一种基于双足DNA步行器的检测T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法

一种基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法
技术领域
1.本发明涉及生化分析和检测技术领域，具体涉及一种基于双足dna步行器和酶辅助扩增技术检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学检测方法。


背景技术：

2.t4多聚核苷酸激酶(t4 polynucleotide kinase,t4 pnk)是从感染了噬菌体t4中分离得到，简称t4激酶，具有5'激酶活性，能够催化atp的γ位磷酸转移到寡核苷酸链或核酸的5’羟基末端，与dna重组、复制以及损伤修复等正常的细胞生理活动密切相关。激酶活性的异常表达会导致蛋白质的异常磷酸化，导致多种人类疾病如werner综合症、loom’s综合症、rothmund-thomson综合症等重大疾病。此外，t4 pnk还是一种重要的分子生物学工具，t4 pnk的发现和应用在一定程度上促进了分子生物学的发展。目前，t4 pnk已经成为基因工程和生物分析研究中一种不可或缺的工具酶，并且进一步用于核酸损伤修复和酶抑制剂的研究。因此，发展t4多聚核苷酸激酶的检测技术有助于为生物学研究及临床诊断提供有力的工具。
3.电化学传感器作为一种新型分析检测技术手段具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等特点，被广泛应用于疾病诊断、食品安全和环境监测等领域。电化学传感器的性能受到敏感界面的性质、修饰材料和工艺的影响。为了提高电化学传感器的检测性能，人们发展了多种性能稳定、可靠性高的信号放大策略。其中，dna步行器信号放大技术因其结构简单、易于合成、序列的可预见性和可编程性而受到广泛关注。与电化学生物传感器相结合，dna步行器是一种受环境刺激、酶反应或链置换反应驱动的纳米级分子器件，它可以沿着部分或全部核酸组成的dna轨道进行重复的机械循环运动，实现信号级联放大，这为设计传感器响应信号放大方法提供了一个很有前途的工具。此外，双足型dna步行器因其较高的局部步行链浓度而能够在行走过程中与轨道连接更稳定，弥补了单足型dna步行器在反应中容易脱轨的不足，因此表现出更优异的传感分析检测性能。
4.传统的检测t4 pnk活性的方法主要有放射性同位素
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p标记法、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影法等。这些方法普遍存在不连续、操作繁琐耗时、需要特殊的设备，易产生放射性污染，或选择性和灵敏度不高等缺点。近年来，发展了一些新的t4 pnk活性的检测方法，例如比色分析法、荧光分析法、电化学分析法、化学发光法及荧光成像分析技术等。虽然此类方法灵敏度较高，但是操作过程繁琐，成本较高，其应用受到一定程度的限制。
5.目前，缺乏一种实现对t4 pnk活性的灵敏度高的基于双足dna步行器和酶辅助扩增技术测定t4多聚核苷酸激酶活性的方法。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术中的不足之处，本发明的目的是提供一种灵敏度高的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法。
7.为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案的如下：第一方面，本发明提供了一种基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法；第二方面，本发明提供了基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法制得的电化学生物传感器。
8.本发明的一种基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，包括如下步骤：(1)设计发夹dna序列；所述的发夹dna具有seq id no.1所示的核苷酸序列；
9.(2)设计单链dna探针b序列；所述的单链dna探针b具有seq id no.2所示的核苷酸序列；
10.(3)设计单链dna探针c序列；所述的单链dna探针c具有seq id no.3所示的核苷酸序列；
11.(4)构建电化学生物传感器：t4多聚核苷酸激酶催化发夹dna末端-oh基团磷酸化，之后被核酸外切酶剪切产生单链dna探针a；然后三条单链dna探针a、b和c杂交，形成双足dna步行器；以核酸内切酶驱动双足dna步行器在轨道链dna修饰的电极表面行走，剪切释放轨道链中的电化学活性的轨道链dna片段，实现电化学响应信号放大和t4多聚核苷酸激酶活性测定；所述的轨道链dna具有seq id no.4所示的核苷酸序列；
12.(5)测定t4多聚核苷酸激酶活性；
13.(6)测定t4多聚核苷酸激酶抑制剂；
14.(7)实际样品测定。
15.进一步地，在步骤(1)中，所述的发夹dna的长度为36个碱基，5
′
端标记羟基；在步骤(2)中，所述的单链dna探针b的长度为55个碱基，5
′
端7个碱基可被核酸内切酶剪切；在步骤(3)中，所述的单链dna探针c的长度为55个碱基，5
′
端7个碱基可被核酸内切酶剪切；在步骤(4)中，所述的轨道链dna的长度为15个碱基，5
′
端标记二茂铁fc，3
′
端标记巯基。
16.更进一步地，在步骤(4)中，在预处理好的金电极表面滴涂10μl 1μm轨道链dna溶液，25℃下孵育12h，再滴涂10μl 1mm mch溶液，25℃孵育15min，pbs缓冲液冲洗电极；在t4 pnk反应缓冲液中，加入200nm发夹dna、1mmatp、不同浓度t4 pnk和10units核酸外切酶λ
exo
，37℃下孵育2h；移取20μl上述t4 pnk反应混合液，与20μl 0.2μm dna探针b和20μl 0.2μm dna探针c混合，95℃下热处理5min，冷却至室温后得到双足dna步行器；取25μl双足dna步行器溶液和5μlrcutsmart缓冲液分别滴涂于电极表面，所述rcutsmart缓冲液含10units核酸内切酶nb.bbvci，37℃下孵育2h，pbs缓冲液冲洗，制得t4 pnk电化学传感器。
17.进一步地，在步骤(4)中，轨道链dna的用量和浓度分别为10μl和1μm，孵育温度和时间分别为25℃和12h；mch的用量和浓度分别为10μl和1mm，孵育温度和时间分别为25℃和15min；t4 pnk反应混合液中发夹dna的浓度为200nm、atp的浓度为1mm、t4 pnk的浓度为0.01-10u/ml、核酸外切酶λ
exo
的浓度为10units；t4 pnk反应混合液的用量为20μl，dna探针b的用量和浓度分别为20μl和0.2μm，dna探针c的用量和浓度分别为20μl和0.2μm；双足dna步行器孵育温度和时间分别为95℃和5min，自然冷却至室温；双足dna步行器的用量为25μl，rcutsmart缓冲液的用量为5μl，核酸内切酶nb.bbvci的浓度为10units，双足dna步行器的行走温度和时间分别为37℃和2h。
18.进一步地，在步骤(5)中，测定t4多聚核苷酸激酶t4 pnk活性：使用电化学工作站
以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法dpv进行定量，绘制dpv峰电流与t4 pnk浓度关系的标准曲线。
19.进一步地，在步骤(5)中，使用电化学工作站测量电化学响应信号，根据电化学信号大小对t4 pnk的活性进行定量测定。
20.更进一步地，在步骤(6)中，所述的t4多聚核苷酸激酶抑制剂为二磷酸腺苷adp和硫酸铵(nh4)2so4。
21.进一步地，在步骤(7)中，所述的实际样品为hela细胞裂解液。
22.本发明所述的基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法制得的电化学生物传感器。
23.有益效果：本发明操作简单、成本低、非放射性、灵敏度高、选择性好。
24.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
25.(1)本发明提供了一种电化学技术检测t4多聚核苷酸激酶活性，本发明利用三条单链dna探针杂交形成双足dna步行器提高了测定t4 pnk的选择性；
26.(2)本发明利用核酸内切酶驱动双足dna步行器在电极表面行走产生放大的电化学响应信号提高了测定t4 pnk活性的灵敏度。利用核酸内切酶驱动双足dna步行器在电极表面行走，剪切释放轨道链中电化学活性dna片段，实现响应信号放大；
27.(3)本发明制备的电化学生物传感器可用于t4 pnk抑制剂二磷酸腺苷和硫酸铵的检测；
28.(4)本发明制备的电化学生物传感器可用于实际样品hela细胞中t4pnk活性的测定。电化学放大响应信号与t4多聚核苷酸激酶浓度成正比，实现对t4多聚核苷酸激酶的高灵敏度和高选择性测定。
附图说明
29.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为使用本发明的双足dna步行器和酶辅助扩增技术测定t4多聚核苷酸激酶活性的制备技术和检测原理示意图。
31.图2为使用本发明测定t4多聚核苷酸激酶活性dpv响应曲线图，横坐标是峰电位，单位是v，纵坐标是dpv响应峰电流，单位是na。
32.图3为使用本发明技术测定t4多聚核苷酸激酶活性的工作曲线图，横坐标是t4 pnk的浓度，单位是u/ml，纵坐标是dpv响应峰电流，单位是na。
具体实施方式
33.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
34.本技术中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例
如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b的情况。其中a，b可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
35.本发明的一种基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，包括如下步骤：(1)设计发夹dna序列；所述的发夹dna具有seq id no.1所示的核苷酸序列；所述的发夹dna的长度为36个碱基，5
′
端标记羟基；
36.(2)设计单链dna探针b序列；所述的单链dna探针b具有seq id no.2所示的核苷酸序列；所述的单链dna探针b的长度为55个碱基，5
′
端7个碱基可被核酸内切酶剪切；
37.(3)设计单链dna探针c序列；所述的单链dna探针c具有seq id no.3所示的核苷酸序列；所述的单链dna探针c的长度为55个碱基，5
′
端7个碱基可被核酸内切酶剪切；
38.(4)构建电化学生物传感器：t4多聚核苷酸激酶催化发夹dna末端-oh基团磷酸化，之后被核酸外切酶剪切产生单链dna探针a；然后三条单链dna探针a、b和c杂交，形成双足dna步行器；以核酸内切酶驱动双足dna步行器在轨道链dna修饰的电极表面行走，剪切释放轨道链中的电化学活性的轨道链dna片段，实现电化学响应信号放大和t4多聚核苷酸激酶活性测定；所述的轨道链dna具有seq id no.4所示的核苷酸序列；所述的轨道链dna的长度为15个碱基，5
′
端标记二茂铁fc，3
′
端标记巯基。
39.(5)测定t4多聚核苷酸激酶t4 pnk活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法dpv进行定量，绘制dpv峰电流与t4 pnk浓度关系的标准曲线。在预处理好的金电极表面滴涂10μl 1μm轨道链dna溶液，25℃下孵育12h，再滴涂10μl 1mm mch溶液，25℃孵育15min，pbs缓冲液冲洗电极；在t4 pnk反应缓冲液中，加入200nm发夹dna、1mmatp、不同浓度t4 pnk和10units核酸外切酶λ
exo
，37℃下孵育2h；移取20μl上述t4 pnk反应混合液，与20μl 0.2μm dna探针b和20μl 0.2μm dna探针c混合，95℃下热处理5min，冷却至室温后得到双足dna步行器；取25μl双足dna步行器溶液和5μl rcutsmart缓冲液分别滴涂于电极表面，所述rcutsmart缓冲液含10units核酸内切酶nb.bbvci，37℃下孵育2h，pbs缓冲液冲洗，制得t4 pnk电化学传感器。使用电化学工作站测量电化学响应信号，根据电化学信号大小对t4 pnk的活性进行定量测定。轨道链dna的用量和浓度分别为10μl和1μm，孵育温度和时间分别为25℃和12h；mch的用量和浓度分别为10μl和1mm，孵育温度和时间分别为25℃和15min；t4 pnk反应混合液中发夹dna的浓度为200nm、atp的浓度为1mm、t4 pnk的浓度为0.01-10u/ml、核酸外切酶λ
exo
的浓度为10units；t4 pnk反应混合液的用量为20μl，dna探针b的用量和浓度分别为20μl和0.2μm，dna探针c的用量和浓度分别为20μl和0.2μm；双足dna步行器孵育温度和时间分别为95℃和5min，自然冷却至室温；双足dna步行器的用量为25μl，rcutsmart缓冲液的用量为5μl，核酸内切酶nb.bbvci的浓度为10units，双足dna步行器的行走温度和时间分别为37℃和2h。
40.(6)测定t4多聚核苷酸激酶抑制剂；所述的t4多聚核苷酸激酶抑制剂为二磷酸腺苷adp和硫酸铵(nh4)2so4。
41.(7)实际样品测定。所述的实际样品为hela细胞裂解液。
42.本发明所述的基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法制得的电化学生物传感器。
43.实施例1
44.本发明基于双足dna步行器和酶辅助扩增技术测定t4 pnk活性的方法原理如图1
7.4)为缓冲液，电位范围为0～0.6v，电位增幅为50mv，脉冲周期为20ms。微分脉冲曲线响应峰电流与t4 pnk浓度的关系曲线及工作曲线如图2和图3所示，峰电流与t4 pnk浓度在0.01
–
10u/ml范围内呈现良好的线性关系，相关系数r2为0.9985，线性方程为i(μa)＝-76.74lgc+132.20，检出限为0.003u/ml。本发明提出的传感器相比较其他传感器，具有更宽的线性范围和更低的检出限，采用双足dna步行器和酶辅助扩增技术构建的电化学传感器可实现对t4 pnk活性的定量和灵敏测定。
65.实施例6
66.t4 pnk活性抑制剂的测定
67.将不同浓度的抑制剂二磷酸腺苷adp和硫酸铵(nh4)2so4与t4 pnk缓冲液混合，实验方法相同，随着抑制剂浓度加大，t4 pnk的相对活性明显降低。当加入两种抑制剂浓度分别为0.93mm和9.10mm时，t4 pnk的相对活性降低了50％，表明该方法可用于t4pnk抑制剂的检测分析。
68.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计发夹dna序列；所述的发夹dna具有seq id no.1所示的核苷酸序列；(2)设计单链dna探针b序列；所述的单链dna探针b具有seq id no.2所示的核苷酸序列；(3)设计单链dna探针c序列；所述的单链dna探针c具有seq id no.3所示的核苷酸序列；(4)构建电化学生物传感器：t4多聚核苷酸激酶催化发夹dna末端-oh基团磷酸化，之后被核酸外切酶剪切产生单链dna探针a；然后三条单链dna探针a、b和c杂交，形成双足dna步行器；以核酸内切酶驱动双足dna步行器在轨道链dna修饰的电极表面行走，剪切释放轨道链中的电化学活性的轨道链dna片段，实现电化学响应信号放大和t4多聚核苷酸激酶活性测定；所述的轨道链dna具有seq id no.4所示的核苷酸序列；(5)测定t4多聚核苷酸激酶活性；(6)测定t4多聚核苷酸激酶抑制剂；(7)实际样品测定。2.根据权利要求1所述的基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的发夹dna的长度为36个碱基，5
′
端标记羟基；在步骤(2)中，所述的单链dna探针b的长度为55个碱基，5
′
端7个碱基可被核酸内切酶剪切；在步骤(3)中，所述的单链dna探针c的长度为55个碱基，5
′
端7个碱基可被核酸内切酶剪切；在步骤(4)中，所述的轨道链dna的长度为15个碱基，5
′
端标记二茂铁fc，3
′
端标记巯基。3.根据权利要求1所述的基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，其特征在于：在步骤(4)中，在预处理好的金电极表面滴涂10μl1μm轨道链dna溶液，25℃下孵育12h，再滴涂10μl1mm mch溶液，25℃孵育15min，pbs缓冲液冲洗电极；在t4pnk反应缓冲液中，加入200nm发夹dna、1mmatp、不同浓度t4pnk和10units核酸外切酶λ
exo
，37℃下孵育2h；移取20μl上述t4pnk反应混合液，与20μl0.2μmdna探针b和20μl0.2μmdna探针c混合，95℃下热处理5min，冷却至室温后得到双足dna步行器；取25μl双足dna步行器溶液和5μlrcutsmart缓冲液分别滴涂于电极表面，所述rcutsmart缓冲液含10units核酸内切酶nb.bbvci，37℃下孵育2h，pbs缓冲液冲洗，制得t4pnk电化学传感器。4.根据权利要求1所述的基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，其特征在于：在步骤(4)中，轨道链dna的用量和浓度分别为10μl和1μm，孵育温度和时间分别为25℃和12h；mch的用量和浓度分别为10μl和1mm，孵育温度和时间分别为25℃和15min；t4pnk反应混合液中发夹dna的浓度为200nm、atp的浓度为1mm、t4pnk的浓度为0.01-10u/ml、核酸外切酶λ
exo
的浓度为10units；t4pnk反应混合液的用量为20μl，dna探针b的用量和浓度分别为20μl和0.2μm，dna探针c的用量和浓度分别为20μl和0.2μm；双足dna步行器孵育温度和时间分别为95℃和5min，自然冷却至室温；双足dna步行器的用量为25μl，rcutsmart缓冲液的用量为5μl，核酸内切酶nb.bbvci的浓度为10units，双足dna步行器的行走温度和时间分别为37℃和2h。5.根据权利要求1所述的基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，其特征在于：在步骤(5)中，测定t4多聚核苷酸激酶t4pnk活性：使用电化学工作
站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法dpv进行定量，绘制dpv峰电流与t4pnk浓度关系的标准曲线。6.根据权利要求1所述的基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，其特征在于：在步骤(5)中，使用电化学工作站测量电化学响应信号，根据电化学信号大小对t4pnk的活性进行定量测定。7.根据权利要求1所述的基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述的t4多聚核苷酸激酶抑制剂为二磷酸腺苷adp和硫酸铵(nh4)2so4。8.根据权利要求1所述的基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，其特征在于：在步骤(7)中，所述的实际样品为hela细胞裂解液。9.权利要求1至8任一项所述的基于双足dna步行器的检测t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法制得的电化学生物传感器。

技术总结
本发明公开了一种基于双足DNA步行器测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法；本发明提供的双足DNA步行器通过三条单链DNA探针杂交形成，其中一条DNA探针由发夹DNA经T4多聚核苷酸激酶磷酸化和核酸外切酶剪切产生；利用核酸内切酶驱动双足DNA步行器在电极表面行走，剪切释放轨道链中电化学活性DNA片段，实现响应信号放大；电化学放大响应信号与T4多聚核苷酸激酶浓度成正比，实现对T4多聚核苷酸激酶的高灵敏度和高选择性测定。本发明操作简单、成本低、非放射性、灵敏度高、选择性好。选择性好。选择性好。


技术研发人员：张艳丽 罗丹 廖滢 苏爱雯 王红斌 庞鹏飞
受保护的技术使用者：云南民族大学
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/9/23