一种路路通萃取物的抑菌筛选方法及应用

1.本发明涉及微生物抑菌领域，尤其涉及一种路路通萃取物的抑菌筛选方法及应用。


背景技术：

2.随着人类使用抗生素的不断加大，导致一些菌体产生抗抑作用，产生不同的耐药菌株。因此，寻找和开发出新的抑菌药品对不同菌株开展抑菌实验具有深刻的研究意义。我国中药材丰富，每一味中药都蕴含着极高的研究价值，在未完全开发的中药中寻找新的抑菌活性物质并将其开发成新型高效无毒的抑菌药品一直是人们研究的热点。
3.路路通是金缕梅科(hamamelidaceae)植物枫香树(liquidambar formosana hance)的干燥成熟果序，其通常用作中药，具有抑制关节炎肿胀、消炎、消毒等作用。路路通不仅可以加快血液循环，减轻淤血，加速伤口愈合，还具有抗炎等功效，荨麻疹、风疹等皮肤病也可被路路通治疗缓解。路路通性味苦、平，归肝、肾经，它含有多种化学成分如羽扇烷萜、奥利烷萜、甾体、类黄酮和酚类化合物。在抑菌方面，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌是大多数感染的病原菌其中之一，其具有比较强的致病作用，能够引起人类表皮、真皮及皮下组织部位出现感染、败血症和菌血症以及全身各个器官感染。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于提供一种路路通萃取物的抑菌筛选方法及应用，其利用植物药材路路通获得五种萃取复合物，并通过对该五种复合物的抑菌筛选最终获得具有最佳抑菌效果的路路通抑菌复合物；该抑菌复合物可作为一种新型天然草本抑菌药品，用于中医皮肤医疗行业。
5.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
6.一种路路通萃取物的抑菌筛选方法，将路路通粉碎加入乙醇加热回流，每次回流两小时；合并收集的液体经减压回收得到路路通粗浸膏，再将粗浸膏加入纯水充分溶解，并依次与石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇相萃取，剩余水层减压回收，最终得到五种不同部位的萃取复合物；将不同复合物分别与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌进行抑菌筛选，通过抑菌圈、cfu筛选出最佳抑菌复合物。
7.作为本发明的优选方式之一，包括如下步骤：
8.(1)路路通混合液的制备
9.称取路路通药材粉碎过筛，粉末放入烧瓶，使用体积浓度为95％乙醇溶液在恒温水浴锅95℃条件下进行加热回流提取；一共提取两次，最后合并滤液进行减压回收，得路路通粗浸膏；加入纯水放入超声混悬得到路路通混合液；
10.(2)路路通石油醚部位的制备
11.将步骤(1)获得的路路通混合液转入分液漏斗，量取等量体积的石油醚进行充分震荡混悬溶解，一共萃取3次，每次静置4h后减压回收石油醚，得石油醚部位萃取复合物；
12.(3)路路通二氯甲烷部位的制备
13.量取等量体积的二氯甲烷对步骤(2)处理后的路路通混合液进行萃取，一共萃取3次，每次静置4h后减压回收二氯甲烷，得二氯甲烷部位萃取复合物；
14.(4)路路通乙酸乙酯部位的制备
15.量取等量体积的乙酸乙酯对步骤(3)处理后的路路通混合液进行萃取，一共萃取3次，每次静置4h后减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯部位萃取复合物；
16.(5)路路通正丁醇部位的制备
17.量取等量体积的正丁醇对步骤(4)处理后的路路通混合液进行萃取，一共萃取3次，每次静置4h后减压回收正丁醇，得正丁醇部位萃取复合物；
18.(6)路路通水部位的制备
19.将分液漏斗里面的剩余水层部位减压回收，得水层复合物；
20.(7)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌液的制备
21.用接种针分别挑取供试菌种-金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，用平板划线法进行菌种活化，恒温培养箱中倒置培养24h、37℃；从活化后的平板上挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌单菌落，分别接种在lb液体培养基中得到相应菌悬液备用；
22.(8)路路通萃取物抑菌圈的测定
23.取石油醚部位萃取复合物、二氯甲烷部位萃取复合物、乙酸乙酯部位萃取复合物、正丁醇部位萃取复合物、水层复合物，分别用丙酮、纯水作为溶剂制成五种药液；同时，使用打孔器制作圆形滤纸片灭菌，备用；
24.分别吸取步骤(7)获得的两种菌悬液涂在lb固体培养基上；把涂覆菌液后的各培养基分为4个区域，并将制作的圆形滤纸片粘贴在每个区域的中心；按照不同药液对各培养基进行分组，并将相应的药液、丙酮、水、卡那霉素分别喷洒在培养基的4个区域滤纸片上，接着放入恒温培养箱37℃、12h下倒置培养，观察各培养基滤纸片周围菌群生长抑制情况；根据药液滤纸片周围的抑菌圈直径d大小初步筛选出最佳抑菌复合物；
25.(9)菌落形成单位实验cfu的测定
26.将培养好的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌液分装进离心管中，离心弃上清液，缓冲液吹打混匀重悬，分别加入不同药物混匀放入培养箱中孵育；待其孵育完成后，将对应菌液进行梯度稀释，取稀释后的菌液涂布于lb固体平板上，计数菌落总数，评价药物抑菌的抑菌活性，进一步确定最佳抑菌复合物。
27.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，称取路路通药材粉碎过筛时，过60目筛三次；加热回流提取时，料液比分别是1：10与1：8。
28.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)～(6)中，每次萃取加入等量体积的萃取液，也就是150ml加入分液漏斗分别进行萃取，萃取前需要震荡20min让其充分溶解。
29.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(7)中，将培养好的细菌浓度调节至1.5
×
108cfu/ml，然后稀释至1.0
×
106～1.0
×
107cfu/ml的细菌悬浮液。
30.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(8)中，制作药液时：称取石油醚部位萃取复合物、二氯甲烷部位萃取复合物、乙酸乙酯部位萃取复合物、正丁醇部位萃取复合物、水层复合物，用丙酮、纯水作为溶剂制成100mg/ml药液；
31.喷洒药液时：以少量多次的形式将30μl药液喷洒在各区域滤纸片上。
32.同时，所述步骤(8)中，根据药液滤纸片周围的抑菌圈直径d大小判断菌群对相应药液的敏感度，判定标准为：d≤8mm为不敏感，8mm《d≤13mm为低度敏感，13mm《d≤19mm为中度敏感，d》19mm为高度敏感；从各组培养基中选择菌群反应更敏感的药液作为初步确定的抑菌复合物。
33.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(9)中，取od
600nm
＝0.5的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌液；在超净工作台中取1ml菌液分装进1.5ml离心管中，在高速冷冻离心机中转速为3000rpm的条件下离心5min；弃上清加入900μl的0.01m pbs缓冲液吹打混匀，使其重新悬浮；待其孵育完成后，将菌液进行梯度稀释至10-5
，取稀释后的菌液100μl均匀地在lb固体平板上涂布，计数菌落总数，评价药物抑菌的抑菌活性。
34.作为本发明的优选方式之一，最终筛选出的最佳抑菌复合物为乙酸乙酯部位萃取复合物。
35.作为本发明的优选方式之一，当确定最佳抑菌复合物后，还包括如下的步骤(10)和(11)；
36.(10)最佳抑菌复合物的生长曲线测定
37.采用比浊度法测定复合物生长曲线，在紫外分光光度计上测定菌悬液的吸光度值，通过吸光度来测定菌液浓度；每28支无菌试管为一组，分别使用黑色记号笔写上培养时间；使用移液枪吸取适量金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养液放入灭过菌的含有的50ml液体lb培养基的三角瓶中，并分别在药物组、对照组中加入适量的药品轻轻震摇使金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、与lb液体培养基混合均匀；完成上述操作后，分别吸取5ml混合液转入之前已标记好的7支无菌大试管中；将上述样品组、对照组、空白组试管同一时间放进摇床在37℃下震荡培养，分别培养0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，然后分别置于600nm紫外分光光度计上测得上测得；对于吸光度大的培养液使用液体培养基合理稀释后再检测，使其光密度值在0.1-1之内，重复三次取其平均值；
38.(11)最佳抑菌复合物的最低抑菌浓度mic测定
39.对其有抑菌活性的部位进行mic测定；最小抑菌浓度mic是指抑制微生物增长的最低药物浓度，取前面步骤筛选确定的最佳抑菌复合物，采用试管二倍稀释法，取无菌试管16支；分组编号后，将实验组中的8支试管中分别加入1ml lb液体培养基，在编号1试管中加入1ml100 mg/ml的最佳抑菌复合物，混匀后再吸至1ml至编号2试管中，与之相同倍比稀释至编号8试管，吹打混匀后编号8试管再丢弃1ml，此时试管内药液浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125mg/ml，编号8为不加药液的对照组管；对照组操作与实验组相同；使用移液枪吸取已经稀释后的od
600nm
＝0.5菌液100μl，依次加入到实验组各管中并吹打混匀，混匀后置于37℃恒温摇床中进行震荡培养12h；以浑浊度为目标，以对照组为参考对象检查试管中细菌有无生长，以无细菌增长的编号管内的药液质量浓度为该实验组中最小抑菌浓度。
40.一种上述路路通萃取物的抑菌筛选方法在开发新型天然草本抑菌药品方面的应用。
41.本发明相比现有技术的优点在于：
42.(1)本发明利用植物药材路路通获得五种萃取复合物，并通过对该五种复合物的抑菌筛选最终获得具有最佳抑菌效果的乙酸乙酯部位萃取复合物；该复合物可以有效抑制
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的繁殖能力；
43.(2)本发明获取的最佳抑菌复合物所用经济成本低廉、耗时短；
44.(3)本发明筛选获得的乙酸乙酯部位萃取复合物可作为一种高效无毒的新型天然草本抑菌药品，用于中医皮肤医疗行业。
附图说明
45.图1是实施例2中不同抑菌部位抑菌圈的筛选结果图；
46.图2是实施例2中不同部位萃取复合物的cfu菌落数呈现图；
47.图3是实施例3中乙酸乙酯复合物对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的生长曲线影响(图中，a图为乙酸乙酯复合物对于金黄色葡萄球菌的生长曲线影响，b图为乙酸乙酯复合物对于大肠杆菌的生长曲线影响)；
48.图4是实施例4中乙酸乙酯复合物对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的活/死染色结果图(图中，a图为乙酸乙酯复合物对于大肠杆菌的活/死染色结果，b图为乙酸乙酯复合物对于金黄色葡萄球菌的活/死染色结果)；
49.图5是实施例4中添加不同浓度药物的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌液经处理后的sem图；
50.图6是实施例4中乙酸乙酯部位萃取复合物处理后的细菌感染伤口及实验流程图；
51.图7是实施例4中小鼠菌血症模型实验示意图。
具体实施方式
52.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
53.实施例1：路路通各部位萃取复合物的制备
54.s1.路路通混合液的制备：
55.选取已清洗好的路路通药材粉碎，将粉碎后的路路通药材粗粉使用60目筛过筛三次；准确称取路路通药材粉末50g放入500ml圆底烧瓶，使用体积浓度为95％乙醇溶液在恒温水浴锅95℃条件下进行加热回流提取；一共提取两次(料液比分别为1：10与1：8)，第一次使用量筒准确量取500ml体积浓度95％乙醇溶液加热回流提取2h，第二次加入400ml、95％乙醇溶液加热回流提取2h；加热回流结束后立即将提取液进行减压过滤，得滤液，第一次减压过滤后的滤渣再次进行第二次加热回流提取，将两次过滤后的液体一同合并，最后进行减压回收95％乙醇溶液得路路通粗浸膏。加入纯水150ml，将粗浸膏放入超声波清洗器中超声40min使其充分溶解，得到路路通混合液。
56.s2.路路通石油醚部位的制备：
57.将上述步骤s1路路通混合液转入500ml的分液漏斗里面，量取与混悬液等量体积的石油醚进行萃取，一共萃取3次；萃取过程中每次需先震摇20min让其充分溶解分离，震摇完成后静置4h，静置过后减压回收石油醚，得石油醚部位萃取复合物。
58.s3.路路通二氯甲烷部位的制备：
59.量取等量体积的二氯甲烷对步骤s2处理后的路路通混合液进行萃取，一共萃取3
次；萃取过程中每次需先震摇20min让其充分溶解分离，震摇完成后静置4h，静置过后减压回收二氯甲烷，得二氯甲烷部位萃取复合物。
60.s4.路路通乙酸乙酯部位的制备：
61.量取等量体积的乙酸乙酯对步骤s3处理后的路路通混合液进行萃取，一共萃取3次；萃取过程中每次需先震摇20min让其充分溶解分离，震摇完成后静置4h，静置过后减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯部位萃取复合物。
62.s5.路路通正丁醇部位的制备：
63.量取等量体积的正丁醇对步骤s4处理后的路路通混合液进行萃取，一共萃取3次；萃取过程中每次需先震摇20min让其充分溶解分离，震摇完成后静置4h，静置过后减压回收正丁醇，得正丁醇部位萃取复合物。
64.s6.路路通水部位的制备：
65.将500ml分液漏斗里面的剩余水层部位减压回收，得水层复合物。
66.本实施例中复合物的制备，经济成本低廉、高效。
67.实施例2：最佳抑菌复合物的筛选
68.s1.大肠杆菌(e.coli)与金黄色葡萄球菌(s.aureus)菌液的制备：
69.分别取10g氯化钠10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉放置于1000ml烧杯中，使其充分溶解，再使用质量浓度为10％的氢氧化钠溶液调至其ph为7.0；倒入锥形瓶加入2％琼脂粉搅拌均匀；最后进行灭菌操作，灭菌完成后，在操作台里面倒入培养皿中等其完全冷却凝固后备用。
70.在无菌环境中用已经灼烧后的接种针分别挑取少量供试菌种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，在新制lb固体培养基上用平板划线法进行菌种活化，将其放在恒温培养箱中倒置培养24h、37℃。
71.从活化后的平板上挑取金黄色葡萄球菌或大肠杆菌单菌落，并接种在新制的lb液体培养基中，将其放置在37℃恒温摇床中震荡培养12h；将培养好的细菌浓度调节至1.5
×
108cfu/ml，然后稀释至1.0
×
106～1.0
×
107cfu/ml的细菌悬浮液。
72.s2.路路通萃取物抑菌圈的测定：
73.取石油醚部位萃取复合物、二氯甲烷部位萃取复合物、乙酸乙酯部位萃取复合物、正丁醇部位萃取复合物、水层复合物，分别用丙酮、纯水作为溶剂，制成五种100mg/ml药液。同时，使用打孔器将定性滤纸制作成直径为5mm的圆形滤纸片，高压灭菌后，备用。
74.吸取50μl金黄葡萄球菌、大肠杆菌溶液采用稀释涂布平板法均匀地涂在lb固体培养基上；把涂覆菌液后的各培养基分为4个区域，并将制作的圆形滤纸片粘贴在每个区域的中心；接着，按照不同药液对各培养基进行分组，并少量多次将相应的药液(30μl)、丙酮、水、卡那霉素分别喷洒在培养基的4个区域滤纸片上，随后将其放入恒温培养箱37℃、12h下倒置培养，观察各培养基滤纸片周围菌群生长抑制情况(对每组液体药物进行三个平行测试)；根据药液滤纸片周围的抑菌圈直径d大小初步筛选出最佳抑菌复合物。其中，根据药液滤纸片周围的抑菌圈直径d大小判断菌群对相应药液的敏感度，判定标准为：d≤8mm为不敏感，8mm《d≤13mm为低度敏感，13mm《d≤19mm为中度敏感，d》19mm为高度敏感；从各组培养基中选择菌群反应更敏感的药液作为初步确定的抑菌复合物。
75.s3.菌落形成单位实验(cfu)的测定：
76.取已培养好的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌液(od
600nm
＝0.5)取1ml菌液分装进1.5ml离心管中，在高速冷冻离心机中转速为3000rpm、5min的条件下离心。离心完成后，弃去上清液，再加入900μl的pbs(0.01m)缓冲液吹打混匀使其重新悬浮，再向管内加入100μl药物吹打混匀，最后放入恒温培养箱中孵育18-24h。待其孵育完成后，将菌液进行梯度稀释至10-5
，取稀释后的菌液100μl均匀地在lb固体平板上涂布，计数菌落总数，评价药物抑菌的抑菌活性，进一步确定最佳抑菌复合物。
77.本实施例中，不同抑菌部位抑菌圈的筛选结果如图1所示。由图1可知，各萃取部位只有乙酸乙酯部位显示出较好的抑菌结果，其中对于金黄色葡萄球菌(s.aureus)的抑菌直径可达11.8mm、对于大肠杆菌(e.coli)抑菌直径也可达10.2mm。由此可知，乙酸乙酯部位萃取复合物对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果要优于大肠杆菌。根据判定标准，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对乙酸乙酯部位萃取复合物表现出低度敏感，而对石油醚、二氯甲烷、正丁醇和水层部位均表现为不敏感。
78.不同部位萃取复合物的cfu菌落数如图2所示。结合图1和由图2可知，乙酸乙酯部位对于大肠杆菌(e.coli)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)的抑制效果最佳，其中大肠杆菌为3.5x10
6 cfu/ml、金黄色葡萄球菌为2x10
6 cfu/ml、相较于空白4.5x10
6 cfu/ml菌落数显著减少，这表明乙酸乙酯部位无论对革兰氏阴性细菌的大肠杆菌还是对革兰氏阳性细菌的金黄色葡萄球菌均有显著抑菌活性。
79.据此，“乙酸乙酯部位萃取复合物”为筛选出的最佳抑菌复合物。
80.实施例3：乙酸乙酯部位萃取复合物的抑菌验证
81.s1.路路通萃取各部位生长曲线测定：
82.采用比浊度法测定复合物生长曲线，在紫外分光光度计上测定菌悬液的吸光度值，通过吸光度来测定菌液浓度。首先将新制lb液体培养基50ml置于200ml的三角瓶内进行灭菌操作，灭菌完成后待其冷却后备用。每28支无菌试管为一组，分别使用黑色记号笔写上培养时间，即0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，备用。使用移液枪吸取适量(0.05
×
50
÷
菌体初始od值
×
1000)金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养液放入灭过菌的含有的50ml液体lb培养基的三角瓶中，并分别在药物组、对照组(阳性、阴性)中加入适量的药品轻轻震摇使金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、与lb液体培养基混合均匀，完成上述操作后分别吸取5ml混合液转入之前已标记好的7支无菌大试管中。将上述样品组、对照组(阳性、阴性)、空白组试管同一时间放进摇床在37℃下震荡培养，分别培养0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，将标有相应时间的试管及时取出，并置于600nm紫外分光光度计上测得。对于细菌密度大的培养液使用无菌的lb液体培养基加以合理稀释后再检测，使其光密度值在0.1-1之内，重复三次取其平均值。
83.s2.路路通萃取物最低抑菌浓度(mic)测定：
84.对其有抑菌活性的部位进行mic测定。最小抑菌浓度(mic)是指抑制微生物增长的最低药物浓度，本实验最佳抑菌部位为乙酸乙酯萃取部位，采用试管二倍稀释法，取无菌试管16支。分组编号后，将实验组中的8支试管中分别加入1ml lb液体培养基，在编号1试管中加入1ml路路通乙酸乙酯提取液(100mg/ml)，混匀后再吸至1ml至编号2试管中，与之相同倍比稀释至编号8试管，吹打混匀后编号8试管再丢弃1ml，此时试管内药液浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125mg/ml，编号8为不加药液的对照组管。对照组操作与实验组相同。使用移液枪吸取已经稀释(od
600nm
＝0.5)后的菌液100μl，依次加入到实验
组各管中并吹打混匀，混匀后置于37℃恒温摇床中进行震荡培养12h。以浑浊度为目标，以对照组为参考对象检查试管中细菌有无生长，以无细菌增长的编号管内的药液质量浓度为该实验组中最小抑菌浓度。
85.本实施中，乙酸乙酯复合物对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的生长曲线影响分别如图3a、图3b所示。由图3a和3b可知，空白组金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长曲线与丙酮组趋势相近，呈现典型的s型曲线，说明丙酮对于金黄色葡萄球菌不具备抑制作用；而卡那霉素组与乙酸乙酯组od值均低于空白组生长曲线od值，说明路路通乙酸乙酯萃取物对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌存在着显著的抑菌作用，其中对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果要明显高于大肠杆菌，这个结果与抑菌圈和cfu结果一致。
86.乙酸乙酯复合物对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的mic值影响如表1所示。实验组与对照组进行比浊观察，结果如表1所示，金黄色葡萄球菌7号管为浓度最低且未长菌的试管，故7号管所对应的浓度为最低抑菌浓度为1.5625mg/ml，然而大肠杆菌在第4号管浓度最低为最低抑菌浓度12.5mg/ml。
87.表1乙酸乙酯复合物对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的mic值影响
[0088][0089][0090]
实施例4：乙酸乙酯部位萃取复合物抑菌效果的体外验证及机理探究
[0091]
s1.体外抑菌形态变化机理探究：
[0092]
取对数生长期的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，接种于新鲜lb液体培养基中，分别在两种菌液中添加100、75、50、25mg/ml的药物作为加药组，不加药物的菌液作为空白组，置入恒温摇床，设定温度37℃，转速200rpm培养12h，取培养好的两组菌液，用移液枪吸取1ml的溶液，转速3 000rpm，离心5min，去除上清液，pbs缓冲溶液冲洗2遍，加入5％的戊二醛溶液对细菌进行固定过夜，再次使用pbs冲洗，去除沉淀中的戊二醛，随后分别利用30％、50％、70％、80％、95％和100％的乙醇，在4℃环境下进行持续20min的梯度脱水。处理过后的细菌经二氧化碳临界点干燥仪干燥，置于扫描电镜(sem)下观察形态。
[0093]
s2.活/死细菌染色：
[0094]
将对数生长期的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别按照1：40的比例将菌液重悬于新的lb液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养12h，加药组、空白组次日以3000rpm、5min对菌体进行离心收集，使用pbs缓冲液冲洗两遍(目的是去除培养基成分)，利用live/dead细菌试剂盒中的pi和syto9对收集的菌体在黑暗的环境下染色30min，再次使用pbs冲洗两遍(除去多余的染料)，最后将细菌重悬于一定体积的纯水中，取5μl菌体悬浮液置于载玻片，
在倒置荧光显微镜观察，绿色为活细菌，红色为死细菌。
[0095]
s3.体内抗菌活性的研究：
[0096]
本次实验采购昆明小白鼠30g左右作为样本，每只小鼠在鼠笼中单独喂养提供足够的食物和饮用水。小鼠腹腔注射1％戊巴比妥麻醉，剃净小鼠后背靠近臀部的毛，然后用75％酒精对小鼠左右皮肤进行消毒，然后用剪刀剪出直径约为2cm的近圆形皮肤伤口。从左右皮肤直径2cm处，左右伤口分别注射大肠杆菌和金黄葡萄球菌的pbs悬液(od
600nm
＝1，100μl)(注射深度5mm)。然后对小鼠进行尾静脉注射(路路通)乙酸乙酯提取液(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)治疗处理9天，每天观察小鼠伤口变化。
[0097]
本实施例中，乙酸乙酯复合物对于大肠杆菌(e.coli)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)的活/死染色结果分别如图4a、图4b所示。对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌使用syto9/pi染料进行染色，以进一步表征乙酸乙酯部位的抗菌活性。空白组中观察到大量绿色荧光，而经过乙酸乙酯部位处理后的细菌绿色荧光减少，并且随着药物浓度增加，红色荧光显著增加，表明乙酸乙酯部位的抗菌活性具有明显的药物浓度依赖性。
[0098]
添加不同浓度药物(乙酸乙酯部位萃取复合物)的金黄色葡萄球菌(s.aureus)、大肠杆菌(e.coli)菌液经处理后的扫描电镜(sem)结果如图5所示。如图5所示空白组的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌体细胞完整，而当加入路路通乙酸乙酯萃取部位处理后，细胞形态发生了褶皱变化，随着药物浓度的增加，细胞完整性被破坏，有内含物渗透出来，这必定会影响到细菌的生长、发育，从而达到抑制的作用。sem的结果表明，路路通乙酸乙酯萃取部位具有较强的抗菌活性，且其抗菌原理与破坏细菌完整性有关且具有明显的药物浓度依赖性。猜测：复合物通过破坏菌体的外壁以及繁殖能力来达到抑菌能力。
[0099]
乙酸乙酯部位萃取复合物处理后的细菌感染伤口及实验流程图如图6所示。结合图6与实际情况可知，小鼠创伤第2天，空白组与药物组处理的伤口开始结痂，感染组结痂程度最低。经过不断观察，仅有感染组的小鼠会延迟伤口的愈合状态。第3天发现空白组和药物组的创口处皮肤大面积结痂。手术第6天观察小鼠创口，发现空白组、药物组创面愈合且疤痕呈现皱缩迹象，手术第9天空白组、药物组基本完全愈合、左右创面基本恢复，结痂疤痕开始回卷。然而感染组未加入药物的小鼠伤口愈合程度却很低，伤口才开始干疤，可见愈合程度要明显低于(路路通)乙酸乙酯部位萃取复合物治疗的小鼠。综上可知，(路路通)乙酸乙酯部位萃取复合物可以有效地在体内抗菌。
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此外，还进行了小鼠菌血症模型实验，图7为菌血症模型实验示意图。实验结果为：空白组器官形态正常，而感染组组的小鼠在处理后第5天下午死亡，即刻解剖小鼠，发现小鼠的主要器官心、肝、肾、脾和肺出现明显异常，导致这些异常是由于细菌进入血液，引起炎症和器官损伤，甚至出现黑色坏死。路路通乙酸乙酯提取液处理的小鼠器官形态正常，与空白组结果类似。实验结果表明，(路路通)乙酸乙酯部位萃取复合物能杀死体内的金黄葡萄球菌和大肠杆菌，对就金黄葡萄球菌和大肠杆菌引起的菌感染均有治疗作用。
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以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种路路通萃取物的抑菌筛选方法，其特征在于，将路路通粉碎加入乙醇加热回流，每次回流两小时；合并收集的液体经减压回收得到路路通粗浸膏，再将粗浸膏加入纯水充分溶解，并依次与石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇相萃取，剩余水层减压回收，最终得到五种不同部位的萃取复合物；将不同复合物分别与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌进行抑菌筛选，通过抑菌圈、cfu筛选出最佳抑菌复合物。2.根据权利要求1所述的路路通萃取物的抑菌筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)路路通混合液的制备称取路路通药材粉碎过筛，粉末放入烧瓶，使用体积浓度为95％乙醇溶液在恒温水浴锅95℃条件下进行加热回流提取；一共提取两次，最后合并滤液进行减压回收，得路路通粗浸膏；加入纯水放入超声混悬得到路路通混合液；(2)路路通石油醚部位的制备将步骤(1)获得的路路通混合液转入分液漏斗，量取等量体积的石油醚进行充分震荡混悬溶解，一共萃取3次，每次静置4h后减压回收石油醚，得石油醚部位萃取复合物；(3)路路通二氯甲烷部位的制备量取等量体积的二氯甲烷对步骤(2)处理后的路路通混合液进行萃取，一共萃取3次，每次静置4h后减压回收二氯甲烷，得二氯甲烷部位萃取复合物；(4)路路通乙酸乙酯部位的制备量取等量体积的乙酸乙酯对步骤(3)处理后的路路通混合液进行萃取，一共萃取3次，每次静置4h后减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯部位萃取复合物；(5)路路通正丁醇部位的制备量取等量体积的正丁醇对步骤(4)处理后的路路通混合液进行萃取，一共萃取3次，每次静置4h后减压回收正丁醇，得正丁醇部位萃取复合物；(6)路路通水部位的制备将分液漏斗里面的剩余水层部位减压回收，得水层复合物；(7)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌液的制备用接种针分别挑取供试菌种-金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，用平板划线法进行菌种活化，恒温培养箱中倒置培养24h、37℃；从活化后的平板上挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌单菌落，分别接种在lb液体培养基中得到相应菌悬液备用；(8)路路通萃取物抑菌圈的测定取石油醚部位萃取复合物、二氯甲烷部位萃取复合物、乙酸乙酯部位萃取复合物、正丁醇部位萃取复合物、水层复合物，分别用丙酮、纯水作为溶剂制成五种药液；同时，使用打孔器制作圆形滤纸片灭菌，备用；分别吸取步骤(7)获得的两种菌悬液涂在lb固体培养基上；把涂覆菌液后的各培养基分为4个区域，并将制作的圆形滤纸片粘贴在每个区域的中心；按照不同药液对各培养基进行分组，并将相应的药液、丙酮、水、卡那霉素分别喷洒在培养基的4个区域滤纸片上，接着放入恒温培养箱37℃、12h下倒置培养，观察各培养基滤纸片周围菌群生长抑制情况；根据药液滤纸片周围的抑菌圈直径d大小初步筛选出最佳抑菌复合物；(9)菌落形成单位实验cfu的测定将培养好的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌液分装进离心管中，离心弃上清液，缓冲液吹
打混匀重悬，分别加入不同药物混匀放入培养箱中孵育；待其孵育完成后，将对应菌液进行梯度稀释，取稀释后的菌液涂布于lb固体平板上，计数菌落总数，评价药物抑菌的抑菌活性，进一步确定最佳抑菌复合物。3.根据权利要求2所述的路路通萃取物的抑菌筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中，称取路路通药材粉碎过筛时，过60目筛三次；加热回流提取时，料液比分别是1：10与1：8。4.根据权利要求2所述的路路通萃取物的抑菌筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)～(6)中，每次萃取加入等量体积的萃取液，也就是150ml加入分液漏斗分别进行萃取，萃取前需要震荡20min让其充分溶解。5.根据权利要求2所述的路路通萃取物的抑菌筛选方法，其特征在于，所述步骤(7)中，将培养好的细菌浓度调节至1.5
×
108cfu/ml，然后稀释至1.0
×
106～1.0
×
107cfu/ml的细菌悬浮液。6.根据权利要求2所述的路路通萃取物的抑菌筛选方法，其特征在于，所述步骤(8)中，制作药液时：称取石油醚部位萃取复合物、二氯甲烷部位萃取复合物、乙酸乙酯部位萃取复合物、正丁醇部位萃取复合物、水层复合物，用丙酮、纯水作为溶剂制成100mg/ml药液；喷洒药液时：以少量多次的形式将30μl药液喷洒在各区域滤纸片上。同时，所述步骤(8)中，根据药液滤纸片周围的抑菌圈直径d大小判断菌群对相应药液的敏感度，判定标准为：d≤8mm为不敏感，8mm<d≤13mm为低度敏感，13mm<d≤19mm为中度敏感，d>19mm为高度敏感；从各组培养基中选择菌群反应更敏感的药液作为初步确定的抑菌复合物。7.根据权利要求2所述的路路通萃取物的抑菌筛选方法，其特征在于，所述步骤(9)中，取od
600nm
＝0.5的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌液；在超净工作台中取1ml菌液分装进1.5ml离心管中，在高速冷冻离心机中转速为3000rpm的条件下离心5min；弃上清加入900μl的0.01m pbs缓冲液吹打混匀，使其重新悬浮；待其孵育完成后，将菌液进行梯度稀释至10-5
，取稀释后的菌液100μl均匀地在lb固体平板上涂布，计数菌落总数，评价药物抑菌的抑菌活性。8.根据权利要求2所述的路路通萃取物的抑菌筛选方法，其特征在于，最终筛选出的最佳抑菌复合物为乙酸乙酯部位萃取复合物。9.根据权利要求2所述的路路通萃取物的抑菌筛选方法，其特征在于，当确定最佳抑菌复合物后，还包括如下的步骤(10)和(11)：(10)最佳抑菌复合物的生长曲线测定采用比浊度法测定复合物生长曲线，在紫外分光光度计上测定菌悬液的吸光度值，通过吸光度来测定菌液浓度；每28支无菌试管为一组，分别使用黑色记号笔写上培养时间；使用移液枪吸取适量金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养液放入灭过菌的含有的50ml液体lb培养基的三角瓶中，并分别在药物组、对照组中加入适量的药品轻轻震摇使金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、与lb液体培养基混合均匀；完成上述操作后，分别吸取5ml混合液转入之前已标记好的7支无菌大试管中；将上述样品组、对照组、空白组试管同一时间放进摇床在37℃下震荡培养，分别培养0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，然后分别置于600nm紫外分光光度计上测得上测得；对于吸光度大的培养液使用液体培养基合理稀释后再检测，使其光密度值在0.1-1之内，重复三次取其平均值；
(11)最佳抑菌复合物的最低抑菌浓度mic测定对其有抑菌活性的部位进行mic测定；最小抑菌浓度mic是指抑制微生物增长的最低药物浓度，取前面步骤筛选确定的最佳抑菌复合物，采用试管二倍稀释法，取无菌试管16支；分组编号后，将实验组中的8支试管中分别加入1ml lb液体培养基，在编号1试管中加入1ml100 mg/ml的最佳抑菌复合物，混匀后再吸至1ml至编号2试管中，与之相同倍比稀释至编号8试管，吹打混匀后编号8试管再丢弃1ml，此时试管内药液浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125mg/ml，编号8为不加药液的对照组管；对照组操作与实验组相同；使用移液枪吸取已经稀释后的od
600nm
＝0.5菌液100μl，依次加入到实验组各管中并吹打混匀，混匀后置于37℃恒温摇床中进行震荡培养12h；以浑浊度为目标，以对照组为参考对象检查试管中细菌有无生长，以无细菌增长的编号管内的药液质量浓度为该实验组中最小抑菌浓度。10.一种如权利要求1～9任一所述的路路通萃取物的抑菌筛选方法在开发新型天然草本抑菌药品方面的应用。

技术总结
本发明提供了一种路路通萃取物的抑菌筛选方法，将路路通粉碎加入乙醇加热回流；合并收集的液体经减压回收得到路路通粗浸膏，再将粗浸膏加入纯水充分溶解，并依次与石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇相萃取，剩余水层减压回收，最终得到不同部位的萃取复合物；将不同复合物分别与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌进行抑菌筛选，通过抑菌圈、CFU筛选出最佳抑菌复合物。本发明还提供了上述筛选方法在开发新型天然草本抑菌药品方面的应用。本发明的优点在于：利用植物药材路路通获得五种萃取复合物，并通过对该五种复合物的抑菌筛选最终获得具有最佳抑菌效果的路路通抑菌复合物；该抑菌复合物可作为新型天然草本抑菌药品，用于中医皮肤医疗行业。肤医疗行业。肤医疗行业。


技术研发人员：刘海萍 汪维云 孙冬冬 任凯 陈慧龙 杨恩东 郭峰 刘静
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/9/23