高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物及制备方法和应用与流程

1.本发明属于叶黄素加工技术领域，具体涉及高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物及制备方法和应用。


背景技术：

2.叶黄素(lutein，lut)是广泛存在于蔬菜、水果与花卉中的天然色素，其在改善认知、治疗年龄相关的黄斑疾病、缓解心血管疾病等领域的关键作用逐步凸显。由于人体中不存在叶黄素生物合成的关键酶，因此，叶黄素必须通过膳食补充。然而，膳食补充仅可获得人体每日所需叶黄素的10％。为保障国民营养健康，开发富含天然叶黄素的功能食品势在必行。
3.在食品开发过程中，由于天然叶黄素结构中具有共轭双键组成的长发色团，使得叶黄素化学性质不稳定，易被温度、氧气、ph和光照等因素影响而发生降解。同时，叶黄素为脂溶性色素、不溶于水，生物利用度低，导致其在食品加工和医药等领域的应用受到很大的限制。因此，市场上天然叶黄素产品较少，大多数为叶黄素酯相关产品，如叶黄素酯压片糖果、叶黄素酯软胶囊等。然而，叶黄素酯和天然叶黄素在结构、稳定性、功能性、生物利用率等方面存在明显差异。综上，如何保持加工条件下天然叶黄素的稳定性、提高其溶解性成为富含叶黄素食品开发基础理论研究需要解决的重要科学问题。
4.研究报道，通过递送系统，如纳米颗粒、脂质体、微胶囊和乳液等可部分控制叶黄素的降解。如中国专利cn115886122a一种提高植物蛋白乳液稳定性的方法及应用，表明利用植物蛋白乳液可作为叶黄素的载体或递送体系，进而提高叶黄素的稳定性。然而，叶黄素乳状液长时间存放或在加热条件下易发生聚集而最终分为油、水两相，在实际应用中会影响食品的感官品质；此外，利用脂质体、包合物及自微乳等技术可不同程度地改善叶黄素的稳定性及水溶性，但也存在赋形剂用量大、放置稳定性等问题。
5.蛋白质可以通过分子间相互作用和难溶或疏水性营养物质结合，改善这些生物活性分子的水分散性、稳定性和生物活性。目前，中国专利cn108308615a以玉米肽作为食品功能成分载体已有报道，玉米肽负载叶黄素纳米颗粒粒径小于100nm，可部分提高叶黄素溶解度(10倍以上)，但是在有效成分溶解性、释放性方面还存在不足。研究报道，通过超声诱导红豆蛋白改性，可提高叶黄素-红豆蛋白复合物的乳化性和抗氧化活性等。然而，超声波是一种频率高于20000hz的声波，在水中传播能力强。红豆蛋白疏水性强，在溶液体系中易聚集成团，导致超声改性红豆蛋白-叶黄素复合物所制备颗粒较大，水溶性较差，不利于消化吸收，难以发挥叶黄素在体内的生理功能；且超声处理操作流程相对复杂，对实际操作过程要求较高，需要经过200w超声处理20min，需要严格控制反应时间间隔(处理5s，间隔5s)，以防止热效应的产生。
6.目前，豌豆分离蛋白(pea protein isolate，ppi)由于其生物可及性、高营养性和低过敏性受到越来越多的关注。然而，豌豆分离蛋白的功能特性如溶解度、乳化性、凝胶性、起泡性和抗氧化能力等方面存在一定局限，无法满足未来食品的需求。同时，豌豆分离蛋白
中65-80％为7s/11s盐溶性球蛋白，其结构紧凑，很大程度上限制了它作为多酚、姜黄素等生物活性物质的载体。因此，需要对豌豆分离蛋白进行改性促进豌豆分离蛋白结构展开，以改善其功能特性来满足食品工业的要求。蛋白质的改性方法有物理改性方法、限制性酶解，糖基化等，但是存在操作成本较高、体系较复杂等问题。如中国发明专利cn115836706a公布了基于声共振技术改善豌豆分离蛋白溶解性和乳化性的方法，20min声共振处理显著提高了豌豆蛋白的溶解度，达到71.8％。然而声共振处理对设备的要求高，处理时间需长达30min，能耗高。


技术实现要素：

7.针对上述技术问题，本发明提供一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物及制备方法和应用；本发明提供的制备方法利用豌豆分离蛋白为外源蛋白，通过分子间相互作用，形成新的叶黄素/豌豆分离蛋白复合物，从而提高叶黄素的水溶性，保持叶黄素的稳定性。
8.本发明是通过以下技术方案实现的：
9.一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的制备方法，所述制备方法包括：
10.(1)叶黄素溶液制备：将叶黄素溶于无水乙醇中，得到叶黄素溶液；
11.(2)豌豆分离蛋白溶液制备：将豌豆分离蛋白分散于超纯水中，搅拌形成分散液，加入naoh溶液，在一定温度下恒温振荡一定时间，使豌豆分离蛋白完全溶解；冷却至室温，加入hcl溶液调节ph值，得到豌豆分离蛋白溶液；
12.(3)叶黄素/豌豆分离蛋白复合物制备：将所述豌豆分离蛋白溶液稀释至目标浓度后与所述叶黄素溶液按照一定体积比混合；室温下振荡一定时间，得到叶黄素/豌豆分离蛋白复合物溶液；冷冻干燥后获得高水溶性的叶黄素/豌豆分离蛋白复合物(lut-ppi复合物)。
13.进一步地，步骤(1)中，叶黄素为脂溶性色素，不溶于水，可溶于有机溶剂，如乙醇、乙酸乙酯，丙酮等。采用乙酸乙酯，丙酮等溶剂溶解叶黄素时，未能实现与豌豆分离蛋白水体系充分互溶。本发明中采用与水互溶的乙醇作为溶剂溶解获得浓度为13-65μm的叶黄素溶液，进而可以获得稳定且充分互溶的叶黄素/豌豆分离蛋白复合物溶液。
14.进一步地，步骤(2)具体为：
15.将豌豆分离蛋白分散于超纯水中，通过磁力进行持续搅拌20-30min获得豌豆分离蛋白分散液；向所述豌豆分离蛋白分散液中加入0.1-1mol/l naoh溶液，调节ph值至11.5-12.0，在83-87℃恒温振荡器中振荡25-30min，促使豌豆蛋白的结构展开，使豌豆分离蛋白完全溶解；为防止热处理诱导豌豆分离蛋白过度变性，迅速将样品置于冰水5-10min冷却至室温，用0.1-1mol/l的hcl溶液调节ph值至7.4-7.8，得到浓度为5mg/ml的豌豆分离蛋白溶液。豌豆分离蛋白不溶于水，采用单独碱性ph处理、热处理、超声改性等处理后其水溶性不佳。所述豌豆分离蛋白制备通过碱性ph耦合热处理，效果良好，解决了蛋白质调回中性ph时析出问题。
16.进一步地，步骤(3)中，得到的所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物溶液中，叶黄素浓度范围为13-65μm，豌豆分离蛋白的浓度分别为0.5-4.5mg/ml。
17.一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物，采用上述方法制备，所述叶黄素/豌
豆分离蛋白复合物是通过叶黄素和豌豆分离蛋白之间疏水相互作用自发结合而成，所述叶黄素和所述豌豆分离蛋白结合形成均一稳定的球形纳米颗粒，所述球形纳米颗粒的平均粒径为20-40nm；
18.所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物中叶黄素的溶解度最高达到48μg/ml。
19.进一步地，所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物冻干粉中叶黄素的溶解度的测定方法为：
20.将1.4g叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的冻干粉溶于100ml水中，取1.0ml加入5ml离心管中，再加入3ml乙酸乙酯，充分混合30秒，静置30分钟，完全分层，使用紫外分光光度计在447nm测量上层有机相中叶黄素的吸光度值，通过叶黄素在乙酸乙酯中的吸光度值-叶黄素浓度标准曲线，得到叶黄素浓度，即叶黄素的溶解度。
21.进一步地，所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物中叶黄素和豌豆分离蛋白的结合率最高能够达到89.83％，即每100g蛋白最高能够结合0.43g叶黄素；
22.根据权利要求4或5所述高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的应用，其特征在于，将所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物应用于制备饮料、乳化肠、高内相乳液体系中。
23.本发明的有益技术效果：
24.(1)本发明提供的制备方法基于脂溶性叶黄素溶解特性及疏水性豌豆分离蛋白改性技术，利用“醇水互溶”原理，通过优化工艺参数，构建最佳结合率能够达到89.83％的豌豆分离蛋白-叶黄素复合物制备体系。其中，叶黄素/豌豆分离蛋白复合物溶液中，叶黄素浓度范围为13-65μm，豌豆分离蛋白的浓度范围为0.5-4.5mg/ml。该制备方法简单易操作，结合率高，经济实用，适合大规模的生产，应用前景广阔。
25.(2)本发明所制得的叶黄素-豌豆分离蛋白复合物水溶性高、粒度小、稳定性强，颜色均匀。目前，中国专利cn108308615a玉米肽负载叶黄素纳米颗粒可部分提高叶黄素溶解度(10倍以上)，而本发明中叶黄素-豌豆分离蛋白复合物在水中分散性好，叶黄素溶解度达48μg/ml，提高133倍以上；叶黄素-豌豆分离蛋白复合物以均一稳定的球形纳米颗粒形式均匀分布，平均粒径为20-40nm；叶黄素-豌豆分离蛋白复合物显著提高叶黄素在酸和热处理条件下的颜色稳定性和抗氧化活性，可广泛应用于食品、药品等领域，有效地扩大了叶黄素的应用范围。
26.(3)本发明采用叶黄素与蛋白质相互作用阻断叶黄素降解途径，制备获得稳定性高和溶解性好的豌豆分离蛋白-叶黄素复合纳米颗粒产品，显著提高了豌豆分离蛋白和叶黄素的附加值，研究成果可能为改善加工中叶黄素的颜色劣变提供新的解决思路；且使用材料均为食用材料，安全性高，可作用为食品和保健品直接食用，避免了传统纳米载体材料中有机化合物的残留。
附图说明
27.图1为本发明实施例中叶黄素浓度测定标准曲线；
28.图2为本发明实施例中不同浓度豌豆分离蛋白与叶黄素的结合率分析图；
29.图3a为本发明实施例中叶黄素溶解性实验结果图；
30.图3b为本发明实施例中豌豆分离蛋白溶解性实验结果图；
31.图3c为本发明实施例中复溶后的lut-ppi复合物溶解性实验结果图；
32.图4为本发明实施例中酸性条件下lut、ppi、lut-ppi总抗氧化能力的损失率图；
33.图5a为本发明实施例中热处理前后叶黄素的总抗氧化能力图；
34.图5b为本发明实施例中高温条件下lut、ppi、lut-ppi总抗氧化能力的损失率图；
35.图6为本发明实施例中ppi和lut-ppi的表面疏水性比较图；
36.图7为本发明实施例中lut、ppi和lut-ppi的红外光谱比较图；
37.图8a为本发明实施例中ppi的透射电镜图像；
38.图8b为本发明实施例中lut-ppi的透射电镜图像；
39.图9为本发明实施例中lut与ppi的结合能图；
具体实施方式
40.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
41.相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
42.本发明提供一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的制备方法实施例，所述制备方法包括：
43.(1)叶黄素溶液制备：将叶黄素溶于无水乙醇中，得到叶黄素溶液；
44.(2)豌豆分离蛋白溶液制备：将豌豆分离蛋白粉分散于超纯水中，搅拌形成分散液，加入naoh溶液，在一定温度下恒温振荡一定时间，使豌豆分离蛋白粉完全溶解；冷却至室温，加入hcl溶液调节ph值，得到豌豆分离蛋白溶液；
45.(3)叶黄素/豌豆分离蛋白复合物制备：将所述豌豆分离蛋白溶液稀释至目标浓度后与所述叶黄素溶液按照一定体积比混合；室温下振荡一定时间，获得叶黄素/豌豆分离蛋白复合物溶液；冷冻干燥后获得叶黄素/豌豆分离蛋白复合物(lut-ppi复合物)。
46.在本实施例步骤(1)中，制备获得浓度为13-65μm的叶黄素溶液。叶黄素为脂溶性色素，不溶于水，可溶于有机溶剂，如乙醇、乙酸乙酯，丙酮等。采用乙酸乙酯，丙酮等溶剂溶解叶黄素时，未能实现与豌豆分离蛋白水体系充分互溶。采用与水互溶的乙醇作为溶剂溶解叶黄素，可以获得稳定且充分互溶的叶黄素/豌豆分离蛋白复合物溶液。
47.在本实施例步骤(2)具体为：
48.将豌豆分离蛋白粉分散于超纯水中，通过磁力进行持续搅拌20-30min获得豌豆分离蛋白分散液；向所述豌豆分离蛋白粉分散液中加入0.1-1mol/l naoh溶液，调节ph值至11.5-12.0，在83-87℃恒温振荡器中振荡25-30min，促使豌豆分离蛋白的结构展开，使豌豆分离蛋白完全溶解；为防止热处理诱导豌豆分离蛋白过度变性，迅速将样品置于冰水5-10min冷却至室温，用0.1-1mol/l的hcl溶液调节ph值至7.4-7.8，得到浓度为5mg/ml的豌豆分离蛋白溶液。
49.在本实施例步骤(3)中，得到的所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物溶液中，叶黄素浓度范围为13-65μm，豌豆分离蛋白的浓度范围为0.5-4.5mg/ml。
50.具体地，在本实施例中，将0.5-4.5mg/ml的豌豆分离蛋白溶液与13-65μm的叶黄素溶液以9：1的体积比混合，室温下振荡25-30min形成lut-ppi复合物溶液，最终得到的45个lut-ppi复合物溶液样品。样品中叶黄素和豌豆分离蛋白的浓度分别为13、26、39、52、65μm和0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mg/ml。
51.本发明还提供一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物实施例，采用上述方法制备，本发明通过结合率测定，筛选叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的最佳浓度；通过测定复合物的水溶性变化，以及外源加工条件(热、ph)对复合物颜色稳定性和总抗氧化能力t-aoc的影响，分析叶黄素/豌豆分离蛋白复合物对于叶黄素稳定性的保护作用，以期为叶黄素稳定性的提高提供一种新的途径，表1为采用的材料与试剂。
52.表1材料与试剂
[0053][0054]
叶黄素/豌豆分离蛋白结合率测定及结果分析：通过乙酸乙酯提取法测定叶黄素与豌豆分离蛋白的结合率，主要操作如下：
[0055]
(1)标准曲线的绘制：在5ml离心管中分别加入1.0ml浓度为0、13、26、39、52、65μm的叶黄素标准溶液，再加入3ml乙酸乙酯，充分混合30秒，静置30分钟，使其完全分层，使用紫外分光光度计在447nm测量上层有机相中叶黄素的吸光度值，以乙酸乙酯作为空白对照，绘制标准曲线，如图1所示。
[0056]
(2)游离叶黄素浓度测定：从配制好的45个lut-ppi复合物样品(叶黄素和豌豆分离蛋白的浓度分别为13、26、39、52、65μm和0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mg/ml)中分别取1.0ml加入5ml离心管中，再加入3ml乙酸乙酯，充分混合30秒，静置30分钟，使其完全分层，使用紫外分光光度计在447nm测量上层有机相中叶黄素的吸光度值。通过叶黄素在乙酸乙酯中的吸光度值-叶黄素浓度标准曲线y＝0.0250x-0.0178(r2＝0.9994)，得到lut-ppi复合溶液中游离叶黄素浓度。使用以下公式计算叶黄素与豌豆分离蛋白的结合率：
[0057][0058]
叶黄素/豌豆分离蛋白复合物结合率分析：通过将不同浓度豌豆分离蛋白(0.5-4.5mg/ml)加入到13-65μm的叶黄素醇溶体系中制备lut-ppi复合物。以结合率为指标，浓度为26μm的叶黄素与不同浓度豌豆分离蛋白结合时，结合率最高。如图2所示，浓度为26μm的叶黄素与不同浓度豌豆分离蛋白结合时，随着蛋白浓度的增加，叶黄素和豌豆分离蛋白的结合率也逐渐增大，但当蛋白浓度超过3.5mg/ml后，二者结合率无显著性变化(p》0.05)，此时最佳结合率为89.83％。研究发现随着蛋白浓度的不断增大，二者结合率一定范围内呈线
性增长，但较高浓度的豌豆分离蛋白可能会导致其自聚集，从而减少自身与叶黄素的结合，并削弱其对叶黄素的保护作用，故二者结合率不会无限增大。因此，lut-ppi复合物中叶黄素和豌豆分离蛋白的浓度分别选定为最佳结合率条件下的26μm和3.5mg/ml，即每100g蛋白可以结合0.43g叶黄素，以此浓度制备叶黄素/豌豆分离蛋白复合物，用于后续研究。
[0059]
叶黄素/豌豆分离蛋白复合物水溶性测定：分别取未处理的0.006g叶黄素粉末、1.394g豌豆分离蛋白粉末与1.4g最佳结合率条件下的lut-ppi复合物冻干粉溶于100ml超纯水中，3000rpm/10min离心后，取上清液分别测定叶黄素和豌豆分离蛋白的溶解度，测定方法如下：
[0060]
(1)叶黄素水溶性测定：将1.4g lut-ppi复合物冻干粉溶于100ml水中，取1.0ml加入5ml离心管中，再加入3ml乙酸乙酯，充分混合30秒，静置30分钟，使其完全分层，使用紫外分光光度计在447nm测量上层有机相中叶黄素的吸光度值，通过叶黄素在乙酸乙酯中的吸光度值-叶黄素浓度标准曲线y＝0.0250x-0.0178(r2＝0.9994)，得到叶黄素浓度，即叶黄素的溶解度。
[0061]
(2)豌豆分离蛋白水溶性测定：通过考马斯亮蓝法，按照总蛋白测定试剂盒说明书测定上清液中豌豆分离蛋白的含量，并计算其溶解度。
[0062]
(3)复合体系叶黄素、豌豆分离蛋白水溶性测定：lut-ppi复合物冻干粉溶于100ml超纯水中，3000rpm离心10min取上清液。按照上述方法分别测定溶解于上清液中游离叶黄素、豌豆分离蛋白的溶解度。
[0063]
叶黄素/豌豆分离蛋白复合物水溶性结果分析：如图3a-图3c和表2所示，单独的叶黄素或未改性的豌豆分离蛋白在水中均不溶解，而lut-ppi复合物具备良好的水溶性，溶液澄清透明，说明叶黄素和豌豆分离蛋白相互作用对叶黄素的水溶性有明显的改善作用。对溶解度进行测定，发现游离叶黄素溶解度为0.36μg/ml，复合物中叶黄素溶解度为48μg/ml，提高了133倍，说明叶黄素与豌豆分离蛋白结合有效改善了叶黄素的水溶性；当叶黄素/豌豆分离蛋白形成新的复合物时，由于冻干过程中豌豆分离蛋白对叶黄素的保护，包裹的叶黄素在干燥粉末中的水溶解度显著提高。
[0064]
表2叶黄素、豌豆分离蛋白和lut-ppi复合物冻干粉的水溶性
[0065][0066]
(4)外源条件下叶黄素/豌豆分离蛋白复合物颜色和总抗氧化活性评价：将lut乙醇溶液以lut：水＝1：9(v/v)的比例向其中加入超纯水混合，将ppi溶液以乙醇：ppi＝1：9(v/v)的比例向其中加入无水乙醇混合，使溶液中叶黄素浓度、豌豆分离蛋白浓度及溶剂组成均与lut-ppi复合物溶液相同。将三组样品的ph值分别调整为2.0、4.0、7.0、10.0，4℃静置4h后6000rpm/10min离心，分别测定其ph处理前后颜色和总抗氧化活性(t-aoc)；将三组样品分别在65℃和121℃加热30min，加热完成后迅速冷却至室温，分别测定其热处理前后颜色和总抗氧化活性(t-aoc)。
[0067]
颜色的测定：采用分光测色仪测定ph或热处理前后样品的表观颜色值。测量孔选用4mm口径，用适合该仪器的黑白板校准。使用cielab进行颜色评估，分光测色仪显示光度
(l*)、红(+a*)或绿(-a*)、黄(+b*)或蓝(-b*)，同时δe可用于描述颜色变化的总色差，可通过以下公式获得：
[0068][0069]
其中，l0*、a0*和b0*是l*、a*和b*的初始值，表示未处理样品的颜色坐标。经ph或热处理的样品的颜色坐标为l*、a*和b*。
[0070]
总抗氧化活性(t-aoc)的测定：按照总抗氧化能力(t-aoc)检测试剂盒说明书绘制标准曲线并测定ph或热处理前后三组样品的总抗氧化能力。
[0071]
外源条件下叶黄素/豌豆分离蛋白复合物颜色稳定性结果分析：由于叶黄素在光、热等外源加工条件下稳定性差，提高其颜色稳定性具有重要意义。因此，本发明通过测定颜色变化评价热和不同ph条件下豌豆分离蛋白对叶黄素颜色的保护作用。如表3、4所示，ph和温度会对叶黄素颜色造成不可逆的影响。
[0072]
由表3可以看出，单独叶黄素在ph处理后，l*、a*和b*值均发生显著变化(p《0.05)，且δe值均大于1，其中酸性条件下，总色差值δe超过2，说明叶黄素发生明显褪色，通常色差值大于2时，表明两个样品间存在明显区别，说明酸性条件对于叶黄素颜色的破坏作用最大，这可能是由于酸性条件下叶黄素会发生去酯化和顺/反异构化，导致颜色损失，而在中性和碱性条件下则相对稳定。观察lut-ppi复合物的数值，除ph为4的条件下，其余酸性、碱性环境下总色差值δe值均小于1，无明显颜色变化，说明豌豆分离蛋白在酸碱性条件对于叶黄素颜色具有明显的保护效果，ph 4条件下颜色损失较大是因为ph 4为豌豆分离蛋白等电点，此时豌豆分离蛋白沉淀，无法与叶黄素结合形成复合物，因此无法发挥作用。由此可知，在有ph因素影响的加工过程中，排除豌豆分离蛋白等电点的情况下，lut-ppi复合物对于叶黄素颜色均具有明显的保护效果。
[0073]
由表4可知，叶黄素在经过65℃或121℃高温处理后，l*、a*和b*值均发生显著性下降，说明其亮度下降，颜色变浅，同时δe值分别为1.48和2.58，说明高温对于叶黄素颜色有明显影响，其中121℃条件下影响更大，而lut-ppi复合物在热处理后δe值分别下降至0.23和1.27，说明豌豆分离蛋白对于叶黄素热处理过程中的颜色损失具有保护效果，但叶黄素的颜色在121℃条件下相对损失较大，因此在lut-ppi复合物加工过程中，灭菌环节建议选用巴氏杀菌。
[0074]
表3lut、ppi、lut-ppi复合物ph处理前后颜色分析
[0075]
[0076][0077]
表4lut、ppi、lut-ppi复合物热处理前后颜色分析
[0078][0079]
外源条件下叶黄素/豌豆分离蛋白复合物总抗氧化活性结果分析：由图4可知，ph为2时，叶黄素、豌豆分离蛋白、lut-ppi复合物的t-aoc损失率分别为81.68％、58.28％、40.47％，lut-ppi复合物的损失率显著低于单独的叶黄素溶液和单独的豌豆分离蛋白溶液，这说明二者结合形成的复合物相对稳定，对于叶黄素和豌豆分离蛋白的抗氧化能力均具有保护作用。但ph为4条件下叶黄素、豌豆分离蛋白、lut-ppi复合物的t-aoc损失率均在80％以上，这也是由于豌豆分离蛋白的等电点导致其沉淀，无法发挥对于叶黄素的保护作用，与颜色稳定性的结果一致。
[0080]
由图5a可知，叶黄素在65℃和121℃处理30min后，t-aoc由0.6μmol/ml分别降至0.11μmol/ml和0.13μmol/ml，说明热处理对于叶黄素的t-aoc影响较大。然而，如图5b所示，65℃处理后叶黄素、豌豆分离蛋白、lut-ppi复合物的t-aoc损失率分别为81.17％、48.76％、38.60％，121℃处理后叶黄素、豌豆分离蛋白、lut-ppi复合物的t-aoc损失率分别为77.91％、74.18％、64.17％，可以看出65℃和121℃条件下lut-ppi复合物的t-aoc损失率均显著低于叶黄素与豌豆分离蛋白的t-aoc损失率，说明热处理诱导豌豆分离蛋白结构展
id:5xnl)从蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)获得。使用autodock vina进行分子对接。并使用discovery studio 4.5(accelrys inc,san 205diego,ca,usa)对分子对接结果进行分析。
[0093]
叶黄素对豌豆分离蛋白表面疏水性的影响：表面疏水性(h0)是测量蛋白质功能特性的重要指标之一，可以反映蛋白质表面疏水基团的数量和蛋白质分子的聚集趋势。8-苯胺-1-萘磺酸(ans)是一种荧光“疏水探针”，可以反应蛋白质的亲水性/疏水性的变化。ppi和lut-ppi复合体系的h0值变化如图6所示，加入叶黄素后，ppi的h0显著降低，说明lut与ppi的相互作用降低了ppi的表面疏水性h0。可能的原因是：(1)ppi与lut之间存在疏水相互作用力，ppi表面的疏水性残基成为lut的结合位点，从而减少了与ans荧光探针结合的可能性；(2)在与ppi结合时，lut引入的羟基等亲水性基团增加了ppi的表面亲水性；(3)lut与ppi结合改变了ppi的蛋白构象，从而使其亲水基团暴露。
[0094]
叶黄素/豌豆分离蛋白紫外吸收光谱分析：如表5可知，低浓度时，lut在450nm处出现吸收峰，随着浓度的增加，26μm时，385nm处出现一个新的吸收峰，峰位置的变化表示lut结构发生改变。lut具有高度疏水特性，在亲水环境中易形成聚集体，同时lut分子两端的游离羟基通过分子间氢键的形成也促进了lut强耦合(h型)聚集体的形成，并且在65μm lut-ppi复合物中，450nm的吸收峰完全消失，说明在此浓度下叶黄素主要以聚集形式存在，因此在有机-水体系中，叶黄素与蛋白质大分子的相互作用至少部分涉及其聚集形式。
[0095]
表5lut-ppi的最大吸收峰峰值(λ
max
)
[0096][0097]
叶黄素/豌豆分离蛋白圆二色谱分析：圆二色谱是监测单个蛋白质或与配体结合的蛋白质构象变化的敏感技术，为明确蛋白质结构具体变化，利用cdpro软件拟合复合体系α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构的含量。如表6所示，与lut结合后，ppi的α-螺旋结构由72.5％下降至68.9％，而β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构均略有增加，进一步确定ppi与lut的相互作用导致了ppi结构的展开及二级结构的变化。
[0098]
表6ppi复合前后二级结构变化
[0099][0100]
叶黄素/豌豆分离蛋白傅里叶变换红外光谱分析：傅里叶变换红外光谱常用于研究小分子与蛋白质的相互作用。如图7所示，在1631cm-1
处和1039cm-1
处分别观察到lut的特征峰，这分别代表lut的官能团c＝c和-oh。且lut在波数1722cm-1
、1039cm-1
、967cm-1
处的特征峰均未在lut-ppi中出现，表明lut与ppi间存在相互作用，形成了复合物。
[0101]
酰胺i带(1700-1600cm-1
)代表c＝o拉伸振动；酰胺ii带(1600-1500cm-1
)代表c-n
拉伸、n-h弯曲。ppi的光谱分别在1650、1538cm-1
处显示酰胺i、酰胺ii条带，加入lut后，这两个吸收峰分别移动到1647、1536cm-1
，且峰强降低。本发明中可以看出二者相互作用的存在，且ppi的二级结构发生变化，这与圆二色谱的结果一致。同时，峰强降低表明lut与ppi间存在疏水相互作用力，这与表面疏水性结果一致。
[0102]
叶黄素/豌豆分离蛋白透射电子显微镜分析：如图8a、图8b所示，ppi的形状、大小不规则，一些蛋白发生了团聚现象。然而，lut-ppi复合物表现为球形纳米颗粒，平均粒径为20-40nm，明显小于单独的ppi，表现出较小的粒径和规则均一的分布。
[0103]
叶黄素/豌豆分离蛋白分子对接模拟：通过分子对接模拟探究lut与ppi的相互作用。结合能越低，发生结合作用的可能性越大，复合物越稳定。本发明通过结合能分析找出结合能最低的位点，确定该位点附近的氨基酸组成及其和叶黄素的相互作用类型。如图9所示，lut与ppi不同位点的结合能的范围为-4.52kcal/mol-7.2kcal/mol。最低结合能为-7.2kcal/mol，说明lut与ppi的结合过程在能量上是有利的，因此被选为后续研究的最佳位点。
[0104]
通过选取最佳结合位点(结合能最低)作为研究对象，进一步分析对接位点周围的氨基酸组成及作用力类型。如表7所示，ppi周围和lut相互作用的氨基酸残基包括一些疏水残基(如phe431、ile183、met328)、极性残基(如tyr161、asn191)和带电残基(如his190)。其中phe431、ile183、ile326、met328、leu184、tyr161、his190等与lut形成疏水相互作用，这与荧光猝灭及表面疏水性结果相一致，充分证明了疏水相互作用驱动豌豆分离蛋白/叶黄素相互作用。此外，还有其他的结合力，如π键、氢键、碳氢键等，多种形式的作用力为lut-ppi复合物的稳定性提供了必要条件。
[0105]
表7lut与ppi结合的氨基酸残基及对应作用力
[0106][0107]
综上可知：lut-ppi复合物的紫外吸收强度随lut浓度的增加而增加，同时，吸收峰由450nm逐渐偏移至385nm，表明随着lut浓度的增加，其高度疏水特性以及分子两端的游离羟基通过分子间氢键的形成促进了lut强耦合(h型)聚集体的形成，因此26μm lut-ppi复合物中，lut以分散形式和聚集形式共同存在。进一步，通过圆二色谱、傅里叶变换红外光谱、透射电镜测定发现，26μmlut-ppi的相互作用导致了ppi结构的展开及二级结构的变化，表现出lut-ppi复合体中ppi的α-螺旋结构减少，β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构有所增加，同时酰胺i带和酰胺ii带对应的吸收峰移动且峰强变小；26μm lut-ppi复合体系中，lut与ppi形成均一稳定球形纳米颗粒，平均粒径为20-40nm，其结构更加致密且稳定。
[0108]
本发明还提供一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的应用：将所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物应用于制备饮品；通过感官评价确定lut-ppi功能饮品的配方为6.0mg lut，1.4g ppi，1.5g木糖醇，0.04g柠檬酸，5.0g柑橘纤维，3.0g枸杞粉，100ml水。此款饮品呈亮黄色，颜色均匀，抗氧化能力为220
±
4.2μmol/ml，稳定性系数为85.05％，离心沉淀率为2.46％。通过构建货架期预测模型，发现4℃，25℃，37℃温度下此款饮品的理论货架期为
217天，109天，76天。
[0109]
本发明针对外源加工条件下富含叶黄素产品颜色劣变、水溶性差、生物活性损失等问题，基于叶黄素与蛋白质相互作用阻断叶黄素降解新思路制备获得叶黄素/豌豆分离蛋白复合物，并分析该复合物在外源加工条件下的颜色稳定性和抗氧化活性变化，明确叶黄素与豌豆分离蛋白相互作用机理，探讨两者在食品体系中基于色素-蛋白相互作用的应用策略，为外源加工条件下富含叶黄素产品的颜色稳定性、生物活性保持奠定理论基础。研究成果可能为改善加工中叶黄素的颜色劣变和生物活性损失提供新的解决思路，对于推动叶黄素相关产品的加工和产业化具有重要的意义。
[0110]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：(1)叶黄素溶液制备：将叶黄素溶于无水乙醇中，得到叶黄素溶液；(2)豌豆分离蛋白溶液制备：将豌豆分离蛋白粉分散于超纯水中，搅拌形成分散液，加入naoh溶液，在一定温度下恒温振荡一定时间，使豌豆分离蛋白完全溶解；冷却至室温，加入hcl溶液调节ph值，得到豌豆分离蛋白溶液；(3)叶黄素/豌豆分离蛋白复合物制备：将所述豌豆分离蛋白溶液稀释至目标浓度后与所述叶黄素溶液按照一定体积比混合；室温下振荡一定时间，得到叶黄素/豌豆分离蛋白复合物溶液；冷冻干燥后获得高水溶性的叶黄素/豌豆分离蛋白复合物。2.根据权利要求1所述一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，制备获得的所述叶黄素溶液中叶黄素浓度为13-65μm。3.根据权利要求1所述一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体为：将豌豆分离蛋白分散于超纯水中，通过磁力进行持续搅拌20-30min获得豌豆分离蛋白分散液；向所述豌豆分离蛋白分散液中加入浓度为0.1-1mol/l的naoh溶液，调节ph值至11.5-12.0，在83-87℃恒温振荡器中振荡25-30min，促使豌豆分离蛋白的结构展开，使豌豆分离蛋白完全溶解；为防止热处理诱导豌豆分离蛋白过度变性，迅速将完全溶解后豌豆分离蛋白溶液置于冰水5-10min冷却至室温，用浓度为0.1-1mol/l的hcl溶液调节ph值至7.4-7.8，得到浓度为0.5-4.5mg/ml的豌豆分离蛋白溶液。4.根据权利要求1所述一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，得到的所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物溶液中，叶黄素浓度范围为13-65μm，豌豆分离蛋白的浓度为0.5-4.5mg/ml。5.一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物，采用权利要求1-4任一项所述方法制备，其特征在于，所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物是通过叶黄素和豌豆分离蛋白之间的疏水相互作用自发结合而成，所述叶黄素和所述豌豆分离蛋白结合形成均一稳定的球形纳米颗粒，所述球形纳米颗粒的平均粒径为20-40nm；所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物冻干粉中叶黄素的溶解度最高达到48μg/ml。6.根据权利要求5所述一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物，其特征在于，所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物冻干粉中叶黄素的溶解度的测定方法为：将1.4g叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的冻干粉溶于100ml水中，取1.0ml加入5ml离心管中，再加入3ml乙酸乙酯，充分混合30秒，静置30min，完全分层，使用紫外分光光度计在447nm测量上层有机相中叶黄素的吸光度值，通过叶黄素在乙酸乙酯中的吸光度值-叶黄素浓度标准曲线，得到叶黄素浓度，即叶黄素的溶解度。7.根据权利要求5所述一种高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物，其特征在于，所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物中叶黄素和豌豆分离蛋白的结合率最高能够达到89.83％，即每100g豌豆分离蛋白最高能够结合0.43g叶黄素。8.根据权利要求4或5所述高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物的应用，其特征在于，将所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物应用于制备饮料、乳化肠、高内相乳液体系中。

技术总结
本发明属于叶黄素加工技术领域，具体涉及高水溶性叶黄素/豌豆分离蛋白复合物及制备方法和应用。所述制备方法包括：(1)将叶黄素溶于无水乙醇中，得到叶黄素溶液；(2)将豌豆分离蛋白分散于超纯水中，搅拌形成分散液，加入NaOH溶液，在一定温度下恒温振荡一定时间，使豌豆分离蛋白完全溶解；冷却至室温，加入HCl溶液调节pH值，得到豌豆分离蛋白溶液；(3)将所述豌豆分离蛋白溶液稀释至目标浓度后与所述叶黄素溶液按照一定体积比混合；室温下振荡一定时间，冷冻干燥后获得叶黄素/豌豆分离蛋白复合物。本发明提供的所述叶黄素/豌豆分离蛋白复合物中叶黄素的溶解度最高达到48μg/mL；能够用于制备饮料、乳化肠、高内相乳液体系中。高内相乳液体系中。高内相乳液体系中。


技术研发人员：李媛媛 裴海生 翟晓娜 于良晓 胡雪芳 梁亮
受保护的技术使用者：农业农村部规划设计研究院
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/23