一种深海来源的PET水解酶dsPETase06及其应用

一种深海来源的pet水解酶dspetase06及其应用
技术领域
1.本发明属于生物化学和酶工程技术领域，具体涉及一种深海来源的pet水解酶及其应用。


背景技术：

2.塑料因其耐久性、延展性、可塑性、稳定性、透光性等优良属性已遍布人类生产生活的各个方面。而塑料在常温下的化学惰性使得大量的塑料废弃物造成的白色污染日益严重，危害生态环境与人类健康。pet是一类由对苯二甲酸和乙二醇为单体聚合而成的聚酯类塑料，在纺织产业、食品饮料包装等多个领域有着广泛应用。传统的pet处理手段如机械破碎、热塑再加工以及化学分解等方法成本昂贵，且会造成环境的二次污染。近年来，基于pet水解酶的生物酶法降解展现出巨大的应用潜力，如来自pet降解菌ideonella sakaiensis 201-f6中的ispetase(yoshida et al.,2016)，以及来自于枝叶堆肥的宏基因组的lcc(sulaiman et al.,2012)，均有着很好的pet水解活性，而利用它们的突变体进行pet水解、单体回收以及pet再合成，已展现出pet的循环经济在理论上的可行性(lu etal.,2022；tournier et al.,2020)。
3.pet水解酶的嗜盐性研究较少，来自嗜盐菌产期弧菌(vibrio gazogenes)中的pet6被证明可耐受0～2.5m的nacl，但其活性远远低于ispetase(weigert etal.,2022)，因此，高盐条件下能够表现出高pet水解活性的酶目前是一个空白。


技术实现要素：

4.本发明的目的是解决现有的高pet水解活性的酶不能耐受高盐环境的问题，提供一种来自于马里亚纳海沟10400米的宏基因组中挖掘并鉴定的pet水解酶dspetase06，该酶能够在高盐或高温的环境下展现出对pet的高水解活性。
5.本发明解决其技术问题采用的技术方案是：一种深海来源的pet水解酶dspetase06，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.优选地，本发明还提供了编码所述pet水解酶dspetase06的基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.优选地，本发明还提供了所述pet水解酶dspetase06的载体，所述载体中包含所述的基因。
8.优选地，所述的载体为真核载体或者原核载体。
9.优选地，所述的载体为质粒载体或者病毒载体。
10.优选地，本发明还提供了包含所述的载体的宿主细胞。
11.优选地，所述的宿主细胞为细菌。
12.优选地，本发明还进一步提供了所述的pet水解酶dspetase06、所述的载体、所述的宿主细胞在高盐或高温条件下降解pet中的应用。
13.优选地，本发明还进一步提供了pet降解剂，该pet降解剂含有所述的pet水解酶
dspetase06、所述的表载体、所述的宿主细胞中的至少一种。
14.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的pet水解酶dspetase06能够在高盐或高温的环境下催化pet的水解反应，生成mhet和tpa，后续可以通过回收mhet和tpa重新聚合生成新的pet使其达到循环的目的；同时，该酶嗜盐的特性使其更好的适用于高盐的工业废水、污水处理，因此本发明在环保、催化领域都有着重要意义。
附图说明
15.图1为dspetase06在不同nacl浓度下催化pet水解；
16.图2为表达dspetase06的pdsp06质粒图谱；
17.图3为纯化后的dspetase06的sds-page分析；m,蛋白marker；1.纯化后的dspetase06；
18.图4为dspetase06在不同盐浓度下催化pet水解48小时的产物浓度；hplc可检测到的水解产物为tpa与mhet，以反应液中tpa与mhet的浓度之和表现pet水解活性的大小；
19.图5为dspetase06在不同盐浓度下催化pet水解120小时的产物浓度；hplc可检测到的水解产物为tpa与mhet，以反应液中tpa与mhet的浓度之和表现pet水解活性的大小；
20.图6为dspetase06催化scpet膜的完全降解；试管中反应体系为3ml，scpet为3mg，反应时间见左侧箭头标注，酶浓度标注于酶名称的下方；
21.图7为dspetase06在不同温度下催化pet水解48小时的产物浓度；hplc可检测到的水解产物为tpa与mhet，以反应液中tpa与mhet的浓度之和表现pet水解活性的大小；
22.图8为dspetase06在不同温度下催化pet水解120小时的产物浓度hplc可检测到的水解产物为tpa与mhet，以反应液中tpa与mhet的浓度之和表现pet水解活性的大小。
具体实施方式
23.为了便于理解本研究，下面结合附图和具体实施例，对本研究进行更详细的说明。但是，本研究可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本研究公开内容的理解更加透彻全面。
24.本发明从深海宏基因组中间进行筛选，筛选得到一个酶，将其命名为dspetase06。以下通过实验对该酶进行功能特性及催化活性的测试和验证。
25.1.dspetase06的底物的制备
26.作为验证dspetase06功能的pet我们购买了gfpet(es301445,goodfellow,huntingdon,england)，通过打孔器将制备成直径6mm的pet膜作为反应的底物。
27.scpet膜的制备：通过溶剂溶解—挥发的方式自制scpet膜来检测pet水解活性的报道见参考文献(liu et al.,2023；cui et al.,2021)。本实例中所制备的scpet膜方法为：将2ml 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(hfip)溶解的gfpet(40mg/ml)均匀涂膜在直径为10cm的平板玻璃板上，在室温下过夜蒸发hfip，在75％乙醇中孵育2小时，将所得scpet膜从玻璃板上剥离。
28.2.dspetase06基因与蛋白序列分析
29.为了确定dspetase06氨基酸序列的新颖性，我们通过在线blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)在genbank中搜索它的同源蛋白并按序列相似性排
列，如表1所列的为genebank数据库中与dspetase06一致性最高的30个序列，其中与dspetase06进化上最相近的蛋白的一致性为86.76％，说明该蛋白(seq id no.1)的全长序列尚未公开披露过，具有新颖性。
30.表1.genebank中与dspetase06一致性最高的30个蛋白序列
[0031][0032][0033]
3.dspetase06基因的克隆
[0034]
通过dspetase氨基酸序列进行全基因合成，并针对大肠杆菌表达做密码子优化，合成的序列见seq id no.2。以5076-f及5076-r为引物对dspetase06基因片段进行扩增。以pet32a-lic为模板，32a-f及32a-r为引物对pet32a进行线性化扩增。引物序列如表2所示。pcr扩增条件为：98℃ 10分钟；98℃ 10秒,55℃ 30秒,72℃ 1分钟，循环35次；72℃ 5分钟。将获得的dspetase06片段与线性化的pet32a载体片段利用无缝克隆试剂盒(clonexpress ii one step cloning kit，诺唯赞，南京)进行连接形成表达载体pdsp06，图谱如图2所示，并转化大肠杆菌表达菌株escherichia coli rosseta-gami 2(de3)，获得表达菌株
rgdsp06。菌株rgdsp06表达n端带有trx-his6 tag标签的融合蛋白，并可通过tev蛋白酶将n端标签切除，通过两次ni-nta亲和层析可获得无蛋白标签的dspetase06以进行活性检测。
[0035]
表2.dspetase06克隆至pet32a-lic的引物及其序列
[0036][0037]
4.dspetase06的表达与纯化
[0038]
挑取rgdsp06单克隆接到培养基中(含有50μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml氯霉素双抗性)进行种子液培养，37℃220rpm摇床培养8-12h；扩大培养的比例为1:500～1:100，37℃220rpm摇床培养约4～6小时，当od
600
达到0.6～0.8时加入iptg开始诱导，iptg终浓度可以为0.2～1mm。诱导条件为18～30℃诱导18-24h。将诱导结束的菌液在4℃3000～6000g条件下离心10分钟，收集菌体。
[0039]
收集的菌体用50ml预冷的lysis buffer重悬，在冰浴中利用超声破碎仪对菌体进行破碎，破碎程序为功率为290w，超声破碎4s，停止8s，超声总时长为15min。在4℃13000g 60min条件下离心取上清，上清液与3ml ni-nta树脂在4℃的下孵育1小时使目标蛋白与树脂充分结合，先后用15ml lysis buffer和15ml wash buffer冲洗，用5ml elution buffer洗脱收集目标蛋白，用ultracel-30k的超滤管对洗脱液浓缩至2.5ml。将脱盐柱pd-10用25ml desalting buffer平衡，将2.5ml浓缩蛋白液加入到脱盐柱pd-10中，加入3.5ml的desalting buffer收集蛋白，向收集到的蛋白液加入10μl的带有his6 tag的tev蛋白酶4℃孵育12小时。ni-nta树脂用20ml desalting buffer平衡，加入3ml ni-nta树脂在4℃的下孵育1小时trx-his6 tag以及tev酶与树脂充分结合，收集流出液即为无标签的dspetase06。用ultracel-30k的超滤管将dspetase06浓缩至1ml，用微量分光光度计检测280nm的吸光值以测定纯化蛋白质的浓度，取10μl蛋白用于sds-page检测，检测结果如图3所示。剩余蛋白用液氮速冻并保存于-80℃。
[0040]
上述蛋白纯化-各缓冲液配方：
[0041]
lysis buffer(1l)：3.03g tris、8.77g nacl、100g甘油，1.36g咪唑，ph 7.5。
[0042]
wash buffer(1l)：3.03g tris、8.77g nacl、100g甘油，2.72g咪唑，ph 7.5。
[0043]
elution buffer(1l)：3.03g tris、8.77g nacl、100g甘油，10.2g咪唑，ph7.5。
[0044]
desalting buffer(1l)：3.03g tris、8.77g nacl、100g甘油，ph 7.5。
[0045]
5.dspetase06在不同盐浓度下催化gfpet水解反应
[0046]
直径6mm的gfpet膜为反应底物，50mm tris-hcl中加入不同浓度的nacl作为反应缓冲液，调整各缓冲液的ph至9.0。nacl的浓度为：0m，0.6m，1.2m，1.9m，2.8m，3.7m，4.5m，5.3m，反应总体积500μl，酶终浓度50nm，反应温度37℃。ispetase以相同条件反应以进行活性比较，每个反应设三个重复。反应48和120小时分别取100μl样品，加入200μl甲醇终止反应之后用100℃处理10min使酶失活，离心取上清液进行hplc检测。
[0047]
hplc检测所用仪器型号为agilent technologies 1220infinity lc，分析柱型号zorbax sb-c18，柱温30℃。流动相a为含0.1％三氯乙酸的去离子水，流动相b为含0.1％ tca的乙腈，流速固定为1ml/min。pet水解产物tpa和mhet可通过如下梯度的流动相分离：0～5分钟，15％ b；5～20分钟，15％～100％ b梯度；20～25分钟，100％～15％ b梯度；25～30分钟，15％ b。检测波长为254nm。产生的tpa和mhet的浓度根据标准样品进行计算。
[0048]
反应结果如图4、图5所示。从结果可见，ispetase在不加nacl的条件下表现出最高活性，因此在该条件下的ispetase催化的pet水解反应作为参照。
[0049]
48小时反应结果如图4所示，dspetase06在所有nacl条件下均能表现出pet水解活性，且活性随着nacl浓度的增加而提高，当达到4.5m时表现出最高的活性，在该时间点下表现出的活性是ispetase的2倍。
[0050]
120小时反应结果如图5所示，dspetase06在所有nacl条件下均能表现出pet水解活性，且活性随着nacl浓度的增加而提高，当达到4.5m时表现出最高的活性，在该时间点下表现出的活性是ispetase的5.5倍。
[0051]
6.dspetase06在不同盐浓度下催化scpet膜的水解反应
[0052]
dspetase06的pet水解活性可通过对自制scpet膜的完全水解来展现。称取3mg scpet薄膜放入玻璃试管中，随后加入3ml反应液：ispetase反应液中包含50mm tris-hcl缓冲液(ph 9.0)和500nm酶；dspetase反应液中包含50mm tris-hcl缓冲液(ph 9.0)，4.5m nacl，以及300nm或500nm酶。在总计为10天的反应时间里每2天进行拍照观察scpet膜的降解情况。结果如图6所示，dspetase06在500nm浓度下在4天时能过催化大部分scpet膜的降解，而6天后几乎没有剩余scpet；而在300nm浓度下在4天时能发先明显的scpet膜的降解，在第8和第10天时仅剩余少部分的scpet膜；而作为对照的ispetase，在10天的反应过程中并未观察到明显的降解现象。
[0053]
以上结果表明dspetase06在高盐条件下具有更高活性的同时也具有很高的稳定性。
[0054]
7.dspetase06在不同温度度下催化gfpet水解反应
[0055]
直径6mm的gfpet膜为反应底物，50mm tris-hcl中加入不同浓度的nacl作为反应缓冲液，调整各缓冲液的ph至9.0。nacl的浓度为：4.5m，反应总体积500μl，酶终浓度50nm，反应温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，每个反应设三个重复。反应48和120小时分别取100μl样品，加入200μl甲醇终止反应之后用100℃处理10min使酶失活，离心取上清液进行hplc检测。
[0056]
hplc检测所用仪器型号为agilent technologies 1220infinity lc，分析柱型号zorbax sb-c18，柱温30℃。流动相a为含0.1％三氯乙酸的去离子水，流动相b为含0.1％ tca的乙腈，流速固定为1ml/min。pet水解产物tpa和mhet可通过如下梯度的流动相分离：0～5分钟，15％ b；5～20分钟，15％～100％ b梯度；20～25分钟，100％～15％ b梯度；25～30分钟，15％ b。检测波长为254nm。产生的tpa和mhet的浓度根据标准样品进行计算。
[0057]
48小时反应结果如图7所示，dspetase06催化的水解产物量在25℃到45℃下随着温度的升高而增加，并且在45℃达到最高，之后45℃到75℃随着温度的升高而降低。
[0058]
120小时反应结果如图8所示，dspetase06催化的水解产物量在25℃到45℃下随着温度的升高而增加，并且在45℃达到最高，之后45℃到75℃随着温度的升高而降低。
[0059]
该结果表明在37～45℃之间dspetase06能够表现出比图7和图8更高的活性。

技术特征：
1.一种深海来源的pet水解酶dspetase06，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no.1所示。2.编码如权利要求1所述的pet水解酶dspetase06的基因，其特征在于：其核苷酸序列如seq id no.2所示。3.包含如权利要求2所述的基因的载体。4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述的载体为真核载体或者原核载体。5.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述的载体为质粒载体或者病毒载体。6.包含如权利要求3-5任一项所述的载体的宿主细胞。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为细菌。8.如权利要求1所述的pet水解酶dspetase06、权利要求3-5任一项所述的载体或权利要求6-7任一项所述的宿主细胞在降解pet中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在高盐或高温条件下降解pet。10.pet降解剂，其特征在于：含有权利要求1所述的pet水解酶dspetase06、权利要求3-5任一项所述的载体、权利要求6-7任一项所述的宿主细胞中的至少一种。

技术总结
本发明属于生物化学和酶工程技术领域，具体涉及一种深海来源的PET水解酶及其应用。一种深海来源的PET水解酶dsPETase06，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。本发明还提供了编码所述PET水解酶dsPETase06的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供一种来自深海的宏基因组中挖掘并鉴定的PET水解酶dsPETase06，该酶能够在高盐或高温的环境下展现出对PET的高水解活性，在环保、催化领域都有重要意义。重要意义。重要意义。


技术研发人员：孟亮 李盛英 李登辉 刘琨 陆瑞 张成松 姬倩悦
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/23