，冰上孵育1min。再次涡旋，离心后收集上清，即为细胞质蛋白，将其转移至新的离心管，保存待用。下层细胞沉淀即为细胞核。
127.③
在细胞核沉淀中加入冰冷的细胞核萃取试剂ner，每10min涡旋15s，共涡旋4次，持续40min。
128.④
离心10min，转移上清液，即核蛋白质，至一个干净的预冷管中，保存备用。
129.⑤
将提取的细胞质、细胞质蛋白质加入sds经变性后用于后续的wb实验，检测目标蛋白的表达量。
130.实施例9：组织免疫荧光
131.具体操作步骤如下：
132.①
将人卵巢(来自中山大学附属第一医院-妇科生殖医学中心，已获得医学伦理委员会批准)石蜡切片分别置于脱蜡溶液和无水乙醇中10-15min。
133.②
将洗涤后的卵巢切片放置在充满柠檬酸抗原修复溶液的修复盒中，并在微波炉中进行抗原修复。
134.③
自然冷却后，在脱色摇台上用pbs清洗载玻片三次，每次5min。使用组织化学笔在组织周围画圆圈以防止液体流失。
135.④
用3％-5％bsa密封载玻片30min后，与第一抗体在4℃孵育过夜，第二抗体在37℃孵育3h。
136.⑤
加入dapi染料溶液，避光环境下室温孵育5min，定位靶蛋白。随后用树脂密封剂密封切片，并在荧光显微镜下观察和收集切片图像。
137.实施例10：细胞增殖检测
138.本发明使用edu试剂盒(锐博，中国)检测颗粒细胞增殖，参照锐博公司cell-light
tm
edu apollo 567in vitro kit检测试剂盒说明书，具体操作步骤如下：
139.(1)取细胞接种于48孔板，培养细胞至融合度为50～80％；
140.(2)制备50μmedu培养基，即为用细胞培养基稀释按照1000:1稀释edu溶液，每孔加入200μl 50μmedu培养基孵育2h，pbs清洗细胞，每次3～5min；
141.(3)细胞固定化：向每孔加入200μl细胞固定液(用pbs稀释至80％的丙酮)，室温孵育15～30min，pbs清洗细胞，每次3～5min；
142.(4)细胞透化：每孔加入200μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)透化细胞，透化孵育10min，pbs清洗细胞；
143.(5)edu检测：每孔加入200μl的1
×
染色反应液(避光配置)，避光在细胞培养中孵育30min，pbs清洗细胞；
144.(6)细胞再次透化：每孔加入200μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)透化细胞，透化孵育10min，pbs清洗细胞；
145.(7)dna染色：每孔加入200μl dapi反应液，避光室温孵育30min；
146.(8)荧光显微镜镜检(每组三个重复)。
147.实施例11：颗粒细胞活性检测
148.本发明使用cck-8检测试剂盒(碧云天，中国)检测细胞活性，具体操作步骤如下：
149.(1)用96孔板接种细胞，当细胞融合度为50-70％时，使用lip3000试剂(赛默飞，美国)转染plpp3的过表达载体和干扰片段，继续培养24h；
150.(2)每孔加入10μlcck-8溶液(培养基：cck8溶液＝10:1)，放置细胞培养箱孵育1h，用酶标仪a450测定od值。
151.实施例12：颗粒细胞凋亡检测
152.本发明使用annexin v-fitc技术检测细胞凋亡，参照参照biovision公司annexin v-fitc apoptosis detection kit试剂盒说明书，具体操作步骤如下：
153.(1)取细胞接种于6孔板，培养细胞至融合度为50％～70％，使用lip3000试剂(赛默飞，美国)转染plpp3的超表达质粒和干扰片段，继续培养24h；
154.(2)使用不含edta的胰酶消化细胞，用2ml pbs溶液清洗细胞；
155.(3)取0.5ml细胞悬液(约5
×
105个细胞)，加入500μl 1
×
binding buffer；
156.(4)加入5μl annexin v-fitc及室温5μl propidium iodide，室温避光孵育5min；
157.(5)立即用流式细胞仪检测分析(每组3个重复)。
158.结果：
159.1、plpp3显著提高了颗粒细胞中的氧化应激水平
160.构建plpp3基因的超表达质粒pcdna3.1-plpp3(oe-plpp3)和plpp3的干扰片段si-plpp3(东泽公司，序列为ctgatggtcctccttgtat)。使用ros检测试剂盒(bio vision，美国)检测plpp3基因对人卵巢颗粒细胞中ros水平的影响；通过qrt-pcr和western blot实验检测plpp3基因对氧化应激信号通路标志基因mrna和蛋白水平变化的影响。
161.qrt-pcr和western blot结果显示，超表达质粒pcdna3.1-plpp3(oe-plpp3)和干扰片段si-plpp3的最佳转染浓度分别为1000ng(图1中的a、b)和100nm(图1中的c、d)；
162.ros检测结果显示，oe-plpp3显著提高了颗粒细胞中的ros水平(图1中的e)，而si-plpp3显著降低了颗粒细胞中的ros水平(图1中的e)。
163.qrt-pcr结果显示，oe-plpp3显著降低了氧化应激信号通路抗氧化基因sod1和sod1和mrna水平，但是却提高了cat及促氧化基因cyp2e1，ahr和cyp1b1的mrna水平(图1中的f)。而si-plpp3显著提高了氧化应激信号通路抗氧化基因sod1，sod1和cat的mrna水平，降低了促氧化基因cyp2e1，ahr和cyp1b1的mrna水平(图1中的f)。
164.western blot结果显示，oe-plpp3显著降低了内源性抗氧化酶sod1，sod2和cat的蛋白水平(图1中的g)；而si-plpp3显著提高了sod1，sod2和cat的蛋白水平(图1中的g)。
165.2、plpp3蛋白跟sod1基因在mrna和蛋白水平互作
166.通过rip、co-ip和核质分离实验检测plpp3基因跟氧化应激通路标志基因在mrna和蛋白水平的互作情况。
167.rip和co-ip结果显示，跟氧化应激信号通路其他标志基因相比，anti-plpp3抗体明显富集大量的sod1 mrna(图2中的a)和sod1蛋白(图2中的b)，且anti-sod1抗体明显富集大量的plpp3蛋白(图2中的c)；
168.对sod1基因的cds区进行截断处理，通过rip结果进一步显示，anti-plpp3抗体明显富集sod1cds区的外显子2，外显子3，外显子5和3’utr区域(图2中的d)。
169.核质分离实验结果显示，颗粒细胞中，plpp3跟sod1基因在细胞质和细胞核中均有互作并呈负调控关系，oe-plpp3主要在细胞核中抑制了sod1的转录(图2中的e)，在细胞质中抑制了sod1的翻译(图2中的f)。
170.3、sod1蛋白结合在plpp3的acidppc结构域
171.通过gfp-plpp3融合蛋白截断处理(图3中的a)及co-ip实验，验证plpp3和sod1蛋白互作的特异区域。
172.细胞免疫荧光(图3中的b)和wb实验(图3中的c)显示，gfp-plpp3融合蛋白在颗粒细胞中正常表达。
173.co-ip实验显示，sod1蛋白跟plpp3蛋白的acid-ppc结构域特异性结合(图3中的d)。
174.4、plpp3跟sod1蛋白在人的卵巢组织中互作
175.使用co-ip和组织免疫荧光技术，检测plpp3蛋白和sod1蛋白在中年人和老年人卵巢组织中的定位及互作关系。
176.co-ip实验显示，人的卵巢颗粒细胞中，anti-plpp3抗体明显富集大量的sod1蛋白(图4中的a)；
177.组织免疫荧光实验显示，plpp3蛋白和sod1蛋白在人的卵巢组织中共定位，且在中年人(约40岁)卵巢组织中，plpp3蛋白表达量低，但sod1蛋白表达量高(图4中的b)；而在老年人(约60岁)卵巢组织中，plpp3蛋白表达量高，但sod1蛋白表达量低(图4中的c)。
178.5、plpp3基因显著抑制了颗粒细胞增殖和细胞活力
179.使用edu(5-ethynyl-2
’‑
deoxyuridine)试剂盒(锐博，中国)和cck8试剂盒(碧云天，中国)分别检测plpp3对颗粒细胞增殖率和细胞活力的影响；通过qrt-pcr和western blot实验检测plpp3对细胞增殖信号通路标志基因的mrna和蛋白水平的影响。
180.edu实验结果显示，oe-plpp3显著降低了颗粒细胞增殖率(图5中的a、b)，而si-plpp3则显著提高了颗粒细胞增殖率(图5中的a、b)。
181.cck8实验结果显示，oe-plpp3显著降低了颗粒细胞活力(图5中的c)，而si-plpp3则显著提高了颗粒细胞活力(图5中的d)。
182.qrt-pcr结果显示，oe-plpp3显著降低了颗粒细胞中增殖信号通路标志基因cdk4，sp1，pcna，ikba和p65的mrna水平，而si-plpp3则显著提高了增殖信号通路标志基因cdk4，sp1，pcna，ikba和p65的mrna水平(图5中的c)；western blot实验结果显示，oe-plpp3显著
降低了cdk4和pcna的蛋白水平，但对p65的蛋白表达量影响不显著；si-plpp3显著提高cdk4，pcna和p65的蛋白水平(图5中的d)。
183.6、plpp3基因显著提高了卵巢颗粒细胞凋亡水平
184.通过annexin v/pi检测plpp3对颗粒细胞凋亡率的影响情况；通过qrt-pcr和western blot实验检测plpp3对细胞凋亡信号通路标志基因的mrna和蛋白水平的影响情况。
185.annexin v/pi实验结果显示，oe-plpp3显著提高了颗粒细胞凋亡率(图6中的a)，而si-plpp3显著降低了颗粒细胞凋亡率(图6中的b)。
186.qrt-pcr结果显示，oe-plpp3显著提高了细胞凋亡信号通路标志基因casp3、casp8、casp9、bid、p53、plcy1、bax和bim的mrna水平，降低了mcl1和creb1的mrna水平(图6中的c)，而si-plpp3则显著降低了细胞凋亡信号通路标志基因casp3、casp8、casp9、bid、p53、plcy1、bax和bim的mrna水平影响，提高了mcl1和creb1的mrna水平(图6中的c)；oe-plpp3显著提高了促凋亡标志蛋白bim、bax和casp9的表达量，降低了抗凋亡标志蛋白mcl1的表达量(图6中的d)，而si-plpp3则显著降低了促凋亡标志蛋白bim、bax和casp9的表达量，提高了抗凋亡关键蛋白mcl1的表达量(图6中的d)。
187.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.plpp3在调控人卵巢颗粒细胞氧化应激中的应用，其特征在于：所述的应用为如下应用中的任意一种或多种：i.超表达外源性plpp3基因在体外环境下促进卵巢颗粒细胞氧化应激的应用；ii.抑制plpp3基因表达在体外环境下抑制卵巢颗粒细胞氧化应激的应用。2.根据权利要求1所述的plpp3在调控人卵巢颗粒细胞氧化应激中的应用，其特征在于：超表达外源性plpp3基因，卵巢颗粒细胞中ros水平显著升高，内源性抗氧化基因sod1、sod2和cat的mrna及蛋白水平显著降低；抑制plpp3基因表达，卵巢颗粒细胞中ros水平显著降低，内源性抗氧化基因sod1、sod2和cat的mrna及蛋白水平显著升高。3.plpp3调控细胞氧化应激在人卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：所述的应用为如下应用中的任意一种或多种：iii.在体外环境下，超表达外源性plpp3基因，卵巢颗粒细胞氧化应激水平升高，抑制卵巢颗粒细胞增殖；iv.在体外环境下，抑制plpp3基因表达，卵巢颗粒细胞氧化应激水平下降，促进卵巢颗粒细胞增殖；v.在体外环境下，超表达外源性plpp3基因，卵巢颗粒细胞氧化应激水平升高，促进卵巢颗粒细胞凋亡；vi.在体外环境下，抑制plpp3基因表达，卵巢颗粒细胞氧化应激水平下降，抑制卵巢颗粒细胞凋亡的应用。4.根据权利要求3所述的plpp3调控细胞氧化应激在人卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：超表达外源性plpp3基因，卵巢颗粒细胞中增殖信号通路标志基因cdk4、sp1、pcna、ikba和p65的mrna水平显著降低，cdk4和pcna基因的蛋白水平显著升高；抑制plpp3基因表达，卵巢颗粒细胞中增殖信号通路标志基因cdk4、sp1、pcna、ikba和p65的mrna水平显著升高，cdk4，pcna和p65基因的蛋白水平显著降低；超表达外源性plpp3基因，卵巢颗粒细胞中凋亡信号通路标志基因casp3、casp8、casp9、bid、p53、plcy1、bax和bim的mrna水平显著升高，mcl1和creb1的mrna水平显著降低，凋亡标志蛋白bim、bax和casp9的表达量显著升高，mcl1的表达量显著降低；抑制plpp3基因表达，卵巢颗粒细胞中凋亡信号通路标志基因casp3、casp8、casp9、bid、p53、plcy1、bax和bim的mrna水平显著降低，mcl1和creb1的mrna水平升高，凋亡标志蛋白bim、bax和casp9的表达量显著降低，mcl1的表达量显著升高。5.plpp3在调控人卵巢颗粒细胞sod1基因转录和/或翻译活性中的应用，其特征在于：所述的应用为如下应用中的任意一种或多种：vii.超表达外源性plpp3基因在体外环境下抑制sod1基因转录和/或翻译活性的应用；viii.抑制plpp3基因表达在体外环境下促进sod1基因转录和/或翻译活性的应用。6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于：所述的超表达外源性plpp3基因通过基因过表达技术实现；所述的抑制plpp3基因表达通过rna干扰技术实现。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述的基因过表达技术采用的基因超表达质粒通过如下方式制备得到：(1)提取卵巢颗粒细胞的cdna，以cdna为模板进行pcr扩增，得到目的片段；(2)将目的片段连接到用限制性内切酶xbai和kpnl酶切后的pcdna3.1载体上，得到重组质粒；步骤(1)中进行pcr扩增所用引物如下所示：forward：5
′‑
ggggtaccccatgctgatggtcctccttgtatc-3
′
；reverse：5
′‑
gctctagagcctacaccatgttgtggtgattgtt-3
′
。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的rna干扰技术采用的小干扰片段序列如下：si-plpp3：5
′‑
ctgatggtcctccttgtat-3
′
。9.抑制plpp3基因表达的试剂在制备促进卵泡发育的药物中的应用。10.根据权利要求6所述的抑制plpp3基因表达的试剂在制备促进卵泡发育的药物中的应用，其特征在于：所述的抑制plpp3基因表达的试剂为小干扰片段，序列如下：si-plpp3：5
′‑
ctgatggtcctccttgtat-3
′
。

技术总结
本发明公开了PLPP3调控细胞氧化应激在人卵巢颗粒细胞中的应用，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明首次发现，超表达PLPP3基因，能够显著提高人卵巢颗粒细胞氧化应激水平，抑制颗粒细胞增殖，促进颗粒细胞凋亡；而干扰PLPP3基因的表达，则显著降低人卵巢颗粒细胞氧化应激水平，促进颗粒细胞增殖，抑制颗粒细胞凋亡，进而促进卵泡发育。本发明对研究氧化应激调控在卵巢卵泡发育、繁殖能力及卵巢相关疾病中的影响机制具有很好的应用价值，在卵巢功能保护和卵巢相关疾病治疗中具有重要的临床价值。临床价值。临床价值。


技术研发人员：张哲 全洪燕 李加琪 袁晓龙 何颖婷 陈永财 张柳红 黄恩媛
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/9/23