一种与乳鸽胸肌发育相关的lncRNA及其应用

一种与乳鸽胸肌发育相关的lncrna及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，具体涉及lxloc_064870在乳鸽胸肌生长发育中的应用。


背景技术：

2.肉类产量是衡量肉鸽经济价值的一个重要指标，其中胸肌重量是主要因素。而这一指标受到多种因素的调控。非编码rnas(ncrnas)是一类通常不编码蛋白质的rnas，包括长非编码rnas(lncrnas)、小rnas(mirnas)、环状rnas和piwi-interacting rnas，其中，lncrnas是影响主要生物过程和相关疾病的关键调节因子，因为它们参与调节身体脂肪代谢、肌肉发育、胚胎发育和免疫反应。但目前关于lncrna在鸽胸肌发育方面的研究鲜有报道。


技术实现要素：

3.发明目的：本发明的目的是通过转录组测序技术筛选与鸽胸肌生长发育相关的lncrna与其对应的mrna，最终在3、7、14、25日龄鸽胸肌组织中筛选得到了lxloc_064870，该lncrna能够反应乳鸽胸肌生长发育速度的快慢，通过选留个体，达到加快具有优良肉质性状肉鸽的培养，因此lncrna lxloc_064870可以用来调控肉鸽胸肌发育速度，一定程度上加快了具有优良肉质性状的肉鸽品种的培育。
4.技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
5.一种与乳鸽胸肌发育相关的lncrna，所述lncrna对应基因的核苷酸序列如seq id no：7所示。该lncrna命名为lxloc_064870，所述lxloc_064870基因的靶基因为ankrd2。
6.进一步地，所述lncrna的核苷酸序列如seq id no：8所示。
7.一种重组载体，包含seq id no：1所示的基因。
8.上述与乳鸽胸肌发育相关的lncrna在乳鸽胸肌生长发育研究中的应用在本发明的保护范围之内。
9.一种检测乳鸽胸肌生长发育速度的试剂盒，包括检测lxloc_064870基因表达量的引物对，其核苷酸序列如seq id no:1、seq id no:2所示。
10.进一步地，所述试剂盒包括检测内参基因gapdh的引物对，其核苷酸序列如seq id no:5、seq id no:6所示。
11.进一步地，所述试剂盒包括检测ankrd2基因的引物对，其核苷酸序列如seq id no:4、seq id no:5所示。
12.所述检测乳鸽胸肌生长发育速度的试剂盒
13.一种检测乳鸽胸肌生长发育速度的方法，包括如下步骤：
14.(1)取鸽3、7、14、25日龄胸肌，提取胸肌组织的总rna进行反转录，得到cdna；
15.(2)以步骤(1)得到的cdna为模板，seq id no:1和seq id no:2、seq id no:5和seq id no:6所述的序列为引物进行荧光定量pcr；
16.(3)采用2-δδct
方法对步骤(2)得到的荧光定量pcr数据进行分析，判定lxloc_064870基因在不同日龄乳鸽胸肌中的表达量，lxloc_064870基因表达量大，说明其生长速度的快。
17.步骤(2)中，所述的荧光定量pcr，其pcr反应体系如下：
18.扩增反应体系为20μl，premix试剂10μl；上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；模板cdna 2μl；无酶双蒸水6.4μl。
19.步骤(2)中，所述的荧光定量pcr，其pcr反应程序如下：
20.95℃预变性30s；95℃10sec，60℃30sec，40个循环；95℃15sec，60℃60sec，95℃30sec，60℃15sec获得熔解曲线。
21.有益效果：
22.本发明发现了与乳鸽生长发育紧密相关的lxloc_064870，通过共表达网络分析预测差异表达lncrna的靶基因ankrd2，并公开了检测两者在鸽胸肌组织中表达量的特异性引物对。长非编码rnas(lncrnas)在转录和转录后调控中发挥重要作用，但关于lncrnas在乳鸽胸肌生长发育中的分子调控机制的研究较少。本发明提供的lncrna lxloc_064870可以作为检测鸽胸肌生长发育速度的快慢的指标，帮助快速判断乳鸽生长速度，加快具有优良肉质性状的肉鸽品种的培养。
附图说明
23.图1不同日龄鸽体重(g)。
24.图2lncrna-mrna调控网络；(其中
○
为mrna，
◇
为lncrna)。
25.图3qpcr熔解曲线：(a).ankrd2熔解曲线；(b).lxloc_064870熔解曲线；(c).gapdh熔解曲线。
26.图4rt-qpcr和rna-seq结果比较：(a).ankrd2相对定量与测序结果；(b).lxloc_064870相对定量与测序结果。
具体实施方式
27.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以购获得的常规产品。
28.实施例1：测序样本的采集。
29.三十六对白羽王鸽饲养于扬州大学动物房。乳鸽(3、7和14日龄)由父母鸽分泌鸽乳哺育，25日龄的乳鸽可自主采食颗粒料，自由采食保健砂和水。选择3日龄、7日龄、14日龄和25日龄共36只乳鸽。首先用乙醚进行麻醉，然后用放血法进行安乐死。随后，测量体重(n＝9)。分别在3日龄、7日龄、14日龄和25日龄时采集乳鸽左胸肌，并选择三个体重相似的重复样本。所有组织样品在使用前都被冷冻在液氮中，并储存在-80℃以下。从每组中随机选择三个样本进行rna-seq。不同日龄鸽体重如图1所示。
30.实施例2：样品总rna的提取与质控。
31.对于每个样品，准备一个2ml的试管，从-80℃冰箱取出3日龄、7日龄、14日龄和25
日龄胸肌组织放入装有5mm氧化锆球的2ml试管中，加入800μl trizol裂解液，放入研磨机中，研磨30s，进行2-3次中断步骤，间隔为30s，室温下静置5min，使组织细胞充分裂解。将研磨后的胸肌样品在从2ml试管中转移到1.5ml ep管中，向每个ep管中加入160μl氯仿，用力搅拌，直至溶液变为乳白色，室温下保存5min。4℃，12000r
·
min-1
条件下离心15min，将离心后的上清转入新的1.5ml ep管中，向每个管中加入400ml异丙醇，搅拌均匀。混合物在室温下保存10min，4℃，12000r
·
min-1
条件下离心10min，沉淀rna。去除上清，rna在管底部形成白色颗粒。加入400ml75％乙醇，轻轻涡旋，4℃，10000r
·
min-1
条件下离心5min，弃去上清。重复加入400ml75％乙醇，涡旋，4℃，10000r
·
min-1
条件下离心5min，弃去上清。短暂离心后吸去残留液体，晾干15-20min，最后用适量depc水溶解沉淀。随后使用安捷伦2100生物分析仪测定总rna的纯度及浓度，od
260
/od
280
在1.9-2.1范围内的总rna用于后续研究。
32.实施例3：cdna文库构建与rna测序。
33.(1)dnasei消化
34.(2)使用ribo-zero tm试剂盒去除rrna
35.(3)加入打断试剂，使rna片段化
36.(4)二链cdna合成与纯化
37.(5)末端修复与接头连接
38.(6)pcr反应及产物回收
39.(7)文库检测
40.(8)本研究共建立12个cdna文库，分别为bm3d1，bm3d2，bm3d3(3日龄白羽王鸽胸肌组织cdna文库)，bm7d1，bm7d2，bm7d3(7日龄白羽王鸽胸肌组织cdna文库)，bm14d1，bm14d2，bm14d3(14日龄白羽王鸽胸肌组织cdna文库)，bm25d1，bm25d2，bm25d3(25日龄白羽王鸽胸肌组织cdna文库)。
41.文库质检合格后，在dnbseq测序系统上进行测序，下机数据为原始测序数据raw reads。
42.实施例4：原始数据质控与过滤。
43.测序所得数据称为raw reads。首先，我们过滤掉rrna，低质量、接头污染以及未知碱基n含量过高的reads，过滤后的数据称为clean reads。后续的分析均基于得到的clean reads。具体操作如下：
44.(1)去除含接头(adapter)的reads；
45.(2)去除含n比例大于10％的reads；
46.(3)去除低质量的reads(质量值q≤10的碱基数占整条read的50％以上)；
47.(4)去除重复reads
48.结果见表格2，通过质控，每个样本中均得到约130百万条的clean reads，且reads中q-score≥30碱基比例均约在95％，同时gc碱基含量约占50％，表明测序数据结果可靠，质控之后可用于下一步分析。
49.表2原始数据质量控制结果
[0050][0051]
实施例5：不同样品间差异基因表达分析。
[0052]
通过rna-seq预测，乳鸽胸肌样品中共有56,422个lncrnas和30,209个mrnas。为了确定与肉质或胸肌发育有关的lncrnas，以fold change≥2，adjusted p-value≤0.001为条件在3日龄、7日龄、14日龄和25日龄组胸肌组织中筛选差异显著基因，发现134个lncrnas共同差异表达，1525个mrnas共同差异表达。其中以lxloc_064870为代表的差异表达长链非编码rna和以ankrd2为代表的差异表达基因为我们后续的研究对象。
[0053]
实施例6：差异表达基因共表达网络分析。
[0054]
蛋白互作研究可以从分子水平揭示蛋白质的功能。因此，基于string(http://string-db.org/)蛋白质互作数据库中的互作关系，对差异表达基因进行蛋白互作网络分析，以更进一步探究不同日龄雏鸽胸肌内差异表达基因编码蛋白间复杂的相互作用关系。string数据库中包含物种鸽(columba livia)，直接从数据库中提取出差异基因集列表的互作关系，利用cytoscape软件对得到的差异基因编码蛋白互作网络数据文件进行可视化分析。蛋白互作网络图中，节点(node)为蛋白质，边缘(edge)为蛋白之间的相互作用关系，度(degree)代表与特定节点相互作用的蛋白质数量，节点大小与此节点的度成正比，节点的颜色表示差异表达基因的log2foldchange值。
[0055]
实施例6：rt-qpcr对ankrd2与lxloc_064870进行验证。
[0056]
提取不同日龄乳鸽胸肌组织总rna，在pcr管中配置反转录体系，在体系内加入以下试剂：
[0057]
rna样品
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2μl
[0058]5×
fastking-rt supermix
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4μl rnase-free ddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14μl
[0059]
以上体系共20μl。设置反应条件为42℃15min，95℃3min，完成后低温-20℃保存备用。
[0060]
根据测序所得ankrd2与lxloc_064870的序列，设计特异性引物对，其序列如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4所示，内参基因gapdh引物根据genbank中的序列设计内参基因gapdh引物对。扩增反应体系为20μl，包含premix试剂10μl；序列如seq id no:l、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4所示的特异性引物各0.4μl(内参基因引物序列如seq id no:5和seq id no:6所示的引物各0.4μl)；模板cdna2μl；无酶双蒸水6.8μl。荧光定量反应程序：95℃预变性30s；95℃10sec，60℃30sec，40个循环；95℃15sec，60℃60sec，95℃30sec，60℃15sec获得熔解曲线。
[0061]
引物序列如下：
[0062]
lxloc_064870：
[0063]
f：5
′‑
gaagggaaacaagtggttcga
ꢀ‑3′ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:1
[0064]
r：5
′‑
ttctgggtagggagcaatgag-3
′ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:2
[0065]
ankrd2：
[0066]
f：5
′‑
actgggcacctcgacattg-3
′ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:3
[0067]
r：5
′‑
cctgtggctgttccttggtc-3
′ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:4
[0068]
gapdh：
[0069]
f：5
′‑
cagccatctttcttgggtat-3
′ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:5
[0070]
r：5
′‑
ctgtgatctccttctgcatcc-3
′
seq id no:6
[0071]2‑△△
ct
法计算各组样本间基因的相对表达量，采用one way-anova方法检验对相对表达量进行统计分析，数据表示为平均数
±
标准误(mean
±
sem)，p《0.05表示差异显著。
[0072]
由图3可知，lxloc_064870熔解曲线平滑且具有唯一的主峰，表明引物设计良好。
[0073]
图4的rt-qpcr结果与rna-seq具有高度的一致性。证明测序结果的可靠性。
[0074]
本发明通过测序与rt-qpcr试验验证了lxloc_064870基因在不同时期乳鸽胸肌组织中的表达量，结果证明随着乳鸽的发育，lxloc_064870的表达量呈现逐渐下降趋势。提示lxloc_064870可能在乳鸽早期发育中起重要作用，参与乳鸽胸肌发育生长过程，可以作为乳鸽胸肌生长发育速度的标志物，用于优质肉质性状肉鸽品种的改良。
[0075]
本发明提供的试剂盒可用于检测lncrna lxloc_064870在乳鸽胸肌组织中的表达量，试剂盒主要包括引物序列seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6，预混液premix以及无酶双蒸水。
[0076]
上述实施的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种与乳鸽胸肌发育相关的lncrna，其特征在于，所述lncrna对应基因的核苷酸序列如seq id no：7所示。2.一种重组载体，其特征在于，包含seq id no：1所示的基因。3.权利要求1所述与乳鸽胸肌发育相关的lncrna在乳鸽胸肌生长发育研究中的应用。4.一种检测乳鸽胸肌生长发育速度的试剂盒，其特征在于，包括检测lxloc_064870基因表达量的引物对，其核苷酸序列如seq id no:1、seq id no:2所示。5.根据权利要求4所述的检测乳鸽胸肌生长发育速度的试剂盒，其特征在于，包括检测内参基因gapdh的引物对，其核苷酸序列如seq id no:5、seq id no:6所示。6.根据权利要求4所述的检测乳鸽胸肌生长发育速度的试剂盒，其特征在于，包括检测ankrd2基因的引物对，其核苷酸序列如seq id no:3、seq id no:4所示。7.根据权利要求4所述的检测乳鸽胸肌生长发育速度的试剂盒，其特征在于，包括荧光定量pcr反应液、无酶双蒸水。8.一种检测乳鸽胸肌生长发育速度的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取鸽3、7、14、25日龄胸肌，提取胸肌组织的总rna进行反转录，得到cdna；(2)以步骤(1)得到的cdna为模板，seq id no:1和seq id no:2、seq id no:5和seq id no:6所述的序列为引物进行荧光定量pcr；(3)采用2-δδct
方法对步骤(2)得到的荧光定量pcr数据进行分析，判定lxloc_064870基因在不同日龄乳鸽胸肌中的表达量，lxloc_064870基因表达量大，说明其生长速度的快。9.根据权利要求8所述的检测乳鸽胸肌生长发育速度的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的荧光定量pcr，其pcr反应体系如下：扩增反应体系为20μl，premix试剂10μl；上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；模板cdna 2μl；无酶双蒸水6.4μl。10.根据权利要求8所述的检测乳鸽胸肌生长发育速度的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的荧光定量pcr，其pcr反应程序如下：95℃预变性30s；95℃10sec，60℃30sec，40个循环；95℃15sec，60℃60sec，95℃30sec，60℃15sec获得熔解曲线。

技术总结
本发明公开了一种与乳鸽胸肌发育相关的lncRNA及其应用，属于生物工程技术领域。发现了与乳鸽生长发育紧密相关的LXLOC_064870，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。通过共表达网络分析预测差异表达lncRNA的靶基因ANKRD2，并公开了检测两者在鸽胸肌组织中表达量的特异性引物对。本发明提供的lncRNA LXLOC_064870可以作为检测鸽胸肌生长发育速度的快慢的指标，帮助快速判断乳鸽生长速度，加快具有优良肉质性状的肉鸽品种的培养。肉质性状的肉鸽品种的培养。肉质性状的肉鸽品种的培养。


技术研发人员：王莹 张弛 苗冬枝 李婉晴 杨海明
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/23