旱柳响应淹水胁迫的转录调控因子及其编码基因和应用

gal和100ug/ml氨苄青霉素的lb固体培养基培养过夜，挑单菌落，lb液体培养基培养过夜，提取质粒，得到重组t载体，即pmd18-t-smttf23。
14.一方面还提供了一种含有上述的基因的重组植物表达载体，所述重组植物表达载体的获得包括以下步骤：
15.(1)连接植物表达载体pwm101：以含有基因的重组t载体pmd18-t-smttf23为模板，利用引物3和引物4进行pcr扩增，得到pcr产物2，其核苷酸序列如seq id no:4所示；
16.引物3：pwm101-smttf23-f tcgagctttcgcgagctcggtaccatggagggacatcttcgcca；
17.引物4：pwm101-smttf23-r gcatgcctgcaggtcgactctagacgccatggtgcctaaagctt；
18.(2)重组植物表达载体的获得：将步骤(1)得到的pcr产物2和线性化pwm101载体进行重组连接，连接产物进行大肠杆菌dh5α感受态细胞转化，在含有50ug/ml卡那霉素的lb固体培养基培养过夜，挑单菌落，lb液体培养基培养过夜，提取质粒，得到重组植物表达载体，即pwm101-smttf23。
19.再一方面提供了一种含有上述基因的转基因拟南芥，所述转基因拟南芥的获得包括以下步骤：
20.重组植物表达载体pwm101-smttf23转化农杆菌gv3101的感受态细胞，得到重组菌gv3101/pwm101-smttf23，将重组菌gv3101/pwm101-smttf23转化拟南芥，在含50mg/l潮霉素的ms培养基上筛选阳性转基因株系t1代，t1代转基因株系经过两个世代的培养和筛选过程得到纯合的t3代转smttf23基因拟南芥种子，将t3代转基因拟南芥种子直接播种，在温室长日照条件下正常生长，得到转基因拟南芥。
21.本发明另一方面提供了所述的基因在植物耐盐中的应用。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
23.本发明提供的基因为转录调控因子，具有响应淹水胁迫，调节植物的耐淹性的功能，得到的含有smttf23基因的转基因拟南芥耐淹性显著提高，为植物耐淹性的研究中提供了优质的基因资源。
附图说明
24.图1为smttf23基因在wt、l1和l5转基因株系中的表达水平；
25.图2为smttf23基因在wt、l1和l5转基因株系中淹水后的表达水平；
26.图3为wt、l1和l5转基因株系淹水不同时间点的表型观测结果；
27.图4为wt、l1和l5转基因株系淹水后叶片伊文思蓝染色结果；
28.图5为正常条件下和淹水胁迫处理下5day野生型和转基因l1和l5株系植株叶片丙二醛含量的变化；
29.图6为正常条件下和淹水胁迫处理下5day野生型和转基因l1和l5株系植株叶片过氧化物酶活性变化。
具体实施方式
30.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施
例，都属于本发明的保护范围。
31.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的药品、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.实施例1：smttf23基因的编码序列和蛋白质序列的获得
33.参考中国专利cn110484599a中介绍的基于多组学测定发掘旱柳耐盐基因的方法，结合旱柳基因组基因序列注释信息和耐淹型与敏淹型旱柳植株淹水胁迫条件下的差异表达基因数据，筛选出旱柳smttf23基因，其基因编码序列和蛋白质序列如seq id no:1和seq id no:2所示。经过和phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中红柳(salixpurpurea)基因组信息进行blast比对，确定为旱柳响应淹水胁迫转录调控因子，命名为smttf23。
34.上述基因编码序列可以通过人工合成和体外pcr扩增技术获得。
35.实施例2：含smttf23基因的重组t载体的获得
36.重组t载体的获得包括以下步骤：
37.(1)smttf23基因的获得：提取旱柳叶的rna，反转录合成cdna，利用以下引物进行pcr扩增，得到pcr产物1，即smttf23 cdna序列。
38.引物1：smttf23 cds-f
[0039]5’‑
atggagggacatcttcgcca-3’；
[0040]
引物2：smttf23 cds-r
[0041]5’‑
cgccatggtgcctaaagctt-3’；
[0042]
pcr反应条件：94℃预变性5min，95℃30sec，54℃30sec，72℃60sec，共35个循环；72℃延伸5min。
[0043]
将pcr产物1进行测序，其核苷酸序列如seq id no:3所示，由840个核苷酸组成，可编码seq id no:2所示的蛋白质smttf23。
[0044]
(2)重组t载体的获得：在步骤(1)得到的pcr产物1末端加a，与pmd18-t载体(takara)连接，得到的连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞细胞(购自宝生物公司)，并涂布在含有5-溴-4-氯-3-吲哚
‑‑
d-半乳糖苷、x-gal和100ug/ml氨苄青霉素的lb固体培养基上培养过夜，挑取白色单菌落，在lb液体培养基中培养过夜并进行菌落pcr鉴定，同时碱法提取质粒dna进行ecori单酶切分析和序列测定。
[0045]
用限制性内切酶ecori进行酶切，得到酶切产物(含有上述seq id no:3所示的smttf23基因的dna片段)。将pmd18-t载体重组质粒进行测序，测序结果表明，质粒为将序列表中seq id no:1或seq id no:3所示的smttf23基因插入pmd18-t载体的重组载体，命名为pmd18-t-smttf23。
[0046]
实施例3：含smttf23基因的重组植物表达载体的获得
[0047]
重组植物表达载体的获得包括以下步骤：
[0048]
(1)连接植物表达载体pwm101：以实施例2得到的pmd18-t-smttf23质粒为模板，利用以下引物进行pcr扩增，得到pcr产物2。
[0049]
引物3：pwm101-smttf23-f tcgagctttcgcgagctcggtaccatggagggacatcttcgcca；
[0050]
引物4：pwm101-smttf23-r gcatgcctgcaggtcgactctagacgccatggtgcctaaagctt；
[0051]
pcr产物2的两端各添加了植物表达载体pwm101的18个核苷酸序列，且分别包含
kpni和xbai酶切位点，产物序列如seq id no:4所示。
[0052]
(2)重组植物表达载体的获得：将步骤(1)得到的pcr产物2和经kpni和xbai酶切线性化的pwm101载体进行重组连接，连接产物进行大肠杆菌dh5α感受态细胞(购自宝生物公司)转化，并涂布在含有50ug/ml卡那霉素的lb平板上培养过夜，挑取单菌落，在lb液体培养基中培养过夜并进行菌落pcr鉴定，同时碱法提取质粒dna进行kpni单酶切鉴定。
[0053]
用限制性内切酶kpni进行单酶切，得到酶切产物(含有上述seq id no:1和4中所示的smttf23基因的dna片段)。将重组质粒进行测序，测序结果表明，质粒为将序列表中seq id no:1或4所示的smttf23基因插入载体pwm101的重组载体，命名为pwm101-smttf23。
[0054]
实施例4：转smttf23基因拟南芥的获得
[0055]
将实施例3得到的重组植物表达载体pwm101-smttf23转化农杆菌gv3101的感受态细胞，得到重组菌gv3101/pwm101-smttf23，将重组菌gv3101/pwm101-smttf23通过花序浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(col-0)(购自abrc)，含50mg/lhyg(潮霉素)的ms培养基筛选阳性转基因株系t1代，t1代转基因株系经过两个世代的培养和筛选过程得到纯合的t3代转smttf23基因拟南芥种子，将t3代转基因拟南芥种子直接播种到培养土中，在温室长日照条件下正常生长，得到转基因拟南芥。其中l1和l5为转基因代表株系。
[0056]
实施例5：转smttf23基因拟南芥的检测
[0057]
1、rt-pcr检测smttf23基因表达水平
[0058]
提取t3代转smttf23拟南芥株系(l1,l5)和野生型拟南芥(wt)全株的rna，反转录得到cdna，以其为模板，用如下引物进行pcr扩增。以野生型拟南芥为对照。
[0059]
引物5：5
’‑
ggagcaagttgtagtactggtg-3’[0060]
引物6：5
’‑
ttcttctctcgcccttctctg-3’。
[0061]
结果如图1所示，两个t3代转smttf23拟南芥株系(l1,l5)中smttf23的表达量显著高于野生型拟南芥(wt)，表明smttf23基因在t3代转smttf23拟南芥高水平表达。
[0062]
实施例6：转smttf23拟南芥耐淹表型分析
[0063]
1、耐淹性试验
[0064]
取野生型拟南芥(wt)、两个t3代转smttf23(l1,l5)株系种子点在1/2ms培养基上生长两周。将两周龄的拟南芥幼苗转移至泥炭土：蛭石(3：1)混合基质中，温室培养(16h/8h光照黑暗周期，20-22℃)至5周。淹水胁迫条件为用自来水淹没至植株5cm，处理5天，对照组(正常条件)浇灌等量的水，每组三个生物学重复。处理1天、3天和5天取植株叶片进行伊文思蓝染色。同时处理4h、12h、24h、48h和复氧4h、24h后取植株叶片进行丙二醛含量、过氧化物酶活性测定。
[0065]
结果如图2所示，淹水处理12h后，与淹水前相比，l1和l5转基因株系中的smttf23基因表达量明显上调，随后在复氧4h和24h后又较48h时显著上调。淹水复氧后，转基因株系l1和l5表现出比野生型更好的生长状态，叶片更绿、更舒展。图4所示在淹水5day时，野生型植株叶片细胞活性显著低于转基因植物。淹水胁迫5day后，植株mda含量上调，但野生型植株中mda含量明显高于转基因材料(图5)。淹水后pod含量上调，且转基因材料pod含量明显高于野生型(图6)。
[0066]
上述结果表明，smttf23转录因子能够增强耐淹性，且通过以下两个机制赋予了拟南芥转基因系更高的耐淹性。第一，淹水胁迫处理迅速引发转基因植株的响应，增强植株叶
片细胞活性，便于维持细胞内外氧气平衡。第二，淹水胁迫后，转基因植株能够通过增加过氧化物酶活性来，降低体内的过量活性氧产生所带来的损伤。
[0067]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化均视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种旱柳响应淹水胁迫的转录调控因子的基因，其特征在于：所述基因的序列如seq id no:1所示。2.一种由权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no2:所示。3.一种含有权利要求1所述的基因的重组t载体，其特征在于：所述重组t载体的获得包括以下步骤：(1)smttf23基因的获得：提取旱柳叶的rna，反转录合成cdna，利用引物1和引物2进行pcr扩增，得到pcr产物1，即smttf23 cdna序列，其核苷酸序列如seq id no:3所示；引物1：smttf23 cds-f5
’‑
atggagggacatcttcgcca-3’；引物2：smttf23 cds-r5
’‑
cgccatggtgcctaaagctt-3’；(2)重组t载体的获得：在步骤(1)得到的pcr产物1末端加a，与pmd18-t载体连接，得到的连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，含有5-溴-4-氯-3-吲哚
‑‑
d-半乳糖苷、x-gal和100ug/ml氨苄青霉素的lb固体培养基培养过夜，挑单菌落，lb液体培养基培养过夜，提取质粒，得到重组t载体，即pmd18-t-smttf23。4.一种含有权利要求1所述的基因的重组植物表达载体，其特征在于：所述重组植物表达载体的获得包括以下步骤：(1)连接植物表达载体pwm101：以含有权利要求1所述基因的重组t载体pmd18-t-smttf23为模板，利用引物3和引物4进行pcr扩增，得到pcr产物2，其核苷酸序列如seq id no:4所示；引物3：pwm101-smttf23-ftcgagctttcgcgagctcggtaccatggagggacatcttcgcca；引物4：pwm101-smttf23-rgcatgcctgcaggtcgactctagacgccatggtgcctaaagctt；(2)重组植物表达载体的获得：将步骤(1)得到的pcr产物2和线性化pwm101载体进行重组连接，连接产物进行大肠杆菌dh5α感受态细胞转化，在含有50ug/ml卡那霉素的lb固体培养基培养过夜，挑单菌落，lb液体培养基培养过夜，提取质粒，得到重组植物表达载体，即pwm101-smttf23。5.一种含有权利要求1所述的基因的转基因拟南芥，其特征在于：所述转基因拟南芥的获得包括以下步骤：将含有权利要求1所述基因的重组植物表达载体pwm101-smttf23转化农杆菌gv3101的感受态细胞，得到重组菌gv3101/pwm101-smttf23，将重组菌gv3101/pwm101-smttf23转化拟南芥，在含50mg/l潮霉素的ms培养基上筛选阳性转基因株系t1代，t1代转基因株系经过两个世代的培养和筛选过程得到纯合的t3代转smttf23基因拟南芥种子，将t3代转基因拟南芥种子直接播种，在温室长日照条件下正常生长，得到转基因拟南芥。6.一种如权利要求1所述的基因在植物耐盐中的应用。

技术总结
本发明提供了一种旱柳响应淹水胁迫转录调控因子及其编码基因和应用，涉及基因工程技术领域。基因来源于旱柳，命名为SmTTF23基因，基因的序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质为响应非生物胁迫的转录调控因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明提供的基因为转录调控因子，具有响应淹水胁迫，调节植物的耐淹性的功能，得到的含有SmTTF23基因的转基因拟南芥耐淹性显著提高，为植物耐淹性的研究中提供了优质的基因资源。中提供了优质的基因资源。中提供了优质的基因资源。


技术研发人员：陈艳红 杨杰 唐志璇 杨舞悦 黄梦凡 张健 余春梅 刘国元 钟非 连博琳
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/9/23