小麦干旱、高温胁迫相关蛋白TaGLYI7及其生物材料和应用

小麦干旱、高温胁迫相关蛋白taglyi7及其生物材料和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及小麦干旱、高温胁迫相关蛋白taglyi7及其生物材料和应用。


背景技术：

[0002][0003]
我国是世界上最大的小麦产出国和消费国，约占全世界每年小麦总产值的17％和消费总量的16％。小麦属于一种喜凉习性，一般在5-6月进入抽穗和灌浆阶段，这一时期极易遭受干热风的侵害，这些阶段的热胁迫会降低花粉活力，导致最终植株结实率降低和籽粒灌浆不饱满，使最终产量降低。在水资源匮乏的省份，小麦全生育期一直会处于缺水的状态，尤其小麦生育中后期干旱会迫使小麦提前成熟，进而使产量降低。另外土壤干旱程度的加剧和干旱时间的延长，同样还会使小麦叶片的光合强度、冠层蒸腾强度降低，生长明显受到抑制，严重时甚至会引起小麦绝收。
[0004]
为了适应极端温度和干旱胁迫，小麦体内建立了各种保护机制来应对热胁迫所造成的损害，包括改变细胞各组分含量、调节体内激素含量、分泌渗透调节物质等方法。
[0005]
育种家通过同源/异源基因过量表达或基因编辑技术等定向对植物逆境响应相关基因进行操作，可以使小麦育种适应当前环境而不会造成产量损失。同样的筛选当前品种或野生近缘种中优异单倍型，通过杂交、回交等方法定向改良目前已有主栽品种同样行之有效。因此解析与植物耐热/抗旱相关的优异基因资源，鉴定其中可用的优异等位变异便显得尤为重要。而目前小麦功能基因组学研究中，还未发现有报道可以同时提高小麦耐热性和抗旱性的等位变异。如何提供一种耐热性和抗旱性的生物标记用于抗性改造或筛选是现有技术面临的问题。


技术实现要素：

[0006]
本技术提供了小麦干旱、高温胁迫相关蛋白taglyi7及其生物材料和应用。
[0007]
为了解决上述问题，本技术提供了下述应用。
[0008]
蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下述任一种的应用：
[0009]
a1)调控植物干旱胁迫、高温胁迫抗性中的应用；
[0010]
a2)调控植物干旱胁迫、高温胁迫抗性中的应用和/或制备调控植物干旱胁迫、高温胁迫抗性产品中的应用；
[0011]
所述蛋白质为如下任一种：
[0012]
b1)氨基酸序列是序列3或4所示的蛋白质；
[0013]
b2)将b1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与所述蛋白质具有相同功能的蛋白质；
[0014]
b3)将b1)或b2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
[0015]
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
[0016]
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistencecost，perresiduegapcost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0017]
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
[0018]
上述蛋白质中，序列3(seq id no.3)由213个氨基酸残基组成。
[0019]
上述蛋白质中，序列4(seq id no.4)由216个氨基酸残基组成。
[0020]
序列3具体如下：
[0021]
mvnttaamvsggvlplaslnhisivcrsveesldfymnvlgftpirrpgsfdfdgawlfnygigihllqsehpeslpakkeinpkdnhisfqcesmvaverrlkelgipyiqrcveeggiyvdqiffhdpdgfmieicncdklpvvplagqnfamaackrvasvkqqqlpmpvaqvaqatpapaaaaasqcvpapnpalqrvggeeaahisca。
[0022]
序列4具体如下：
[0023]
mvnttaamvsggvlplaslnhisivcrsveesldfymnvlgftpirrpgsfdfdgawlfnygigihllqsehpeslpakkeinpkdnhisfqcesmvaverrlkelgipyiqrcveeggiyvdqiffhdpdgfmieicncdklpvvplagqnfamaackrvasvkqqqlpmpvaqvaqatpapaaaaasqcvpapnpalqrvggaylvrvrgggpg。
[0024]
本技术中，所述调控可为敲除或抑制或降低或下调。所述调控也可为增强或提高或上调
[0025]
上文中，所述敲除或抑制或降低或下调上述蛋白质的编码基因表达或上述蛋白的活性或含量可实现下述c1)-c3)；
[0026]
c1)抑制或降低或下调植物株高；
[0027]
c2)抑制或降低或下调植物干旱胁迫、高温胁迫抗性；
[0028]
c3)抑制或降低或下调植物开花时间。
[0029]
上文中，所述增强或提高或上调上述蛋白质的编码基因表达或上述蛋白的活性或含量可实现下述d1)-d3)；
[0030]
g1)增强或提高或上调植物株高；
[0031]
g2)增强或提高或上调植物干旱胁迫、高温胁迫抗性；
[0032]
g3)增强或提高或上调植物开花时间。
[0033]
上述的用途中，所述蛋白来源于小麦。
[0034]
上文中，所述小麦可为野生型小麦fielder。
[0035]
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；
5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
[0036]
上述述的用途中，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
[0037]
d1)抑制或降低或下调上所述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；
[0038]
d2)表达d1)所述核酸分子的编码基因；
[0039]
d3)含有d2)所述基因的表达盒；
[0040]
d4)含有d2)所述基因的重组载体、或含有d3)所述表达盒的重组载体；
[0041]
d5)含有d2)所述基因的重组微生物、或含有d3)所述表达盒的重组微生物、或含有d4)所述重组载体的重组微生物；
[0042]
d6)含有d2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有d3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有d4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0043]
d7)含有d2)所述基因的转基因植物组织、或含有d3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有d4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0044]
d8)含有d2)所述基因的转基因植物器官、或含有d3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有d4)所述重组载体的转基因植物器官；
[0045]
d9)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；
[0046]
d10)含有d9)所述核酸分子的表达盒；
[0047]
d11)含有d9)所述核酸分子的重组载体、或含有d10)所述表达盒的重组载体；
[0048]
d12)含有d9)所述核酸分子的重组微生物、或含有d10)所述表达盒的重组微生物、或含有d11)所述重组载体的重组微生物；
[0049]
d13)含有d9)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有d10)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有d11)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0050]
d14)含有d9)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有d10)所述表达盒的转基因植物组织、或含有d11)所述重组载体的转基因植物组织；
[0051]
d15)含有d9)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有d10)所述表达盒的转基因植物器官、或含有d11)所述重组载体的转基因植物器官。
[0052]
d2)或d9)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的抑制或降低或下调和/或增强或提高或上调蛋白质taglyi7编码基因表达的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的抑制或降低或下调蛋白质taglyi7编码基因表达的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，且具有抑制或降低或下调蛋白质taglyi7编码基因表达的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0053]
上述生物材料中，d3)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子
(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(beachy等人(1985)emboj.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。
[0054]
上述d3)中，可用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用ibppgm构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0055]
上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
[0056]
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistencecost，perresiduegapcost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0057]
上述d4)中，所述重组载体的骨架载体可为可为pwmb110载体或pbue411质粒。
[0058]
上述d5)所述的微生物可为农杆菌。所述农杆菌为eha105。
[0059]
上文中，所述b1)所述的核酸分子为编码序列为序列1的dna分子。
[0060]
上文中，所述b1)所述的核酸分子为基因序列为序列1的dna分子。
[0061]
上文中，所述b1)所述的核酸分子为编码序列为序列2的dna分子。
[0062]
上文中，所述b1)所述的核酸分子为基因序列为序列2的dna分子。
[0063]
序列1具体如下：
[0064]
atggtgaacacgacggcggctatggtgagcggcggcgtgctgccgctggcgtccctgaaccacatcagcatagtgtgcaggtcggtggaggagtcgctcgacttctacatgaacgtcctcgggttcacccccatccgccgcccc
ggctccttcgacttcgacggcgcatggctgttcaactacgggatcggcatccacctgctgcagtcggagcatccagagagcttaccggcgaagaaggagatcaaccccaaggataaccacatctccttccagtgcgagagcatggtggcggtggagcggcggctcaaggagctgggcatcccgtacatccagcggtgcgtggaggagggcggcatctacgtggaccagatcttcttccatgaccccgacggcttcatgatcgagatctgcaactgcgacaagctcccggtcgtcccgctcgccggccagaacttcgccatggccgcctgcaagagggtcgcctccgtcaagcaacagcagctgcccatgccagtcgcacaagtagcgcaagcaacccctgctccggcggcggccgcggcttcgcagtgcgttccggcgccgaacccggccttgcagcgcgtcggcggcgaggaggcggcgcatatctcgtgcgcgtga。
[0065]
序列2具体如下：
[0066]
atggtgaacacgacggcggctatggtgagcggcggcgtgctgccgctggcgtccctgaaccacatcagcatagtgtgcaggtcggtggaggagtcgctcgacttctacatgaacgtcctcgggttcacccccatccgccgccccggctccttcgacttcgacggcgcatggctgttcaactacgggatcggcatccacctgctgcagtcggagcatccagagagcttaccggcgaagaaggagatcaaccccaaggataaccacatctccttccagtgcgagagcatggtggcggtggagcggcggctcaaggagctgggcatcccgtacatccagcggtgcgtggaggagggcggcatctacgtggaccagatcttcttccatgaccccgacggcttcatgatcgagatctgcaactgcgacaagctcccggtcgtcccgctcgccggccagaacttcgccatggccgcctgcaagagggtcgcctccgtcaagcaacagcagctgcccatgccagtcgcacaagtagcgcaagcaacccctgctccggcggcggccgcggcttcgcagtgcgttccggcgccgaacccggccttgcagcgcgtcggcggcgcatatctcgtgcgcgtgaggggtggggggccggggtag。
[0067]
为了解决上述问题，本技术提供了一种培育低干旱胁迫、高温胁迫抗性植物的方法。
[0068]
所述包括下调或减弱或降低目的植物中上述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到低干旱胁迫、高温胁迫抗性植物，所述低干旱胁迫、高温胁迫抗性植物的干旱胁迫、高温胁迫抗性低于所述目的植物。
[0069]
为了解决上述问题，本技术提供了一种培育高干旱胁迫、高温胁迫抗性植物的方法。
[0070]
所述方法包括上调或增强或提高目的植物中上所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到高干旱胁迫、高温胁迫抗性植物，所述高干旱胁迫、高温胁迫抗性的干旱、高温抗性高于所述目的植物。
[0071]
上文中，所述干旱胁迫为由于干旱使植物可利用水分缺乏而生长明显受到抑制的现象。
[0072]
上文中，所述高温胁迫为自然大田条件下，小麦生长发育进程中所经受的极端高温温度作为一个具体实施例，高温胁迫为光照16小时40℃/黑暗8小时36℃)。
[0073]
上文中，所述干旱胁迫条件为自然大田条件下，小麦生长发育进程中所经受的极端干旱土壤水分条件，作为一个具体实施例，干旱为土壤相对含水量降低到4％以下)。
[0074]
上文中，所述高温胁迫可为苗期。
[0075]
上文中，所述高温胁迫为苗期，胁迫条件为40℃-38℃恒温培养48h，24℃恢复2-5天。
[0076]
上文中，所述高温胁迫条件可为40℃热胁迫处理24h。
[0077]
上述的方法在小麦育种中的应用。
[0078]
上述的应用、上述的方法中，所述植物为如下任一种：
[0079]
j1)单子叶植物；
[0080]
j2)禾本科植物；
[0081]
j3)小麦属植物；
[0082]
j4)小麦。
[0083]
上文中，所述小麦可为野生型小麦fielder。
[0084]
为了解决上述问题，本技术提供了下述应用。
[0085]
indel分子标记或检测所述indel分子标记或所述indel分子标记基因型的物质的下述任一种的应用，所述indel分子标记是序列为序列1第607位-617位的核酸分子：
[0086]
a1)在预测小麦干旱胁迫抗性中的应用；
[0087]
a2在制备预测小麦干旱胁迫抗性产品中的应用；
[0088]
a3)在预测小麦干高温迫抗性中的应用；
[0089]
a4)在制备预测小麦干高温迫抗性产品中的应用。
[0090]
上文中，序列1第607位-617位的核酸分子的序列为ggcggcgagga。
[0091]
上文中，indel分子标记的插入/缺失位点位于序列2的第606位-607位。
[0092]
所述物质可为产品。所述检测物质可包括检测上述分indel分子标记或其基因型的试剂、试剂盒和仪器。具体的说，为检测上述indel分子标记或其基因型进行核酸体外扩增所需的引物和其他试剂和仪器。
[0093]
所述seq id no.5包含indel分子标记区域。所述seq id no.5为taglyi7的基因的基因组序列，其包括内含子序列。在实际检测过程中indel分子标记可通过直接检测小麦各类种质资源的基因组dna，检测由indel分子标记反应的taglyi7基因转录的mrna、taglyi7mrna反转录的cdna的核苷酸多态性或taglyi7蛋白质氨基酸的多态性来检测分析。
[0094]
为了解决上述问题，本技术提供了鉴定或辅助鉴定小麦干旱胁迫、高温胁迫抗性的方法。
[0095]
所述方法包括检测待测小麦中上述indel分子标记基因型，根据待测小麦的所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦干旱胁迫、高温胁迫抗性：
[0096]
所述indel分子标记基因型为基因型hap1的小麦干旱胁迫、高温胁迫抗性高于或候选高于所述基因型为基因型hap2的小麦，所述基因型hap1是存在所述indel分子标记的纯合型，所述基因型hap2是不存在所述indel分子标记的纯合型。
[0097]
上文中，所述indel分子标记核酸分子为序列1第607位-617位。
[0098]
上文中，所述indel分子标记位点位于序列2的第606位-607位之间。
[0099]
上文中，indel分子标记位点形成两种特异性序列，存在所述indel分子标记的基因组会具有序列表中seq id no.5的第3362位-3473位的特异核酸分子。不存在所述indel分子标记的基因组具有序列表中seq id no.6的第3362位-3473位的特异核酸分子。
[0100]
上述述应用、方法中，所述小麦为小麦纯系或自交系。
[0101]
上述方法在小麦育种中的应用。
[0102]
上述述应用、方法中，所述育种的目的包括培育或选育低或高干旱胁迫、高温胁迫的小麦。
[0103]
上述应用、上述方法中，所述indel分子标记，或所述检测indel分子标记基因型的物质，为如下d1)、d2)、d3)或d4)：
[0104]
d1)含有特异性扩增所述indel分子标记的体外核酸扩增引物；
[0105]
d2)含有d1)所述体外核酸扩增引物的体外核酸扩增试剂；
[0106]
d3)含有d1)所述体外核酸扩增引物或d2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；
[0107]
d4)含有d1)所述体外核酸扩增引物、d2)所述体外核酸扩增试剂或d3)所述试剂盒的检测仪器。
[0108]
所述体外核酸扩增技术可为聚合酶链式反应(pcr)、链替代扩增(sda)、连接酶链式反应(lcr)和依赖核酸序列的扩增(nasba)、滚环核酸扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)、依赖解旋酶的等温扩增技术(hda)或qβ复制技术。
[0109]
本技术以聚合酶链式反应(pcr)为扩增手段，进行多态性检测。
[0110]
d1)中所述特异性扩增可通过扩增产物的在3.5％的琼脂糖凝胶中的迁移速率来检测indel分子标记的核苷酸序列。
[0111]
上述应用、方法和产品中，所述体外核酸扩增引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测。
[0112]
所述扩增引物可包括af1/ar1和af2/ar2。
[0113]
af1:5
’‑
gctgcagtcggagcatcca-3’；
[0114]
ar1:5
’‑
cagtagttcgaaggacgggg-3’；
[0115]
af2:5
’‑
acccggccttgcagcgcgt-3’；
[0116]
ar2:5
’‑
ccagttgggcggcctggcta-3’。
[0117]
有益效果
[0118]
本发明的目的在于克服现有小麦基因组巨大，较水稻、玉米相比传统图位克隆困难等问题，利用全国收集来的160份小麦自然群体材料，从小麦中分离克隆一个位于第1染色体上与抗旱耐热相关的基因，申请人将该基因命名为taglyi7基因，并发现在不同自然群体间明显存在有2种类型的单倍型。同时，含有不同单倍型的不同品种间，逆境胁迫下存在有显著的存活率差异。因此，存在有利用该基因通过回交转育增强现有主栽品种小麦的抗逆性的可能，从而达到增加小麦在高温干旱地区产量的目的目的。另外，该家族基因在目前主栽作物中还未见有相关报道，因此本发明克隆taglyi7基因弥补了该方面的不足。通过克隆taglyi7基因，构建超表达载体以及设计特异靶点进行基因敲除株系的载体的构建，首次成功获得taglyi7基因的超表达小麦以及3个部分同源基因的基因敲除小麦株系。通过人工气候箱和大田条件2种环境的互相印证，明确了该基因在旱/热2种环境下的不同单倍型的基因功能，成功从小麦自然群体中挖掘到了小麦抗旱耐热的主效qtl基因，为提高小麦抗逆性奠定了分子基础。
[0119]
控制小麦耐热性和抗旱性的基因taglyi7，它来自普通六倍体小麦，在中国春参考
基因组中长度为651bp,相应含有glyoxalase乙二醛酶i结构域的217个氨基酸，比对分析发现该基因含有3个外显子和2个内含子。且发现了与小麦耐热性和抗旱性相关的indel分子标记，所述indel分子标记是序列为序列1第607位-617位的核酸分子。
[0120]
本技术通过对160份小麦进行基因组测序，发现小麦中indel分子标记，所述indel为ggcggcgagga。所述indel的基因型可为基因型hap1或基因型hap2。所述基因型hap1是序列表中seq id no.2的606位-607位之间存在ggcggcgagga序列插入的纯合型。所述基因型hap2是序列表中seq id no.1的606位-607位之间不存在插入的纯合型。基因型为hap1的小麦的干旱、高温胁迫抗性高于或候选高于基因型为hap2的小麦。
[0121]
进一步，本发明构建了过表达taglyi7基因的载体：重组载体pwmb110-taglyi7-hap1和taglyi7基因敲除载体：重组载体pbue411-taglyi7。通过农杆菌eha105转入野生型小麦fielder品种中。获得oe-1、oe-3、ko-2和ko-5。通过干旱、高温胁迫实验发现，与野生型相比，taglyi7基因过表达的oe-1和oe-3株系的干旱、高温胁抗性明显提升；而taglyi7基因敲除的ko-2和ko-5干旱、高温胁抗性明显降低。
[0122]
综上所述：小麦转基因实验分析表明该基因的能明显提高小麦耐热性和抗旱性，且该家族基因在目前主流作物逆境研究中未有相关报道。因此挖掘该基因资源可以为小麦抗逆育种提供重要分子依据。本发明的taglyi7基因来自小麦，且在全国范围收集来的自然群体间存在有单倍型差异，小麦转基因实验分析表明该基因存在有单倍型差异，因此可以尝试通过回交转育的方法向具有热敏感或旱敏感单倍型的品种中，导入优异单倍型taglyi7基因。本发明的taglyi7基因，通过crispr技术获得该基因三个部分同源基因的三拷贝突变体，表型鉴定表明，与受体野生型fielder相比，突变体的耐热性和抗旱性均明显降低。进一步说明该基因与小麦抗逆有密切关心，具有利用基因编辑，改善作物农艺性状的操作价值。本发明公开了小麦干旱、高温胁迫相关蛋白taglyi7及其生物材料、分子标记和应用。本发明要解决的技术问题是如何调控小麦干旱、高温胁迫抗性。
附图说明
[0123]
图1为依据从全国收集来的160份小麦自然群体苗期热胁迫处理得到的数据通过线性回归模型(lr)进行gwas分析得到的(左图)manhattan和(右图)quantile-quantile图。
[0124]
图2为依据从全国收集来的160份小麦自然群体苗期旱处理得到的数据通过线性回归模型(lr)进行gwas分析得到的(左图)manhattan和(右图)quantile-quantile图。
[0125]
图3为taglyi7基因不同单倍型自然群体分子标记结果图。
[0126]
图4为taglyi7基因不同单倍型自然群体存活率统计分析结果。
[0127]
图5为taglyi7基因在小麦热胁迫和旱胁迫下的表达模式分析，ck对照，hs代表热胁迫，d代表旱胁迫，hs2h、hs4h、hs6h、hs8h、hs12h分别代表热胁迫2小时、4小时、6小时、8小时和12小时；d2h、d4h、d6h、d8h、d12h分别代表旱胁迫2小时、4小时、6小时、8小时和12小时。
[0128]
图6为本发明中用到的小麦超表达载体pwmb110的载体图。
[0129]
图7为本发明中用到的小麦基因敲除载体pbue411的载体图。
[0130]
图8为taglyi7转基因小麦株系热胁迫下表型鉴定图，beforeheatstress为热胁迫前，afterheatstress为热胁迫前，afterrecovery2为恢复2天后。
[0131]
图9为taglyi7转基因小麦株系热胁迫后叶绿素含量(左图)和胁迫前后鲜重比(右
图)，wtck、oe-1ck、oe-3ck、ko-2ck和ko-5ck为对照组，wths、oe-1hs、oe-3hs、ko-2hs和ko-5hs为热胁迫组。
[0132]
图10为taglyi7基因敲除株系编辑结果。
[0133]
图11小麦taglyi7过表达株系表达量检测。
具体实施方式
[0134]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0135]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0136]
下述实施例采用spss11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用one-wayanova检验，p＜0.05(*)表示具有显著性差异，p＜0.01(**)表示具有极显著性差异，p＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
[0137]
实施例1、小麦苗期旱胁迫全基因关联分析
[0138]
2016-2017年，本实验在中国农业大学西校区的2个恒温光照温室，对全国收集来的160份小麦材料，进行了3次生物学重复的小麦苗期抗旱表型鉴定，收集统计存活率、胁迫前后干鲜重等指标。通过温度湿度计记录每天温度，湿度等数据，两个温室温度保持在22-24℃之间。具体方案如下：
[0139]
处理前培养：将大小一致吸胀露白的上述160份品种的小麦种子统一播种于长9cm、宽7.5cm、高10cm的黑色钵中，每24个小钵下方放置一个大的托盘，小麦种植使用的栽培土由营养花卉土和蛭石(3:1)组成，使用前充分搅拌混匀，每钵加入同等重量栽培土，土重300g/钵，每钵种9粒小麦种子/品种，每钵材料充分吸水后，倒掉盘中多余水分，盖膜保证发芽率。出苗后，检查出面率，人工间苗至剩余6颗幼苗，保证出苗整齐一致，每品种材料种植4个重复。
[0140]
胁迫处理：充分吸水后将不再浇水，同时倒掉下方托盘中多余水分，为避免小气候对结果准确性的影响，每天定期随机挪动不同托盘的位置，每钵土壤含水量降到4％时复水(当观察到土壤表面明显干裂后，每隔2天检测抽查每钵中土壤相对含水量，测定仪选用杭州尽享科技有限公司生产的土壤水分测定仪：货号dl-tws221)，复水五天后统计每钵材料存活率和地上部恢复情况，记录胁迫组和对照组相关表型数据。
[0141]
全基因组关联分析采用tassel软件的混合线性模型(mixedlinermodel，mlm)，为避免群体结构和亲缘关系的影响，前5个主成分(principalcomponents，pc)和亲缘关系用于协方差。关联分析中的显著性阈值设为p＝0.001，并且在3个及以上环境下检测到的snp确认为与目标性状显著关联的snp。提取上述160份材料的基因组，通过90k芯片数据关联旱胁迫表型数据关联分析，结果通过tassel软件绘制曼哈顿图(manhattanplot)和qq图。最后结合所得的曼哈顿图和qq图，最终在1a染色体上关联到一个候选区间，具体结果如图2和表1所示。
[0142]
实施例2、小麦苗期热胁迫全基因关联分析
[0143]
本实验于2019-2020年开展于中国农业大学神内温室中，对照组种植于光照恒温温室中，热胁迫组种植在2个大型光照恒温培养箱中，选择与例1相同的160份小麦材料进行胁迫培养，
[0144]
处理前培养：材料处理前培养方法同实施例1。
[0145]
胁迫处理：将正常生长7天的幼苗统一在光照恒温培养箱(40℃-38℃、48h)进行苗期热胁迫处理，选择当其中1/3材料地上部已经完全萎蔫死亡时作为临界点，恢复室温，处理后在正常条件下(24℃)恢复2-5天，记录胁迫组和对照组相关表型数据及存活情况。
[0146]
提取上述160份材料的基因组，通过90k芯片数据关联热胁迫表型数据关联分析，结果通过tassel软件绘制曼哈顿图(manhattanplot)和qq图。结合所得的曼哈顿图和qq图，最终在1a染色体上关联到一个与旱胁迫结果相同的候选区间，具体结果如图1和表1所示。
[0147]
实施例3、自然群体间taglyi7不同单倍型分子标记检测
[0148]
为了进一步确定干旱胁迫和热胁迫所关联的区段在自然群体中的情况，我们筛选出可用的引物放入ensembleplant网站(http://plants.ensembl.org/index.html)与小麦参考基因组进行序列比对，设计出特异扩增taglyi7基因a拷贝的引物af1/ar1，将实施例1和例2中相同的160份小麦基因组dna加ddh2o溶解作为模板利用高保真酶(诺唯赞公司，货号：p525-01)pcr扩增，随后用af2/ar2二次扩增长度约82bp的taglyi7部分含有单倍型差异序列的片段，在3.5％的琼脂糖胶(220v)上跑25min，即可肉眼明显鉴定出taglyi7基因的单倍型类型如图3，同时送擎科生物公司测序后发现hap1类型taglyi7基因在indel分子标记中含有ggcggcgagga这11bp碱基序列插入。该maker所区分开的2种标记与小麦不同品种抗逆性有着显著关联性，如图4。对160份小麦材料的pcr扩增片段进行测序，结果表明与表1中的结果一致，证明上述引物能够区分taglyi7基因的单倍型hap1(hapa)单倍型和hap2(hapb)单倍型。
[0149]
taglyi7基因的单倍型hap1基因组序列如序列5所示，具体如下：
[0150]
aaggaattcatagtcactcacgagcatcccagggaatccatactcacgcgtgagcatcctacataatctaatagctcaatttctttagaatacctccaaagtaatgccatcaagcaaatgatttcgagaacaagccacactcacaacaacttctcccaaactgttcctaagacatcaccgatagctctggtatcgtcctcatggatggatgcatcagtgttaaccttataacagccccggctcaactttgaccatccaacttcctgagggtggttgttgtgcatcactgaatcatagtttgcggtcagggcatgagtcccaaatgttgtctggggtggtgtcgcccttggctcgcccttcacaaattcccactgttgccaccacacaaaccaacaagctagaatgatagactcttgcatgccaagcattccgagaactggggagctctgattcggattacataaaatgcccaccagcagaacaaaaccaaaacaatcaaaatgacaagtgcctattcaataacttcatctagccccatctccttccatacttagttcttcaaacaccttgcctgtcatctctcctggtctgagacccaaagtggtgatcccactccgtatagtatgcaagtcgtaccgaaaagtgcctcaacttggttttgtgccacgcaacaaaatcctctgttaagtgagcactcaaggggatcataagaactctctccacgtcaattggtaaaaatatctccctggtaagtttttcatcccaaagagaccagagtctgggttgattaattcctcaaccgtacacaagataacatgccccttcaaagcatgaatcttccttgtattattatttaggatccaatgatcttcccaaatctttatcgtttgattcgaccccactctccaagtatgaccacgcctgaaagtttgcaaactaggaacaatacttcgccaagtatatgaaaagccttttttgatccatcacttaacatgctatcatcaaggaagtatttaactctcaacacttaggcacagagggaatcaggactggttagcaccctccaagtttgctttgacaacatggtgagattaaaataatacaaatctcgaaagcctatacctccctttttttggaatacacatcctccaccatgcgcgctagtgtatccttttctgatcctccgtatcaacccgccagaaagtaga
cattgcatcattaatttcttcaaagagtttcttgcggagctttaaaatagccatgtcaaaaaacagggatatattggataactgccctccataatatttgaactatcatttttcagaagatgggtaatactatcactcctatctagttacatcatggttagggaccaaggtatttatctgagatagattcggtcataatattcagctcgatttgggcttttaaatcaacatttatgtttggactaaaatataaattgtatttatctttgcttaccaactagcccgaatttgtacaatattcatctagcacttgtttgaacaaggttgcagtaatcaaatcagccttcataagtattagggaattatcaacaatgtttctttttccagctttcgttttcttcacgtggagaaaagatttaggtgccattgtcctttatatctttggcaaattctagtgtttgttattctttttcaactttgatggtcgtttgtgatggtgtgtgaagtagcgtgtaagtatactgtctgcttctcttcatcagttctagattttttaaaatatgtatgatagattcctttaatggaagctgcgaggaaccttcccataaccaaaaatgtgtttaaatgtcgtctctgagccaaaaacttaggcatgagacgctgaagccagaatggacgtcctcggaggatgagacgaacacgaacggtctagatgaggatgacgtggagccacgtgtcagcagtgtctgctcccgcgcagctatataaaggagcacaactccagctcaccctccgcatctttcattcgtgtctgaagcagcagccattgcccattgccgagagtggagtggtagagcagttcgagtttgcttttctctcttgcttgattgatcggtgcctcgatccatcgttcgtcggcggtgcatatagttagcgaggaattctcgggccggccaccggcgacgacgaccgcgagtgatccgtgaggatggtgaacacgacggcggctatggtgagcggcggcgtgctgccgctggcgtccctgaaccacatcagcatagtgtgcaggtcggtggaggagtcgctcgacttctacatgaacgtcctcgggttcacccccatccgccgccccggctccttcgacttcgacggcgcatggtaatcataccggaccagctcaatacgtaggagcgtcagtgttaattgcactgctctgaatctctgataatgcttttcttgttgctgcgagtgaaggctgttcaactacgggatcggcatccacctgctgcagtcggagcatccagagagcttaccggcgaagaaggagatcaaccccaaggataaccacatctccttccaggtacgttgtggtagttaatttcgatttggttgcgaacagctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctcaaaaggagtattagggtgtgacgaaagcgacgtcggcgtcctgtcgccggcgacggcccgcatgtgttccgcgagtaacagtgccgttatgtgcgatcgatggccgacaacgacgggtcgggctgatgtgcacacgtacgtgcacggcgcataagtcttccatttcgcgcgttggttccttgttccgtcgtagatgcacgatggataccaggtcaagtcaccactcaccacacagaaactgaagttggatgctgagtcagaatgtctcactagctgagatcaattttcgtttatcaaatacagtataagaaaagcttctgagactaatgaaggcgcaaaattgttgtgttttgtgtgcagtgcgagagcatggtggcggtggagcggcggctcaaggagctgggcatcccgtacatccagcggtgcgtggaggagggcggcatctacgtggaccagatcttcttccatgaccccgacggcttcatgatcgagatctgcaactgcgacaagctcccggtcgtcccgctcgccggccagaacttcgccatggccgcctgcaagagggtcgcctccgtcaagcaacagcagctgcccatgccagtcgcacaagtagcgcaagcaacccctgctccggcggcggccgcggcttcgcagtgcgttccggcgccgaacccggccttgcagcgcgtcggcggcgaggaggcggcgcatatctcgtgcgcgtgaggggtggggggccggggtagccaggccgcccaactggtgggtggcgcgctccgtggagttgtggtttttgtacattgtgatacgacagtgtgcgtatgaataaagcgaggggagcagagtgtagtttcagcttcaaatctgcgtctcggagcggatgagccctctgtttgctctgtttttcctccccgtccttcgaactactgtagtaggccagtatttaaccaaaaactaccacatttcacaaaaatgtgacagagtactatctctttacgattttgtgcggaaaactatcacttttgtcctaatccgtg。
[0151]
taglyi7基因的单倍型hap2基因组序列如序列6所示，具体如下：
[0152]
aaggaattcatagtcactcacgagcatcccagggaatccatactcacgcgtgagcatcctacataatctaatagctcaatttctttagaatacctccaaagtaatgccatcaagcaaatgatttcgagaacaagccacactcacaacaacttctcccaaactgttcctaagacatcaccgatagctctggtatcgtcctcatggatggatgcatcagtgttaaccttataacagccccggctcaactttgaccatccaacttcctgagggtggttgttgtgcatcactgaatcatagtttgcggtcagggcatgagtcccaaatgttgtctggggtggtgtcgcccttggctcgcccttcacaaattcccac
tgttgccaccacacaaaccaacaagctagaatgatagactcttgcatgccaagcattccgagaactggggagctctgattcggattacataaaatgcccaccagcagaacaaaaccaaaacaatcaaaatgacaagtgcctattcaataacttcatctagccccatctccttccatacttagttcttcaaacaccttgcctgtcatctctcctggtctgagacccaaagtggtgatcccactccgtatagtatgcaagtcgtaccgaaaagtgcctcaacttggttttgtgccacgcaacaaaatcctctgttaagtgagcactcaaggggatcataagaactctctccacgtcaattggtaaaaatatctccctggtaagtttttcatcccaaagagaccagagtctgggttgattaattcctcaaccgtacacaagataacatgccccttcaaagcatgaatcttccttgtattattatttaggatccaatgatcttcccaaatctttatcgtttgattcgaccccactctccaagtatgaccacgcctgaaagtttgcaaactaggaacaatacttcgccaagtatatgaaaagccttttttgatccatcacttaacatgctatcatcaaggaagtatttaactctcaacacttaggcacagagggaatcaggactggttagcaccctccaagtttgctttgacaacatggtgagattaaaataatacaaatctcgaaagcctatacctccctttttttggaatacacatcctccaccatgcgcgctagtgtatccttttctgatcctccgtatcaacccgccagaaagtagacattgcatcattaatttcttcaaagagtttcttgcggagctttaaaatagccatgtcaaaaaacagggatatattggataactgccctccataatatttgaactatcatttttcagaagatgggtaatactatcactcctatctagttacatcatggttagggaccaaggtatttatctgagatagattcggtcataatattcagctcgatttgggcttttaaatcaacatttatgtttggactaaaatataaattgtatttatctttgcttaccaactagcccgaatttgtacaatattcatctagcacttgtttgaacaaggttgcagtaatcaaatcagccttcataagtattagggaattatcaacaatgtttctttttccagctttcgttttcttcacgtggagaaaagatttaggtgccattgtcctttatatctttggcaaattctagtgtttgttattctttttcaactttgatggtcgtttgtgatggtgtgtgaagtagcgtgtaagtatactgtctgcttctcttcatcagttctagattttttaaaatatgtatgatagattcctttaatggaagctgcgaggaaccttcccataaccaaaaatgtgtttaaatgtcgtctctgagccaaaaacttaggcatgagacgctgaagccagaatggacgtcctcggaggatgagacgaacacgaacggtctagatgaggatgacgtggagccacgtgtcagcagtgtctgctcccgcgcagctatataaaggagcacaactccagctcaccctccgcatctttcattcgtgtctgaagcagcagccattgcccattgccgagagtggagtggtagagcagttcgagtttgcttttctctcttgcttgattgatcggtgcctcgatccatcgttcgtcggcggtgcatatagttagcgaggaattctcgggccggccaccggcgacgacgaccgcgagtgatccgtgaggatggtgaacacgacggcggctatggtgagcggcggcgtgctgccgctggcgtccctgaaccacatcagcatagtgtgcaggtcggtggaggagtcgctcgacttctacatgaacgtcctcgggttcacccccatccgccgccccggctccttcgacttcgacggcgcatggtaatcataccggaccagctcaatacgtaggagcgtcagtgttaattgcactgctctgaatctctgataatgcttttcttgttgctgcgagtgaaggctgttcaactacgggatcggcatccacctgctgcagtcggagcatccagagagcttaccggcgaagaaggagatcaaccccaaggataaccacatctccttccaggtacgttgtggtagttaatttcgatttggttgcgaacagctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctcaaaaggagtattagggtgtgacgaaagcgacgtcggcgtcctgtcgccggcgacggcccgcatgtgttccgcgagtaacagtgccgttatgtgcgatcgatggccgacaacgacgggtcgggctgatgtgcacacgtacgtgcacggcgcataagtcttccatttcgcgcgttggttccttgttccgtcgtagatgcacgatggataccaggtcaagtcaccactcaccacacagaaactgaagttggatgctgagtcagaatgtctcactagctgagatcaattttcgtttatcaaatacagtataagaaaagcttctgagactaatgaaggcgcaaaattgttgtgttttgtgtgcagtgcgagagcatggtggcggtggagcggcggctcaaggagctgggcatcccgtacatccagcggtgcgtggaggagggcggcatctacgtggaccagatcttcttccatgaccccgacggcttcatgatcgagatctgcaactgcgacaagctcccggtcgtcccgctcgccggccagaacttcgccatggccgcctgcaagagggtcgcctccgtcaagcaacagcagctgcccatgccagtcgcacaagtagcgcaagcaacccctgctccggcggcggccgcggcttcgcagtgcgttccgg
cgccgaacccggccttgcagcgcgtcggcggcgcatatctcgtgcgcgtgaggggtggggggccggggtagccaggccgcccaactggtgggtggcgcgctccgtggagttgtggtttttgtacattgtgatacgacagtgtgcgtatgaataaagcgaggggagcagagtgtagtttcagcttcaaatctgcgtctcggagcggatgagccctctgtttgctctgtttttcctccccgtccttcgaactactgtagtaggccagtatttaaccaaaaactaccacatttcacaaaaatgtgacagagtactatctctttacgattttgtgcggaaaactatcacttttgtcctaatccgtg。
[0153]
单倍型hap1是基因型hap1的单倍型，所述基因型hap1是存在所述indel分子标记的纯合型，单倍型hap2是基因型hap2的单倍型。所述基因型hap2是不存在所述indel分子标记的纯合型。所述indel分子标记是核苷酸序列为序列1的第607位-617位。序列1第607位-617位的核酸分子的序列为ggcggcgagga。
[0154]
引物具体如下：
[0155]
af1:5
’‑
gctgcagtcggagcatcca-3’；
[0156]
ar1:5
’‑
cagtagttcgaaggacgggg-3’；
[0157]
af2:5
’‑
acccggccttgcagcgcgt-3’；
[0158]
ar2:5
’‑
ccagttgggcggcctggcta-3’；
[0159]
结果显示，在小麦中不同品中，indel分子标记位点形成两种特异性序列，存在所述indel分子标记的基因组具有序列表中seq id no.5的第3362位-3473位的特异核酸分子。不存在所述indel分子标记的基因组具有序列表中seq id no.6的第3362位-3473位的特异核酸分子。
[0160]
表1.160份小麦品种旱胁迫/热胁迫后存活率、来源以及taglyi7单倍型类型
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0165][0166][0167]
实施例4、taglyi7基因在旱胁迫和热胁迫下的表达量检测
[0168]
挑选小麦fielder品种进行上述实施例1的早旱胁迫处理，分别在旱胁迫(离体自
然烘干)和热胁迫(光照培养箱；40℃)操作后的2h、4h、6h、8h、12h，通过rt-glyi7-af1/ar1检测tagly17基因的表达量，以不进行早旱胁迫组为对照(ck)，检测之前旱热胁迫下gwas所得到的候选区间内主效基因的位置，我们结合rna-seq数据，发现区间内存在一个受胁迫诱导显著上调表达的基因taglyi7。我们用实时荧光定量pcr的方法检测taglyi7基因a拷贝的表达量。试剂采用qpcrgreen试剂盒(诺唯赞公司，货号：q111-02)，每个样品取三次技术重复取均值。反应程序：预变性95℃3min,变性95℃15s,退火62℃15s,延伸72℃20s,最后每隔0.2s读一次溶解曲线的信号，最后通过溶解曲线鉴定引物是否可用。
[0169]
所述扩增引物可包括rt-glyi7-af1/ar1和actin-af2/ar2。
[0170]
rt-glyi7-af1:5
’‑
agcttcaaatctgcgtctcg-3’；
[0171]
rt-glyi7-ar1:5
’‑
tccgcacaaaatcgtaaagaga-3’；
[0172]
rt-actin-f1:5
’‑
ggaatccatgagaccacctac-3’；
[0173]
rt-actin-r1:5
’‑
gacccagacaactcgcaac-3’；
[0174]
结果计算：实验结果计算原理采用比较阙值法，即c＝2
‑△
ct
，
△
ct＝测定基因ct值-内参基因ct值(ct值＝是单个样品内的sybr荧光信号达到阙值所用的循环数)。最终从图5，可以看出，taglyi7基因受热胁迫和旱胁迫诱导显著上调表达。
[0175]
实施例5、taglyi7超表达和crispr-cas9转基因植株的获得
[0176]
1)taglyi7超表达和crispr-cas9载体的构建
[0177]
taglyi7超表达载体的构建
[0178]
设计引物从小麦中国春和fielder品种(又称fielder小麦品种或野生型fielder品种或野生型fielder或fielder，记载于下述文献中：a n'diaye et al.2018 science 361(6403):eaar7191；kazuhiro sato et al.2021 dna research 28(3),1
–
7)苗期叶片的总rna反转录得到的cdna中扩增出taglyi7的2种单倍型cds全长，并引入bamhi酶识别位点，分别用引物f1/r1和f1/r2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物分别为hap1的cds和hap2的cds。随后用无缝连接试剂盒(博迈德公司，货号：cl116-01)的无缝连接法将所得到的taglyi7hap1和hap2的cds连接到用bamhi酶(neb公司，货号：#r0136l)切开的pwmb110载体(记载于下述文献中：crispr/cas9 editing of wheat taq genes alters spike morphogenesis and grain threshability，该文献中的名称为plasmid pwmb110，也可通过常规商业途径购买)上如图6。区别于拓扑克隆、ta克隆和t4连接等常规克隆方法，无缝克隆技术可在重组酶的作用下，只需一步反应，便可将片段克隆到任何载体中的任意位置得到重组质粒。分别获得重组载体pwmb110-taglyi7-hap1和重组载体pwmb110-taglyi7-hap2。
[0179]
所述重组载体pwmb110-taglyi7-hap1是用序列1中核苷酸第1到第642位(taglyi7-hap1的cds)替换pwmb110载体中两个限制性核酸内切酶bamhi识别位点之间的片段，使插入片段能够正确表达，保持pwmb110载体的其它核苷酸序列不变，得到重组载体pwmb110-taglyi7-hap1。
[0180]
所述重组载体pwmb110-taglyi7-hap2是用核苷酸序列是序列2的第1-651位核苷酸的dna分子(taglyi7-hap2的cds)替换pwmb110载体中两个bamhi限制性核酸内切酶识别位点之间的片段，使插入片段能够正确表达，保持pwmb110载体的其它核苷酸序列不变，得到重组载体pwmb110-taglyi7-hap2。
[0181]
pwmb110-taglyi7-hap1和pwmb110-taglyi7-hap2中启动taglyi7-hap1和taglyi7-hap2基因表达的启动子是ubi启动子(ubipromoter)。
[0182]
f1：
[0183]
r1：
[0184]
r2：
[0185]
上述引物中单下划线为bamhi酶识别位点，双下划线为pwmb110的序列。
[0186]
crispr-cas9载体的构建
[0187]
设计引物将taglyi7的靶点通过中间载体pcbc-mt1t2最终连接到载体质粒pbue411(记载于下述文献中：“histoneacetyltransferasetahag1actsasacrucialregulatorto strengthensalttoleranceofhexaploidwheat”，该文献中的名称为vectorpbue411，同时也是常规载体，可通过常规途径购买获得，本技术中的载体由中国农业大学生物学院陈其军老师馈赠)上，获得重组载体pbue411-taglyi7，具体过程同超表达载体构建(靶点设计通过e-crispr网站筛选能同时敲除taglyi7三个部分同源基因的含pam/ngg双靶点)，如图7。
[0188]
pbue411-taglyi7是将dna片段1(5
’‑
cctcgggttcacccccatccgccgtgcgttccggcgccgaacc cgg-3’)重组替换pbue411载体两个bsai酶切位点之间的片段，保持pbue411载体的其它核苷酸序列不变，得到重组载体pbue411-taglyi7。
[0189]
左靶点:ggcggatgggggtgaacccgggg；右靶点:gtgcgttccggcgccgaacccgg。
[0190]
2)农杆菌介导的小麦遗传转化
[0191]
将上述构建的重组载体pwmb110-taglyi7-hap1、重组载体pwmb110-taglyi7-hap2和重组载体pbue411-taglyi7送到中国农业大学农学院小麦研究中心转基因平台，分别通过根癌农杆菌eha105(该菌株来自cambia公司公开使用的农杆菌菌株)介导的小麦遗传转化体系，转入fielder品种的愈伤组织中并最终得到转基因植株。
[0192]
重组载体pwmb110-taglyi7-hap1通过农杆菌eha105转入fielder品种获得超表达植株10株，后经实时定量检测，发现oe-1和oe-3两个系的taglyi7基因表达量明显升高，具体如图11所示，后续实验使用oe-1和oe-3两个系；重组载体pbue411-taglyi7通过农杆菌eha105转入fielder品种获得基因敲除植株阳性苗12株，鉴定获得三敲除株系ko-2,ko-5两个系。
[0193]
3)taglyi7超表达和crispr-cas9转基因小麦的阳性鉴定
[0194]
通过将重组载体pwmb110-taglyi7-hap1和重组载体pbue411-taglyi7转入受体小麦fielder中，获得的超表达植株和基因敲除植株的t0代的阳性单株脱粒后进行温室加代，并在后续对每一代进行rt-pcr扩增阳性鉴定(检测引物为oe-f/nos-r)在t0基础上自交4次后，目前以获得ft4高代稳定转基因株系。将其命名为oe-1、oe-3、ko-2、ko-5。
[0195]
对oe-1和oe-3进行taglyi7基因表达量检测(实时定量检测)，发现oe-1和oe-3两个系的taglyi7基因表达量明显升高，具体如图11所示，后续实验使用oe-1和oe-3两个系。
[0196]
oe-f：tggctgttcaactacgggat；
[0197]
nos-r:aagaccggcaacaggattca。
[0198]
nos序列：
[0199]
gatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc。
[0200]
对ko-2和ko-5进行测序，结果表明：
[0201]
ko-2与野生型小麦fielder相比，小麦基因组中taglyi7的基因发生了突变：六条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列1的taglyi7的编码区序列均发生了如下变化：
[0202]
taglyi7的基因组基因中a拷贝的“5｀-gtcgctcgacttctacatgaacgtcctcgggtt-3｀(对应于seq id no.1的第93-125位)”突变为“5｀-gt-3｀”。该突变使序列表中序列1的第94-124位的核苷酸缺失，该核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成taglyi7蛋白功能缺失，从而将taglyi7a拷贝基因敲除；b拷贝的“5｀-gtcgctcgacttctacatgaacgtcctcgggtt-3｀(对应于seq id no.1的第93-125位)”突变为“5｀-gtcgctcgactggtt-3｀”。该突变使序列表中序列1的第104-122位的核苷酸缺失，该核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成taglyi7蛋白功能缺失，从而将taglyi7b拷贝基因敲除；d拷贝的“5｀-gtcgctcgacttctacatgaacgtcctcgggtt-3｀(对应于seq id no.1的第93-125位)”突变为“5｀-gtcgctcgacttctacatgaacgtcctcggtt-3｀”。该突变使序列表中序列1的第121位的核苷酸缺失，该核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成taglyi7d拷贝蛋白功能缺失，从而将taglyi7三个拷贝部分同源基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图10。
[0203]
ko-5与野生型小麦fielder相比，小麦基因组中taglyi7的基因发生了突变：六条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列1的taglyi7的编码区序列均发生了如下变化：
[0204]
a、b和d拷贝的“5｀-gtcgctcgacttctacatgaacgtcctcgggtt-3｀(对应于seq id no.1的第93-125位)”均突变为“5｀-gtcgctcgacttctacatgaacgtcctcggtt-3｀”。该突变使序列表中序列1的第121位的核苷酸缺失，该核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成taglyi7d拷贝蛋白功能缺失，从而将taglyi7三个拷贝部分同源基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图10。
[0205]
实施例6、taglyi7不同单倍型转基因小麦苗期热胁迫前后叶绿素含量和胁迫前后鲜重比的测定
[0206]
1)将刚刚萌动且长势基本一致的小麦材料，分成胁迫组和对照组，胁迫组种植oe-1、oe-3、ko-2、ko-5和wt(野生型小麦fielder)各9株。对照组种植oe-1、oe-3、ko-2、ko-5和wt(野生型小麦fielder)各9株。每个材料种3盆，共3个生物学重复，生长条件为22℃，光照强度200umol-2s-2,湿度60％，每天光照16h，黑暗8h。
[0207]
2)当材料出苗后第5天，取胁迫组和对照组小麦第2片叶子上完全相同部位的叶片3片，用剪刀将蒸馏水冲洗后的叶片剪成小段，混匀，每组3个重复。
[0208]
3)称取0.3g叶片，放置于50ml大离心管中并加入10ml无水乙醇，用锡箔纸把离心管完全遮挡，静置24h，期间每1h颠倒混匀。
[0209]
4)以之前提取叶绿素所用的无水乙醇作为空白对照，分别测定649，665nm处的od值，并通过如下的公式计算叶绿素含量。od值法测定叶绿素含量的参考公式：ca(mg/l)＝13.95
×
od655-6.8
×
od649；cb(mg/l)＝24.96
×
od649-7.32
×
od655；ca、cb分别为叶绿素a和叶绿素b的浓度；叶绿素含量(mg/g)＝c
×
v/w
×
1000，最终结果如图9(左图)，由结果可知
超表达taglyi7可以显著增加胁迫条件下叶绿素含量，而该基因敲除株系则使植物萎蔫速度加快。
[0210]
称取胁迫前后，各转基因株系各10株小麦地上部样品为1个重复，各测定10个重复。最终结果如图9(右图)，从结果可知，胁迫后超表达taglyi7株系地上部生物量显著大于野生型小麦fielder，而基因敲除株系则正好相反。
[0211]
实施例7、taglyi7不同单倍型转基因小麦苗期热胁迫表型鉴定
[0212]
上述转基因植株自交，获得获得的f4代高代稳定转基因株系种子(由中国农业大学小麦研究中心转基因平台提供)。选取t4代转基因纯系种子(上述oe-1、oe-3、ok-2、ko-5)及野生型fielder种子，温室萌发，挑选萌发正常且长势一致的种子移栽到土中，分成胁迫组和对照组，胁迫组和对照组均种植oe-1、oe-3、ko-2、ko-5的t4代转基因植株和wt(野生型小麦fielder)，每组中每种t4代转基因植株种植3个小盆重复，每个小盆种6粒种子。生长条件为22℃，光照强度200umol-2s-2,湿度60％，每天光照16h，黑暗8h。
[0213]
植株生长一周后，将胁迫组转移到光照培养箱进行40℃热胁迫处理1d(24h)，光照周期与对照组保持一致，统计胁迫前后叶绿素含量和鲜重比；然后将胁迫后材料转移到光照培养箱22℃，每天光照16h，黑暗8h，恢复后拍照记录表型。
[0214]
结果如图8显示，正常条件下，和wt(野生型小麦fielder)与oe-1的t4代转基因植株和oe-3的t4代转基因植株以及wt(野生型小麦fielder)与ko-2的t4代转基因植株和ko-5的t4代转基因植株间长势无显著差异，热胁迫后受体材料和转基因材料生长均明显受到抑制。然而相比于受体fielder，超表达taglyi7-hap1的转基因植株(oe-1的t4代转基因植株和oe-3的t4代转基因植株)可以明显降低胁迫后萎蔫程度，生物量明显增加，而将taglyi7三个拷贝敲除后的植株(ko-2的t4代转基因植株和ko-5的t4代转基因植株)热胁迫表型则正好相反，具体结果如图8。
[0215]
小麦籽粒灌浆期常常受到干热风的影响，而直接在田间大规模鉴定不同品种耐热性误差较大，同时耗费大量人力物力。本研究通过直接在温室和人工气候箱鉴定苗期小麦耐热性和抗旱性表型，结合全基因组关联分析的芯片数据，首次从小麦基因组中挖掘到taglyi7基因，并针对该基因设计分子标记。通过转基因热胁迫表型鉴定，结合例6中对胁迫前后叶绿素含量和鲜重比的结果，进一步说明我们发现该专利所述的检测小麦旱热胁迫抗性的单倍型标记存在巨大的利用实际育种价值。
[0216]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下述任一种的应用：a1)调控植物干旱胁迫、高温胁迫抗性中的应用；a2)调控植物干旱胁迫、高温胁迫抗性中的应用和/或制备调控植物干旱胁迫、高温胁迫抗性产品中的应用；所述蛋白质为如下任一种：b1)氨基酸序列是序列3或4所示的蛋白质；b2)将b1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与所述蛋白质具有相同功能的蛋白质；b3)将b1)或b2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白来源于小麦。3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：d1)抑制或降低或下调权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；d2)表达d1)所述核酸分子的编码基因；d3)含有d2)所述基因的表达盒；d4)含有d2)所述基因的重组载体、或含有d3)所述表达盒的重组载体；d5)含有d2)所述基因的重组微生物、或含有d3)所述表达盒的重组微生物、或含有d4)所述重组载体的重组微生物；d6)含有d2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有d3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有d4)所述重组载体的转基因植物细胞系；d7)含有d2)所述基因的转基因植物组织、或含有d3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有d4)所述重组载体的转基因植物组织；d8)含有d2)所述基因的转基因植物器官、或含有d3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有d4)所述重组载体的转基因植物器官；d9)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；d10)含有d9)所述核酸分子的表达盒；d11)含有d9)所述核酸分子的重组载体、或含有d10)所述表达盒的重组载体；d12)含有d9)所述核酸分子的重组微生物、或含有d10)所述表达盒的重组微生物、或含有d11)所述重组载体的重组微生物；d13)含有d9)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有d10)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有d11)所述重组载体的转基因植物细胞系；d14)含有d9)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有d10)所述表达盒的转基因植物组织、或含有d11)所述重组载体的转基因植物组织；d15)含有d9)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有d10)所述表达盒的转基因植物器官、或含有d11)所述重组载体的转基因植物器官。4.一种培育低干旱胁迫、高温胁迫抗性植物的方法，其特征在于，所述方法包括下调或减弱或降低目的植物中权利要求要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到低干旱胁迫、高温胁迫抗性植物，所述低干旱胁迫、高温胁迫
抗性植物的干旱胁迫、高温胁迫抗性低于所述目的植物。5.一种培育高干旱胁迫、高温胁迫抗性植物的方法，其特征在于，所述方法包括上调或增强或提高目的植物中权利要求要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到高干旱胁迫、高温胁迫抗性植物，所述高干旱胁迫、高温胁迫抗性的干旱、高温抗性高于所述目的植物。6.如权利要求4或5所述的方法在小麦育种中的应用。7.如权利要求1-3、6任一所述的应用、权利要求4-5所述的方法，其特征在于，所述植物为如下任一种：j1)单子叶植物；j2)禾本科植物；j3)小麦属植物；j4)小麦。8.indel分子标记或检测所述indel分子标记或所述indel分子标记基因型的物质的下述任一种的应用，所述indel分子标记是序列为序列1第607位-617位的核酸分子：a1)在预测小麦干旱胁迫抗性中的应用；a2在制备预测小麦干旱胁迫抗性产品中的应用；a3)在预测小麦干高温迫抗性中的应用；a4)在制备预测小麦干高温迫抗性产品中的应用。9.鉴定或辅助鉴定小麦干旱胁迫、高温胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法包括检测待测小麦中权利要求8中所述indel分子标记基因型，根据待测小麦的所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦干旱胁迫、高温胁迫抗性：所述indel分子标记基因型为基因型hap1的小麦干旱胁迫、高温胁迫抗性高于或候选高于所述基因型为基因型hap2的小麦，所述基因型hap1是存在所述indel分子标记的纯合型，所述基因型hap2是不存在所述indel分子标记的纯合型。10.权利要求8所述应用、权利要求9所述方法，其特征在于，所述indel分子标记，或所述检测indel分子标记基因型的物质，为如下d1)、d2)、d3)或d4)：d1)含有特异性扩增所述indel分子标记的体外核酸扩增引物；d2)含有d1)所述体外核酸扩增引物的体外核酸扩增试剂；d3)含有d1)所述体外核酸扩增引物或d2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；d4)含有d1)所述体外核酸扩增引物、d2)所述体外核酸扩增试剂或d3)所述试剂盒的检测仪器。

技术总结
本发明公开了小麦干旱、高温胁迫相关蛋白TaGLYI7及其生物材料和应用。本发明要解决的技术问题是如何调控小麦高温胁迫和/或干旱胁迫抗性。具体公开了序列3或4所述蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下述任一种的应用：A1)调控植物高温胁迫和/或干旱胁迫抗性中的应用；A2)调控植物高温胁迫和/或干旱胁迫抗性中的应用和/或制备调控植物高温胁迫和/或干旱胁迫抗性产品中的应用。并且公开了在小麦中的相关分子标记，通过此分子标记能够对小麦的高温胁迫和/或干旱胁迫抗性进行鉴定或辅助鉴定。鉴定。鉴定。


技术研发人员：胡兆荣 林靖辰 孙其信 倪中福 辛明明 郭伟龙 姚颖垠 彭惠茹 解超杰
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/9/23