一种高细菌检测特异性的ATP荧光检测拭子及其使用方法

一种高细菌检测特异性的atp荧光检测拭子及其使用方法
技术领域
1.本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种高细菌检测特异性的atp荧光检测拭子及其使用方法。


背景技术：

2.当前，食源性致病菌正对人体安全健康构成持续性威胁。食品中常见的致病菌包括沙门氏菌(salmonella species)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，s.aureus)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa.p.aeruginosa)、肠杆菌(enterobacter species)等细菌，常分布在肉制品、蛋制品、乳制品、蔬菜等食物当中，常以食物中毒的方式威胁人体健康。目前常用的检测方法检测时间较长，常常会延误最佳诊疗时间，因此开发现场快速检测的设备以进行检测、识别和监控食品中致病菌的即时指标非常重要。
3.灵敏的检测方法和有效的干预措施在减少食源性致病菌的流行中起着至关重要的作用。传统的检测食源性致病菌的诊断方法包括培养法，酶联免疫吸附测定法(elisa)以及与酶辅助dna扩增方法偶联的基因测序，如聚合酶链反应(pcr)等，传统方法检测速度慢，检测步骤繁琐，并且多需要实验室仪器实现检测。上述技术虽然为食品中的常见致病菌检测提供了标准，但是为了有效地预防和控制突发公共卫生事件，防止食物中毒事故和食源疾患的发生，它们无法满足现场快速诊断以对病情进行有效控制及各种分析的不同要求。因此，需要建立一种可以实现对食源性致病菌进行快速鉴别与定量分析的现场检测手段。
4.为了改进传统策略的弊端，常引入适配体/抗体功能化的纳米信号标签用于检测食源性致病菌和放大信号。常用的适配体/抗体分子成本高，不同厂家之间生产的抗体批次间差异大，不利于走向现场快速检测，此外，适配体具有可逆的折叠特性和低免疫原性，这限制了其广泛应用。因此需要低成本，稳定和灵敏的致病菌检测方法。
5.由于atp只存在于活的细菌中，因此atp生物发光法被广泛认为是检测活细菌的良好选择。在氧气和mg
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的存在下，atp为荧光素提供能量，引起由荧光素酶催化的生物发光(bl)反应。生物发光信号与裂解细菌释放的atp量成正比，可以对活菌进行高灵敏度和高效的检测。同时，生物发光还表现出无需激发的自发光、快速分析、高信号噪声比和灵敏度等显著优势。此外，它还可以应用于成像，实现直观和准确的观察。然而，atp存在于各种活菌中，缺乏对细菌种类的识别能力。基于atp的bl检测不能确定目标菌与其他种类的细菌。为了提高bl的选择性，制造特异性探针对于实现对目标菌的检测至关重要。
6.噬菌体是侵袭细菌的病毒。相较于抗体、适配体，它们对细菌菌株有更强的选择性和结合亲和力，并对宿主细菌具有天然的特异性，能随细菌的变异而变异，可以用于细菌的鉴定和分型。此外，它们对温度、ph值和离子强度的波动比适配体和抗体更稳定。因此，噬菌体是构建高特异性和高灵敏度的病原体细菌生物传感器的理想生物受体。
7.综上所述，噬菌体与生物发光器件的集成在生化传感领域具有非常重要的应用价值。在未来，便携式生物传感器件的主要研究方向仍将是集成、小型化、便携式、高通量和多
功能，实现自动化分析和现场实时测量。两者结合可突破灵敏度低、耗时、步骤繁琐、准确率低等瓶颈，向低成本、易操作和产业化方向发展，应用于食源性致病菌的现场诊断分析，具有广阔的产业化前景。因此，发展一种用于食源性致病菌检测的灵敏度高、检测特异性高、测试时间短、操作简便、成本低的细菌富集搅拌棒-拭子便携式器件成为本领域亟需解决的问题。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种高细菌检测特异性的atp荧光检测拭子及其使用方法。本发明的检测拭子通过定向的噬菌体修饰的搅拌棒提取和生物增殖协同增强，能够快速捕获和富集食源性致病菌，操作简便且成本低、安全系数高、灵敏度高和测试时间短。
9.为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
10.本发明提供了一种高细菌检测特异性的atp荧光检测拭子，包括细菌富集搅拌棒和拭子外壳，所述细菌富集搅拌棒的制备方法，包括如下步骤：
11.(1)将聚二甲基硅氧烷搅拌棒插入金属有机框架zif-90纳米颗粒中，进行金属有机框架材料修饰；
12.(2)将所述金属有机框架材料修饰后的聚二甲基硅氧烷搅拌棒插入噬菌体混合溶液中进行噬菌体修饰；
13.(3)将所述噬菌体修饰后的聚二甲基硅氧烷搅拌棒用牛血清白蛋白溶液封闭，得到细菌富集搅拌棒。
14.优选的，所述拭子外壳包括拭子头部、密封棒、进液通道、搅拌棒卡槽和密封外壳；
15.所述拭子头部为一空腔，所述密封棒位于拭子头部的空腔内；
16.所述密封棒一端封闭，另一端伸出拭子头部与进液通道密封连接；
17.所述进液通道的另一端设置有搅拌棒卡槽；
18.所述细菌富集搅拌棒包括中空的棒体和棒头，所述中空的棒体靠近棒头的位置具有出液孔；
19.所述细菌富集搅拌棒远离棒头的一端与所述搅拌棒卡槽卡接；
20.所述密封外壳位于所述进液通道和所述细菌富集搅拌棒的外部，且两部分的密封外壳可拆卸连接；
21.所述拭子头部装有ph为5.5～6.5的荧光素和荧光素酶的混合液。
22.优选的，所述聚二甲基硅氧烷搅拌棒是将所述中空的棒体插入聚二甲基硅氧烷和固化剂乳化后的乳化液中，经固化得到；
23.所述聚二甲基硅氧烷与固化剂的质量比为(8～12)：1；所述聚二甲基硅氧烷和固化剂的总质量与水的质量比为(1～2)：1；所述乳化的转速为500～1000rpm，时间为4～6min；
24.所述中空的棒体插入所述乳化液中的深度为2～5cm；
25.所述固化的温度为100～150℃，所述固化的时间为40～60min。
26.优选的，所述金属有机框架zif-90纳米颗粒的制备方法为：将二水合醋酸锌的dmf溶液与咪唑-2-甲醛的dmf溶液混合反应，得到金属有机框架zif-90纳米颗粒。
27.优选的，所述二水合醋酸锌的dmf溶液中二水合醋酸锌的浓度为0.2～0.6m，所述
咪唑-2-甲醛的dmf溶液中咪唑-2-甲醛的浓度为0.4～1.2m；所述二水合醋酸锌的dmf溶液与咪唑-2-甲醛的dmf溶液的体积比为(6-10)：(6-10)；
28.所述反应的转速为3000～5000r/min，时间为5～15min。
29.优选的，所述金属有机框架材料修饰的时间为5～15min。
30.优选的，所述噬菌体混合溶液由噬菌体溶液和交联剂溶液混合得到的；所述噬菌体混合溶液的ph为6～8；
31.所述噬菌体溶液的浓度为104～109cfu/ml；所述交联剂溶液为n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照3～5：1的摩尔比混合得到；
32.所述噬菌体溶液与所述交联剂溶液的体积比为(2～3)：1；
33.所述噬菌体修饰的温度为15～35℃，时间为15～60min。
34.优选的，所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度为3～7％；所述封闭的温度为15～25℃，时间为5～12h。
35.本发明还提供了一种上述atp荧光检测拭子的非诊断目的的使用方法，包括如下步骤：
36.(1)将细菌富集搅拌棒与待测样品接触取样；
37.(2)将接触取样后的细菌富集搅拌棒插入lb肉汤中进行细菌培养；
38.(3)所述细菌培养结束后，套上密封外壳，折断密封棒，挤压拭子头部，使所述混合液沿着进液通道流入细菌富集搅拌棒的中空的棒体，并从出液孔流出，与细菌富集搅拌棒接触，进行荧光反应；
39.(4)借助atp荧光检测仪进行荧光测定。
40.优选的，步骤(2)所述细菌培养的时间为5～15min；步骤(3)所述荧光反应的时间为10～15s。
41.本发明提供了一种高细菌检测特异性的atp荧光检测拭子及其使用方法，该检测拭子由细菌富集搅拌棒和装有酸性检测混合酶液的拭子外壳通过简单操作合成，并且搅拌棒通过zif-90纳米涂层将原搅拌棒的二维表面改进为三维表面为后续噬菌体的修饰提供了更多的结合位点，极大提升了特异性识别能力和定量分析的准确性；通过定向的噬菌体修饰的搅拌棒提取和生物增殖协同增强，可进行食源性致病菌的定量检测，捕获的食源性致病菌在lb培养基中浸泡10分钟后可显著增殖，进行信号放大以提高现场检测的灵敏度，通过掰断拭子头部，酸性检测混合酶液被释放，酸性分子插入zif-90中的zn-n键内，随后质子化的咪唑配体从框架结构中解离，使zif-90的结构崩塌，释放出大量的zn
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，随即与噬菌体协同作用，破碎细菌释放出atp与荧光素、荧光素酶结合，最后，用便携式atp生物发光仪定量检测atp，检测时间在30分钟内。本发明的检测拭子适用于现场检测活的细菌，在30分钟内具有3cfu/ml的低检测限。此外，本发明所采用的酸性检测酶液为液态稳定试剂，方便易用，能够保证准确、发光信号持续时间长和重复性好的检测结果。
42.本发明的atp荧光检测拭子是一种一体化的快速检测、样品采集和反应装置，配套atp荧光检测仪使用，不需要大型的实验室检测设备，简单便携，且检测方法操作简单，测试时间短，适合现场测试，为食源性致病菌的即时检测(poct)提供了新的途径，有望推广到具有相应噬菌体的毒力菌株的检测中。
附图说明
43.图1为实施例1中细菌富集搅拌棒的制备流程图。
44.图2为实施例1制备的atp荧光检测拭子的实品图和结构示意图。
45.图3为实施例2中不同浓度s.a与atp生物发光强度关系的分析结果图。
具体实施方式
46.本发明提供了一种高细菌检测特异性的atp荧光检测拭子，包括细菌富集搅拌棒和拭子外壳，所述细菌富集搅拌棒的制备方法，包括如下步骤：
47.(1)将聚二甲基硅氧烷搅拌棒插入金属有机框架zif-90纳米颗粒中，进行金属有机框架材料修饰；
48.(2)将所述金属有机框架材料修饰后的聚二甲基硅氧烷搅拌棒插入噬菌体混合溶液中进行噬菌体修饰；
49.(3)将所述噬菌体修饰后的聚二甲基硅氧烷搅拌棒用牛血清白蛋白溶液封闭，得到细菌富集搅拌棒。
50.在本发明中，所述拭子外壳优选包括拭子头部、密封棒、进液通道、搅拌棒卡槽和密封外壳。
51.在本发明中，所述拭子头部优选为空腔结构，所述密封棒位于拭子头部的空腔内。
52.在本发明中，所述密封棒优选一端封闭，另一端伸出拭子头部与进液通道密封连接。
53.在本发明中，所述进液通道的另一端优选设置有搅拌棒卡槽。
54.在本发明中，所述细菌富集搅拌棒优选包括中空的棒体和棒头。
55.在本发明中，所述中空的棒体优选靠近棒头的位置具有出液孔。
56.在本发明中，所述细菌富集搅拌棒优选远离棒头的一端与所述搅拌棒卡槽卡接。
57.在本发明中，所述密封外壳优选位于所述进液通道和所述细菌富集搅拌棒的外部，且两部分的密封外壳可拆卸连接。
58.在本发明中，所述拭子头部优选装有荧光素和荧光素酶的混合液。
59.在本发明中，所述混合液的ph优选为5.5～6.5，进一步优选为6.0。
60.在本发明中，所述聚二甲基硅氧烷搅拌棒优选是将所述中空的棒体插入聚二甲基硅氧烷和固化剂乳化后的乳化液中，经固化得到的。
61.在本发明中，所述聚二甲基硅氧烷与固化剂的质量比优选为(8～12)：1，进一步优选为10：1。
62.在本发明中，所述聚二甲基硅氧烷和固化剂的总质量与水的质量比优选为(1～2)：1；进一步优选为2：1。
63.在本发明中，所述乳化的转速优选为500～1000rpm，进一步优选为800rpm。
64.在本发明中，所述乳化的时间优选为4～6min，进一步优选为5min。
65.在本发明中，所述中空的棒体插入所述乳化液中的深度优选为2～5cm，进一步优选为3cm。
66.在本发明中，所述中空的棒体的横截面直径优选为2～6mm，进一步优选为2.5mm。
67.在本发明中，所述中空的棒体的厚度优选为1～2mm，进一步优选为1mm。
68.在本发明中，所述中空的棒体的长度优选为8～15cm，进一步优选为10cm。
69.在本发明中，所述固化的温度优选为100～150℃，进一步优选为125℃。
70.在本发明中，所述固化的时间优选为40～60min，进一步优选为60min。
71.在本发明中，所述金属有机框架zif-90纳米颗粒的制备方法优选为：将二水合醋酸锌的dmf溶液与咪唑-2-甲醛的dmf溶液混合反应，得到金属有机框架zif-90纳米颗粒。
72.在本发明中，所述二水合醋酸锌的dmf溶液中二水合醋酸锌的浓度优选为0.2～0.6m，进一步优选为0.5m。
73.在本发明中，所述咪唑-2-甲醛的dmf溶液中咪唑-2-甲醛的浓度优选为0.4～1.2m，进一步优选为1.0m。
74.在本发明中，所述二水合醋酸锌的dmf溶液与咪唑-2-甲醛的dmf溶液的体积比优选为(6～10)：(6～10)；进一步优选为10：10。
75.在本发明中，所述反应的转速优选为3000～5000r/min，进一步优选为4000r/min。
76.在本发明中，所述反应的时间优选为5～15min，进一步优选为10min。
77.在本发明中，所述反应完成后，还优选加入dmf来稳定反应后产物的结构。
78.在本发明中，所述dmf的加入量与所述二水合醋酸锌的dmf溶液的体积比优选为(20～40)：(6～10)，进一步优选为40：10。
79.在本发明中，所述加入dmf后，还优选进行离心、纯化、干燥。
80.在本发明中，所述离心的转速优选为8000～12000r/min，进一步优选为10000r/min。
81.在本发明中，所述离心的时间优选为5～10min，进一步优选为8min。
82.在本发明中，所述纯化优选包括dmf洗涤和无水乙醇洗涤。
83.在本发明中，所述dmf洗涤的次数优选为1～2次，进一步优选为1次。
84.在本发明中，所述无水乙醇洗涤的次数优选为2～4次，进一步优选为2次。
85.在本发明中，所述干燥的温度优选20～25℃，进一步优选为25℃。
86.在本发明中，所述干燥的时间优选为18～36h，进一步优选为24h。
87.在本发明中，所述干燥的真空度优选为-0.1mpa。
88.在本发明中，所述金属有机框架材料修饰的时间优选为5～15min，进一步优选为10min。
89.在本发明中，所述噬菌体混合溶液优选由噬菌体溶液和交联剂溶液混合得到的。
90.在本发明中，所述噬菌体混合溶液的ph优选为6～8，进一步优选为6.5。
91.在本发明中，所述噬菌体溶液的浓度优选为104～109cfu/ml，进一步优选为107cfu/ml。
92.在本发明中，所述交联剂溶液优选为n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照3～5：1的摩尔比混合得到，进一步优选为n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照4：1的摩尔比混合得到。
93.在本发明中，所述噬菌体溶液与所述交联剂溶液的体积比优选为(2～3)：1，进一步优选为2.5：1。
94.在本发明中，所述噬菌体修饰的温度优选为15～35℃，进一步优选为25℃。
95.在本发明中，所述噬菌体修饰的时间优选为15～60min，进一步优选为20min。
96.在本发明中，所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度优选为3～7％，进一步优选5％。
97.在本发明中，所述封闭的温度优选为15～25℃，进一步优选为25℃。
98.在本发明中，所述封闭的时间优选为5～12h，进一步优选8h。
99.本发明还提供了一种上述atp荧光检测拭子的非诊断目的的使用方法，包括如下步骤：
100.(1)将细菌富集搅拌棒与待测样品接触取样；
101.(2)将接触取样后的细菌富集搅拌棒插入lb肉汤中进行细菌培养；
102.(3)所述细菌培养结束后，套上密封外壳，折断密封棒，挤压拭子头部，使所述混合液沿着进液通道流入细菌富集搅拌棒的中空的棒体，并从出液孔流出，与细菌富集搅拌棒接触，进行荧光反应；
103.(4)借助atp荧光检测仪进行荧光测定。
104.在本发明中，步骤(2)所述细菌培养的时间优选为5～15min，进一步优选为10min。
105.在本发明中，步骤(3)所述荧光反应的时间优选为10～15s，进一步优选为15s。
106.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
107.实施例1
108.本实施例提供了一种高细菌检测特异性的atp荧光检测拭子，包括细菌富集搅拌棒和拭子外壳。其中，细菌富集搅拌棒的具体制备过程如下：
109.细菌富集搅拌棒的制备流程如图1所示。将聚二甲基硅氧烷和pdms固化剂以10：1的质量比混匀，再按照聚二甲基硅氧烷和pdms固化剂总质量：去离子水＝2:1的质量比，在聚二甲基硅氧烷和pdms固化剂的混合物中加入去离子水，在800rpm下高速涡旋5min，使其乳化形成稳定的油包水型乳化液。取该乳化液1.3ml倒入1.5ml离心管中，将横截面积直径为2.5mm、长度为10cm、厚度为1mm的中空棒体，插入乳化液3cm深，在125℃温度下固化60min，得到聚二甲基硅氧烷搅拌棒。
110.取10ml二水合醋酸锌(0.5m)的dmf溶液倒入10ml咪唑-2-甲醛(1.0m)的dmf溶液中，在室温下以4000r/min搅拌10min后，加入40mldmf，来稳定反应产物的结构，然后以10000r/min离心8min，收集纳米颗粒，并用dmf洗涤一次，然后依次用无水乙醇洗涤2次。收集纳米颗粒，在室温(25℃)下真空(-0.1mpa)干燥24h，得到金属有机框架zif-90纳米颗粒。将聚二甲基硅氧烷搅拌棒插入zif-90纳米颗粒中10min，使棒体搅拌黏附纳米颗粒，形成纳米涂层，得到金属有机框架材料修饰后的聚二甲基硅氧烷搅拌棒。
111.取5ml浓度为108cfu/ml的噬菌体溶液，加入2ml交联剂(edc：nhs按照摩尔比4：1配置得到)，得到噬菌体混合溶液，调ph为6.5。在25℃下，将金属有机框架材料修饰后的聚二甲基硅氧烷搅拌棒浸泡于噬菌体混合溶液中20min，进行噬菌体修饰。然后用pbs缓冲溶液清洗棒体后，用质量浓度为5％牛血清白蛋白溶液在25℃下，封闭8h。封闭结束后用pbs缓冲溶液清洗，即可得到细菌富集搅拌棒。
112.购买样板改装拭子外壳，本实施例所用的拭子外壳包括拭子头部、密封棒、进液通道、搅拌棒卡槽和密封外壳；拭子头部为一空腔，密封棒位于拭子头部的空腔内；密封棒一端封闭，另一端伸出拭子头部与进液通道密封连接；进液通道的另一端设置有搅拌棒卡槽；细菌富集搅拌棒包括中空的棒体和棒头，中空的棒体靠近棒头的位置具有出液孔；细菌富
集搅拌棒远离棒头的一端与所述搅拌棒卡槽卡接；密封外壳位于所述进液通道和所述细菌富集搅拌棒的外部，且两部分的密封外壳可拆卸连接；拭子头部装有ph为5.5～6.5的荧光素和荧光素酶的混合液。
113.将细菌富集搅拌棒与拭子外壳组装，即可得到高细菌检测特异性的atp荧光检测拭子(如图2所示)。
114.实施例2
115.本实施例以金黄色葡萄球菌(s.a)为模拟检测对象，对实施例1制备的atp荧光检测拭子的检测能力进行测定，具体过程如下：
116.分别配置101～105cfu
·
ml-1
的浓度范围内的金黄色葡萄球菌菌液，为待测样品。将冷藏条件下的拭子在室温下放置约20分钟。轻旋套在细菌富集搅拌棒外部的密封外壳，将其拔出(切勿直接将密封外壳拔出)，露出细菌富集搅拌棒。将细菌富集搅拌棒插入待测样品中取样，15min后拿出。将取样后的细菌富集搅拌棒插入2ml lb肉汤培养10分钟，用pbs缓冲溶液洗去多余的肉汤后，重新套上密封外套，放置2分钟。将密封棒折断，挤压拭子头部，使其中所储存的荧光素和荧光素酶的混合液(ph＝6.0)沿着进液通道流入细菌富集搅拌棒的中空的棒体，并从出液孔流出，与细菌富集搅拌棒接触，摇晃拭子底部约3秒(折断后的拭子必须在30秒内放入仪器检测)。将拭子快速放入atp荧光检测仪，摁下ok键，15秒后即可读数。
117.统计各浓度的待测样品的检测结果，分析不同浓度s.a与atp生物发光强度之间的关系，分析结果如图3所示。可以看出，在101～105cfu
·
ml-1
的浓度范围内，拟合的线性回归方程为：i＝24.659log[c
s.a
]+89.092(r2＝0.994)。用3δ法计算出本发明检测拭子的检测限(lod)为3cfu ml-1
。
[0118]
由以上实施例可知，本发明的高细菌检测特异性的atp荧光检测拭子的高选择性，使得对浓度为101～105cfu
·
ml-1
的金黄色葡萄球菌都具有良好的灵敏度，适合实际的现场快速检测，具有检测时间短、操作简单、特异性强的优点。同时，本发明的制备工艺简单，无需采用大型设备，反应条件温和，具有成本低，环境友好的优点。
[0119]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种高细菌检测特异性的atp荧光检测拭子，包括细菌富集搅拌棒和拭子外壳，其特征在于，所述细菌富集搅拌棒的制备方法，包括如下步骤：(1)将聚二甲基硅氧烷搅拌棒插入金属有机框架zif-90纳米颗粒中，进行金属有机框架材料修饰；(2)将所述金属有机框架材料修饰后的聚二甲基硅氧烷搅拌棒插入噬菌体混合溶液中进行噬菌体修饰；(3)将所述噬菌体修饰后的聚二甲基硅氧烷搅拌棒用牛血清白蛋白溶液封闭，得到细菌富集搅拌棒。2.根据权利要求1所述的atp荧光检测拭子，其特征在于，所述拭子外壳包括拭子头部、密封棒、进液通道、搅拌棒卡槽和密封外壳；所述拭子头部为一空腔，所述密封棒位于拭子头部的空腔内；所述密封棒一端封闭，另一端伸出拭子头部与进液通道密封连接；所述进液通道的另一端设置有搅拌棒卡槽；所述细菌富集搅拌棒包括中空的棒体和棒头，所述中空的棒体靠近棒头的位置具有出液孔；所述细菌富集搅拌棒远离棒头的一端与所述搅拌棒卡槽卡接；所述密封外壳位于所述进液通道和所述细菌富集搅拌棒的外部，且两部分的密封外壳可拆卸连接；所述拭子头部装有ph为5.5～6.5的荧光素和荧光素酶的混合液。3.根据权利要求2所述的atp荧光检测拭子，其特征在于，所述聚二甲基硅氧烷搅拌棒是将所述中空的棒体插入聚二甲基硅氧烷和固化剂乳化后的乳化液中，经固化得到；所述聚二甲基硅氧烷与固化剂的质量比为(8～12)：1；所述聚二甲基硅氧烷和固化剂的总质量与水的质量比为(1～2)：1；所述乳化的转速为500～1000rpm，时间为4～6min；所述中空的棒体插入所述乳化液中的深度为2～5cm；所述固化的温度为100～150℃，所述固化的时间为40～60min。4.根据权利要求3所述的atp荧光检测拭子，其特征在于，所述金属有机框架zif-90纳米颗粒的制备方法为：将二水合醋酸锌的dmf溶液与咪唑-2-甲醛的dmf溶液混合反应，得到金属有机框架zif-90纳米颗粒。5.根据权利要求4所述的atp荧光检测拭子，其特征在于，所述二水合醋酸锌的dmf溶液中二水合醋酸锌的浓度为0.2～0.6m，所述咪唑-2-甲醛的dmf溶液中咪唑-2-甲醛的浓度为0.4～1.2m；所述二水合醋酸锌的dmf溶液与咪唑-2-甲醛的dmf溶液的体积比为(6-10)：(6-10)；所述反应的转速为3000～5000r/min，时间为5～15min。6.根据权利要求5所述的atp荧光检测拭子，其特征在于，所述金属有机框架材料修饰的时间为5～15min。7.根据权利要求6所述的atp荧光检测拭子，其特征在于，所述噬菌体混合溶液由噬菌体溶液和交联剂溶液混合得到的；所述噬菌体混合溶液的ph为6～8；所述噬菌体溶液的浓度为104～109cfu/ml；所述交联剂溶液为n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照3～5：1的摩尔比混合得到；
所述噬菌体溶液与所述交联剂溶液的体积比为(2～3)：1；所述噬菌体修饰的温度为15～35℃，时间为15～60min。8.根据权利要求7所述的atp荧光检测拭子，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度为3～7％；所述封闭的温度为15～25℃，时间为5～12h。9.一种权利要求2～8任一项所述atp荧光检测拭子的非诊断目的的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将细菌富集搅拌棒与待测样品接触取样；(2)将接触取样后的细菌富集搅拌棒插入lb肉汤中进行细菌培养；(3)所述细菌培养结束后，套上密封外壳，折断密封棒，挤压拭子头部，使所述混合液沿着进液通道流入细菌富集搅拌棒的中空的棒体，并从出液孔流出，与细菌富集搅拌棒接触，进行荧光反应；(4)借助atp荧光检测仪进行荧光测定。10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，步骤(2)所述细菌培养的时间为5～15min；步骤(3)所述荧光反应的时间为10～15s。

技术总结
本发明提供了一种高细菌检测特异性的ATP荧光检测拭子及其使用方法，属于微生物检测技术领域。本发明的检测拭子包括细菌富集搅拌棒和拭子外壳，所述细菌富集搅拌棒的制备方法，包括：将聚二甲基硅氧烷搅拌棒插入金属有机框架ZIF-90纳米颗粒中，进行金属有机框架材料修饰；将所述金属有机框架材料修饰后的聚二甲基硅氧烷搅拌棒插入噬菌体混合溶液中进行噬菌体修饰；将所述噬菌体修饰后的聚二甲基硅氧烷搅拌棒用牛血清白蛋白溶液封闭，得到细菌富集搅拌棒。本发明的检测拭子通过定向的噬菌体修饰的搅拌棒提取和生物增殖协同增强，能够快速捕获和富集食源性致病菌，操作简便且成本低、安全系数高、灵敏度高和测试时间短。灵敏度高和测试时间短。灵敏度高和测试时间短。


技术研发人员：周仁杰 刘白璐 干宁
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/9/23